Name: A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda a quantificar parâmetros sinápticos na junção neuromuscular usando microscopia confocal de fluorescência. Este método padronizado permite avaliar alterações estruturais em modelos de doenças neuromusculares.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Health and Medical Research Council [570930]. A imagem foi realizada no Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Ex-membros do laboratório, cujo trabalho é citado, são agradecidos por suas contribuições para o desenvolvimento desses métodos.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
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<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
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<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
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<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Os protocolos descritos aqui nos permitiram medir de forma confiável e quantificar mudanças nas propriedades do NMJ através de uma série de condições, incluindo estados normais de envelhecimento e doenças. Os métodos descritos para en enfrentar imagens JNM vai permitir aos pesquisadores comparar a área de especializações pré e pós-sinápticos e da área de sináptica sobreposição / alinhamento. Para comparar a intensidade relativa de proteínas pré e pós-sinápticos O segundo protocolo, que usa cortes ópticos transversais, é...

A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse relé crítico que medeia a comunicação entre o sistema nervoso e no músculo esquelético. Ela é necessária para todo o movimento voluntário. A microscopia de fluorescência tem sido utilizada para estudar os efeitos de transgenes no rato JNM 1-3 ou para comparar os efeitos da idade, dieta, exercício e doença agravada por NMJs roedor 4-11. Tais estudos têm nos ensinado muito sobre a fisiologia e fisiopatologia da JNM, mas os diversos parâmetros relatados (por exemplo, a área AChR, área de placa motora, comprimento perímetro, os índices de fragmentação), muitas vezes tornam difícil comparar os resultados desses estudos. Existe a expectativa de aumentar para os investigadores pré-clínicos para ser capaz de demonstrar a reprodutibilidade, particularmente em estudos com modelos de roedores de doença 12. Os protocolos descritos aqui foram refinados através de uma série de estudos que investigaram ch desenvolvimento, fisiológico e fisiopatológicoanges ao JNM. Tais estudos exigem medição da área de especializações sinápticas na placa motora do mouse, a densidade relativa de embalagem de proteínas sinápticas dentro especializações pós-sinápticos 13-15. A utilidade destes métodos é ilustrada por estudos recentes em um modelo de rato anti-almíscares miastenia gravis. Injeções diárias de IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis pacientes em camundongos adultos fez com que eles se tornam fracos dentro de 2 semanas 16. Imagens de projecção máxima das secções confocais musculares que foram duplamente marcadas para a sinaptofisina (a-terminais nervosas) e pós-sinápticos AChRs revelou um declínio progressivo na área de coloração AChR como a principal alteração. É importante salientar a taxa de declínio foi suficiente para explicar declínios comparáveis ​​na amplitude dos potenciais sinápticos, falha da transmissão sináptica e fraqueza muscular 17,18. Qualitativamente achados semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa10,19. Os mesmos métodos de medição JNM já foram utilizadas para avaliar o impacto de três fármacos para o tratamento anti-almíscares miastenia gravis neste modelo de ratinho 20,21. Envelhecimento sedentário pode levar à perda de conexões neuromusculares. Os protocolos descritos aqui revelaram um declínio associado à idade na área do terminal nervoso synaptophysin em placas motoras como ratos progredir na velhice. Os mesmos métodos revelou que o exercício voluntário poderia, em grande parte impedir a redução da área terminal do nervo pré-sináptico 22, de acordo com o trabalho anterior por outros grupos de quatro. Perda de conexões neuromusculares também ocorre no modelo de rato SOD1G93A esclerose lateral amiotrófica 9,23. Os estudos citados demonstram que uma variedade de condições de saúde pode levar a reduções na área de uma das especializações pré ou pós-sinápticos no NMJ. Isso pode resultar em diversão sináptica prejudicadacção ou podem anunciar perda completa da ligação neuromuscular. Três protocolos estão descritos que permitem a quantificação da área e densidade de especializações sinápticos. O objectivo do primeiro protocolo é o de proporcionar uma medida prática e reprodutível das áreas de pré- e pós-sinápticos especializações e o seu alinhamento em NMJs de mamífero, utilizando microscopia de fluorescência. Bidimensionais imagens máximos projeção confocal e análise de imagem com NIH ImageJ é usado para detectar mudanças na área de coloração synaptophysin (vesículas sinápticas), AChRs pós-sinápticos e área de sobreposição sináptica. Parâmetros confocal de imagem (ganho e nível de deslocamento) são optimizados para cada NMJ de modo a maximizar a informação visual usado para discernir a área de especialização sináptica. Falha neuromuscular também pode resultar de alterações na densidade do RACh pós-sináptico e / ou outras proteínas sinápticas. O segundo protocolo pode ser aplicado para detectar alterações na densidade relativa de proteínas pós-sinápticos taiscomo almíscares, rapsyn, distroglicana, fosforilado Src quinase e fosforilado AChR 18,21. Em pacientes com miastenia gravis, uma densidade reduzida de AChR dentro da membrana pós-sináptica é a causa imediata da falha sináptica e fraqueza muscular. O terceiro protocolo descreve um método de transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para avaliar mudanças na proximidade do AChRs adjacentes dentro das membranas pós-sinápticos 14,15. Este método detecta transferência de energia entre AChRs vizinhos marcados com fluorescência-α-bungarotoxina (BGT). FRET ocorre apenas quando os doadores e aceitadores de sondas fluorescentes estão a menos de 10 nm de intervalo. Isso pode revelar alterações submicroscópicas () no aperto de embalagem AChR que podem se relacionam diretamente com a amplitude dos potenciais sinápticos. Estes três protocolos, refinados ao longo da última década, fornecer medidas complementares a integridade NMJ de uma forma consistente e reproduzível. A utilização de protocolos padronizados dend parâmetros deve facilitar a comparação dos efeitos dos genes e intervenções ambientais sobre a JNM mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Microscópio confocal de varredura</td><td>Leica</td><td>DM 2000 com&nbsp; Sistema TCS SP2</td><td>A maioria dos microscópios confocais de varredura deve ser adequada.&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxina (vermelho-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>Usado para rotular AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alfa;-bungarotoxina (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Fluorescência vermelha distante: quase invisível através da ocular&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-sinaptofisina de coelho</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td><td>Diferentes lotes de anticorpos primários diferem na diluição de trabalho</td></tr><tr><td>eficaz FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Anticorpo monoclonal conjugado a FITC</td></tr><tr><td>FITC-burro anti-coelho IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>Os anticorpos secundários policlonais podem variar em qualidade de acordo com a fonte e o lote</td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Matriz de incorporação de criostato para congelamento de músculos</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Meio de montagem que retarda o fotobranqueamento de fluoróforos</td></tr></tbody></table>

