A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

O objetivo geral deste procedimento é quantificar objetivamente os parâmetros sinápticos, incluindo o tamanho da sinapse, a fragmentação e a densidade relativa das proteínas na membrana pós-sináptica. Isso é feito dissecando primeiro o músculo de interesse dos animais experimentais. Em seguida, o músculo dissecado é seccionado criograficamente e os cortes são imunocorados para microscopia de fluorescência.

Em seguida, no phos, as imagens das junções neuromusculares dos diferentes grupos de tratamento são amostradas objetivamente e a intensidade relativa da coloração para especializações sinápticas é quantificada. Em última análise, medidas quantitativas reprodutíveis dos efeitos de um tratamento ou modificação genética na organização estrutural da junção neuromuscular são obtidas por microscopia confocal. Bem, este método fornece protocolos objetivos padronizados usando microscopia confocal para avaliar mudanças na estrutura da junção neuromuscular em modelos de camundongos de distúrbios como miastenia gravis e doença do neurônio motor.

Geralmente, as pessoas que tentam esse método podem achar difícil porque a amostragem de NPLS no microscópio confocal de maneira imparcial e objetiva requer planejamento Após a amostragem, a análise de NPLS precisa ser conduzida de maneira consistente e reprodutível, onde a variabilidade de animal para animal entre os parâmetros nplate pode dificultar isso. Após o isolamento da crioseccionação e da coloração imunofluorescente, as junções neuromusculares de camundongos ou njs, de acordo com o protocolo de texto, cegam as lâminas rotulando cada uma com um número aleatório que permanece conhecido apenas por um segundo pesquisador até que a quantificação dos parâmetros da JNM. Coloque uma lâmina no microscópio stage e use um filtro C trit para viewsob iluminação de campo amplo.

Mova-se progressivamente pelos campos da esquerda para a direita e vice-versa até que uma placa terminal apareça no campo com o orifício confocal definido para 1,0 unidade arejada e, usando baixa potência do laser, otimize os níveis de ganho e deslocamento para TRIT C vermelho BGT na placa final a ser fotografada. Em seguida, usando o laser de 488 nanômetros, otimize a fluorescência C de ajuste, que representa a sinaptofisina, e colete uma pilha Z da placa terminal com um intervalo de 0,7 mícron entre cada fatia óptica. Salve as imagens com um nome de arquivo que inclua a data da sessão de imagem, o nome do código da lâmina e o número da placa final.

Repita o procedimento de amostragem e imagem que acabou de ser demonstrado até que 20 placas terminais sejam coletadas da lâmina ou amostra. Em seguida, repita o processo para os slides codificados restantes nas mesmas configurações confocais. Tire algumas imagens do slide de controle.

Use o freeware image J para abrir um Zack e em um canal fluorescente, prepare uma imagem de projeção máxima. Salve as projeções como arquivos TIF com o nome do arquivo, incluindo a data da sessão da imagem, o código de amostra, o número da placa final e o canal fluorescente. Agora use a imagem J para abrir a projeção Z.

Selecione o receptor de acetilcolina ou um canal de imagem CHR e selecione o tipo de imagem de oito bits para converter a imagem colorida RGB de 24 bits em uma imagem em escala de cinza de oito bits na tela com a ferramenta polígono. No canal de coloração BGT vermelho, desenhe um contorno aproximado ao redor da placa terminal de interesse, excluindo qualquer coloração que não se origine da placa terminal de interesse. Selecione o limite de ajuste da imagem para aplicar um limite mínimo de intensidade à imagem.

Ajuste o nível de limite para isolar as partes coradas de A CHR enquanto exclui o sinal de fundo circundante como sub-limiar. Em seguida, abra uma segunda janela com a imagem original de tom completo para comparação. Para confirmar as configurações de limite com o contorno do polígono ainda presente, selecione analisar, analisar partículas no menu pop-up.

Especifique o intervalo de tamanhos em número de pixels como 50 ao infinito, o que elimina a seleção de pequenos artefatos decorrentes do ruído elétrico. No multiplicador de fotos, clique em analisar partículas para gerar uma janela com uma lista de áreas discretas supra limiar e seus valores de intensidade de fluorescência numerados conforme aparecem na imagem binária. Copie esses dados em uma planilha rotulada para medir a área total da placa final.

No polígono, selecione Analisar medida, copie e cole os dados de áreas e intensidades de A CHR em uma planilha com colunas rotuladas. Mude para o canal de sinaptofisina. Prepare uma imagem de projeção máxima.

