Name: Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha/near-infrared sobre o estresse oxidativo in vitro. Este método permite manipular precisamente comprimentos de onda e intensidades em células cultivadas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Neurotrauma (Austrália Ocidental). Este projeto é financiado pela Road Trauma Trust Account, mas não reflete as opiniões ou recomendações do Conselho de Segurança Rodoviária.

1. Optical Calibration: Medindo Light Output <ol><li> Para preparar o aparelho de distribuição de luz, ligar uma fonte de luz de banda larga (por exemplo, Xenon ou lâmpada de tungsténio) para uma fonte de alimentação adequada. A posição de uma lente de colimação em frente da fonte de luz para produzir um feixe colimado de luz. Passar a luz através de um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz. Dependendo da aplicação, focar o feixe colimado sobre a abertura de entrada de um guia de luz líquido, o qual proporciona uma distribuição mais flexível da luz (por exemplo., Numa incubadora). </li><li> Na outra extremidade do guia de luz líquido, posicionar uma segunda lente de colimação e, em seguida, um suporte para a interferência e filtros de densidade neutros. Verifique se esse arranjo produz um local uniformemente iluminado de luz da faixa de onda e intensidade desejada. Nota: A distância entre a extremidade do guia da luz e o plano da amostra pode necessitar de variar em funçãoa área que deve ser iluminado, mas lembrar que, como a distância entre a extremidade do guia da luz aumenta, a intensidade da luz diminui. No presente estudo, essa distância é de 14 centímetros e produz uma secção transversal da viga que ilumina uniformemente numa área bem 3x3 sobre uma placa de 96 poços. </li><li> Certifique-se de que a luz difusa entre a lâmpada e componentes ópticos associados é incapaz de alcançar o espécime. </li><li> Ligue o refrigerador de água para o filtro de calor líquido e garantir que há intercâmbio de água através do revestimento do filtro. Ligue a fonte de energia da lâmpada e aguarde pelo menos 5 min para a fonte de luz de banda larga para se estabilizar. Nota: O uso do sistema de arrefecimento a água é necessária para impedir o excesso de aquecimento do dispositivo. </li><li> Selecione um filtro de interferência de banda estreita (geralmente descrito por seu comprimento de onda centro, transmitância de pico e largura à meia altura FWHM) de largura de banda () para gerar a banda desejada de iluminação. Nota: Os filtros de interferência de banda estreita utilizados no estudo foram 442 nm, 550 nm, 671 nm e 810 nm. </li><li> Medir a luz produzida pela lâmpada no plano em que a amostra está a ser posicionado durante o tratamento. Medir a luz utilizando uma sonda calibrada irradiância (colector de co-seno) ligado a um espectroradiómetro adequado, utilizando um software proprietário de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Use filtros de densidade neutra para ajustar a intensidade de luz até a saída desejado é obtido. Nota: No presente estudo, a intensidade de luz que passou por cada filtro de interferência é ajustada para proporcionar uma saída quantal igual em cada uma das quatro bandas de ondas de tratamento. É importante verificar a calibração regularmente, como a saída da lâmpada está sujeita a alterações. Nota: Seguindo-se o conjunto do aparelho, as células estão prontas para ser iluminado a Figura 1 é uma representação do equipamento de difusão de luz utilizado no presente estudo.. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52221/52221fig1.jpg" files ftp_upload> Figura 1. Imagem do aparelho de distribuição de luz. Illustrated são a fonte de energia de luz, lâmpada de xenon com habitação, lente de colimação, filtro de água, abertura de entrada, guia de luz líquido, segunda lente collimating, porta-filtro, quadro tratamento e fosco cartão preto. Note-se que os filtros de comprimento de onda e intensidade de banda estreita não são mostrados. 