a junção neuromuscular: synapse medir o tamanho, mudanças de fragmentação e em synaptic density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A junção neuromuscular (JNM) é o grande, sinapse relé colinérgicos através do qual os neurônios motores mamíferos controlar a contração muscular voluntária. As mudanças estruturais na JNM pode resultar em falha da neurotransmissão, resultando em fraqueza, atrofia e até mesmo a morte da fibra muscular. Muitos estudos têm investigado como modificações genéticas ou doença pode alterar a estrutura do JNM rato. Infelizmente, pode ser difícil comparar os resultados directamente a partir destes estudos, uma vez que eles frequentemente utilizados diferentes parâmetros e métodos analíticos. Três protocolos estão descritos aqui. O primeiro utiliza projecção de intensidade máxima imagens confocais para medir a área de receptor de acetilcolina (AChR) da membrana pós-sinápticos domínios ricos em na placa terminal e a área de coloração das vesículas sinápticas no terminal do nervo pré-sináptico sobrejacente. O segundo protocolo compara as intensidades relativas de imunocoloração para proteínas sinápticas na membrana pós-sináptica. O terceiro protocol usa Transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para detectar alterações na embalagem de AChRs pós-sinápticos na placa motora. Os protocolos foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo de uma série de estudos. Fatores que influenciam a qualidade e consistência dos resultados são discutidos e dados normativos são fornecidos para NMJs em ratos adultos jovens e saudáveis.

Medição do Synaptic Area no NMJ Qualquer estimativa de área depende do desenho de um limite para definir a extensão de especializações sinápticas. Em músculos adultos jovens saudáveis ​​imagens JNM deve exibir limites bem definidos para ambos AChR e coloração sinaptofisina (Figura 2A e B). A intensidade da fluorescência para ambos AChR e sinaptofisina aumenta acentuadamente no limite entre a parte de peri-sináptica e sináptica da placa motor...

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar objetivamente os parâmetros sinápticos, incluindo o tamanho da sinapse, a fragmentação e a densidade relativa das proteínas na membrana pós-sináptica. Isso é feito dissecando primeiro o músculo de interesse dos animais experimentais. Em seguida, o músculo dissecado é seccionado criograficamente e os cortes são imunocorados para microscopia de fluorescência.Em seguida, no phos, as imagens das junções neuromusculares dos diferentes grupos de tratamento são amostradas objetivamente e a intensidade relativa da coloração para especializações sinápticas é quantificada. Em última análise, medidas quantitativas reprodutíveis dos efeitos de um tratamento ou modificação genética na organização estrutural da junção neuromuscular são obtidas por microscopia confocal. Bem, este método fornece protocolos objetivos padronizados usando microscopia confocal para avaliar mudanças na estrutura da junção neuromuscular em modelos de camundongos de distúrbios como miastenia gravis e doença do neurônio motor.Geralmente, as pessoas que tentam esse método podem achar difícil porque a amostragem de NPLS no microscópio confocal de maneira imparcial e objetiva

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Fonte: Marinello, M., et al. Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia confocal e super-resolução combinada. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a preparação, imunocoloração e imagem de junções neuromusculares no tecido muscular de ratos usando microscopia confocal e de super-resolução para visualizar e analisar estruturas pré-sinápticas e pós-sinápticas.

Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia combinada confocal e super-resolução

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Aprenda a quantificar parâmetros sinápticos na junção neuromuscular usando microscopia confocal de fluorescência. Este método padronizado permite avaliar alterações estruturais em modelos de doenças neuromusculares.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal (Vídeo) | JoVE Journal

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

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