Selecione uma área de interesse e defina o limite mínimo de intensidade conforme demonstrado. Para medir a área de sobreposição, aplique as etapas a seguir. Abra o arquivo original que contém as imagens de dois canais e selecione as pilhas de imagens.

Empilhe as imagens para dividi-las em duas imagens separadas. Usando o plug-in de colocalização da imagem J, selecione a colocalização do plug-in e insira os valores de limite registrados anteriormente para o A CHR e os canais nervosos na respectiva caixa de consulta do canal. O resultado é uma imagem sobreposta em pixels brancos.

Converta a imagem de sobreposição recém-criada em um formato de escala de cinza e aplique um limite ao valor máximo, que selecionará apenas os pixels brancos correspondentes à área de sobreposição dos dois canais anteriores. Registre na planilha o valor da área resultante da colocalização, que representa a área de sobreposição em pixels, prepare uma planilha de dados. Meios de amostra calculam e plotam desvios padrão e erros padrão como histogramas ou gráficos de dispersão.

Plote e coloque as áreas A CHR como gráficos de dispersão ou histogramas de frequência para determinar se os dados são normalmente distribuídos antes do teste estatístico. Depois de preparar a coloração imunofluorescente e a imagem de seções de fibras musculares transversais conforme descrito no protocolo de texto, abra um arquivo de imagem original e, ao visualizar o canal A CHR, selecione pilhas de imagens empilhadas em imagens para dividir os canais, selecione o tipo de imagem de oito bits para converter o formato de escala de cinza de oito bits para a tela. Faça isso para ambos os canais de fluorescência.

Selecionar imagens empilha imagens para empilhar e abrir uma nova pilha a partir de duas imagens de oito bits separadas anteriormente, o que permite alternar entre os dois canais de fluorescência dentro de uma única janela com a ferramenta de polígono. Desenhe uma linha firmemente ao redor do limite da coloração A CHR, selecione analisar medida para medir a intensidade média de A CHR dentro da área fechada. Copie esse valor em uma planilha rotulada, mantendo o contorno do polígono.

Alterne para o segundo canal de fluorescência e selecione analisar medida. Isso produzirá a coloração média para a proteína de interesse dentro da área sináptica definida pela coloração A CHR. Escolha uma área longe da coloração visível da placa terminal.

Em seguida, selecione analisar medida para medir a intensidade média de fluorescência de fundo. Repita a medição para os outros canais de fluorescência e copie os valores de fundo para a planilha de valores de fluorescência. Subtraia os valores médios de fundo dos valores da placa terminal para obter as intensidades corrigidas para A CHR e a proteína de interesse em cada placa terminal.

Finalmente, divida os valores de intensidade nplate corrigidos para a proteína de interesse pela intensidade de fluorescência BGT corrigida para produzir as razões de intensidade de fluorescência conforme mostrado aqui. A intensidade de fluorescência para A CHR e sinaptofisina aumenta acentuadamente no limite entre a porção sináptica e sináptica PERS da placa motora. Para essas imagens, um limite mínimo isolará prontamente a área rica em A CHR ou rica em sinaptofisina da placa terminal.

Conforme demonstrado nesta figura em camundongos idosos e em alguns estados de doença, a coloração da placa terminal para sinaptofisina pode ser menos intensa. As bordas do cluster A CHR podem parecer borradas e pode haver níveis mais altos de sinápticos extras Os gráficos de dispersão de autofluorescência revelam uma faixa considerável na área rica em A CHR entre as placas terminais do músculo tibial anterior de qualquer camundongo individual. No entanto, a área média de A CHR com base em 15 a 20 nas imagens da placa terminal da face foi semelhante entre sete camundongos de amostra Em seções transversais, a placa terminal achr normalmente aparece como uma forma crescente, mas essa forma é frequentemente irregular, conforme ilustrado aqui.

fluorescência de fundo de baixa intensidade, como mostrada aqui no canal Sinaptofisina, geralmente revela se um remendo de coloração A CHR representa uma única placa terminal ou duas placas terminais separadas localizadas em fibras musculares adjacentes. Além disso, muitas proteínas sinápticas, como rapson, almíscar e beta distro glicano, são co-localizadas com um CHR no nplate. Ao tentar este procedimento, é importante que os experimentadores permaneçam cegos para o tratamento e os grupos de genótipos durante a amostragem e análise das imagens nplate.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar, amostrar e analisar imagens fluorescentes confocais de junções neuromusculares. Em última análise, os pesquisadores devem ser capazes de comparar de forma consistente e objetiva diferentes parâmetros estruturais do nplate entre diferentes grupos de tratamento e genótipos.