2. Preparação celular <ol><li> O R / NIR-LT método de entrega descrito pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou no sistema de modelo in vitro; como tal, as descrições seguintes de cultura de células são em geral, utilizando técnicas bem estabelecidas para a cultura de feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) e células da retina mistas primárias. </li><li> Antes da semeadura de células para tratamento de luz e ensaio de estresse oxidativo, cultura células imortalizadas em seus respectivos meios de crescimento contendo suplementos adequados (eg., FBS, antibióticos) em flas T75ks até 70-80% de confluência. </li><li> Separar as células imortalizadas a partir de frascos T75, usando o método apropriado para o tipo de célula a ser testada, por exemplo., Tripsina. Se necessário, antes de prosseguir com a sementeira de células em 96 poços de placas de ensaio, os poços da placa de ensaio revestimento com 10 ug / ml de poli-L-lisina durante 1 hora (por ex., Para células PC12) ou 10 ug / ml de poli-L-lisina para 1h, seguida por uma incubação de S / N com 10 ug / ml de laminina (por exemplo., para as células da retina mistos). </li><li> Células de centrífuga para recolher o apropriado (por exemplo., 3 ​​min a 405 xg durante células PC12 ou 10 min a 218 xg durante células RMC1), remover o sobrenadante e ressuspender em 8 ml de meio de cultura celular apropriado. </li><li> Se as células da retina são misturados a ser utilizado, a partir de preparar P0-5 filhotes de ratos neonatal por digestão enzimática (papaína), de acordo com os procedimentos estabelecidos 19 </li><li> Contar o número de células viáveis ​​excluindo 0,4% (w / v) de corante azul de tripano, utilizando um hemocitómetro. </li><li> Ajustar a densidade celular such células que será de aproximadamente 70-80% confluentes após 24 ou 48 horas em cultura. (Para células PC12 a densidade de sementeira é de 4,0 x 10 5 células viáveis ​​/ ml, para as células RMC1, é 2,5 x 10 5 células viáveis ​​/ mL e para as células da retina mistos é 8 x 10 5 células viáveis ​​/ ml). Após a adição de células ou para placas de 96 poços claras ou negras (usados ​​para a H 2 O 2 ou ensaio de DCFH-DA, respectivamente), em 100 ul de meio de crescimento adequado, permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana a 37 ° C, 5 % de CO 2 (ou o que quer que as condições são apropriadas para o tipo específico de célula) durante pelo menos 24 horas para permitir a aderência das células. </li><li> Células de cultura em meios de crescimento nos apropriados 96 bandejas bem até que eles sejam 70-80% confluentes (24h de PC12 e as células RMC1, 48h para as células da retina em comum). </li></ol> 3. A adição de glutamato Stressor a Células <ol><li> Prepare monossódico do ácido L-glutâmico concentrações hidrato de sal estressor de 0-10mm em grow completo adequadomeios de cultura th. </li><li> Remova a mídia a partir das células e lavar cuidadosamente as células 3 vezes com PBS (PC12) ou HBSS (RMC1 e células da retina mistas). Após lavagens, adicionar meio contendo glutamato para um volume total de 100 ul / poço. </li></ol> 4. Primeiro doses de tratamento com luz <ol><li> Imediatamente após a adição de glutamato ou o estressor de escolha, expor células para tratamento de luz nos comprimentos de onda e intensidades desejados, colocando sob o aparelho de distribuição de luz preparada. Certifique-se de alterar o resultado da quantal do feixe de luz, utilizando as combinações estabelecidas de filtros de densidade neutra, dependendo do comprimento de onda a ser administrado. Nota: Nas experiências actuais, expor as células a tratamento com luz durante 3 min a manter a temperatura em repouso as placas de 96 poços em um bloco 37 o C de calor. O tempo de tratamento pode ser variada como requerido. <ol><li> Coloque um cartão preto fosco debaixo das células para evitar a luz refletindo em poços adjacentes no 96-well tabuleiro designado para outros parâmetros de tratamento. </li></ol></li><li> Se se deseja o tratamento por longos períodos de tempo, adicionar tampão de Hepes 25 mM para manter o pH do meio de cultura celular ou, de preferência, colocar as placas e aparelhos de tratamento dentro de uma incubadora com CO 2 a concentração regulado para 5% de CO 2, ou as condições que são óptimas para o tipo de célula específico. </li><li> Após a conclusão do tratamento de luz, colocar as células numa superfície nivelada e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 (ou qualquer outra coisa condições são óptimas para o tipo de célula), durante 24 h. Nota: dosagens adicionais de R / NIR-LT pode ser administrado como descrito acima, se o desejar. </li></ol> 5. final Dosagem de tratamento de luz e Detecção de ROS <ol><li> Antes de realizar a etapa final do tratamento de luz, preparar os reagentes a serem utilizados para a detecção de ROS. Preparar tampão de citrato 50 mM (pH 6,0), Triton X-100, e H 2 O 2 reagente de detecção funcionandosolução de (1: 2: 97 proporção de 10 mM de solução stock de reagente de H 2 O 2 de detecção; 10 U / ml de peroxidase de rábano; citrato de sódio 50 mM (pH 6,0)). Prepare a DCFH-DA com uma concentração final de 100 uM em meio adequado. Nota: reagente DCFH-DA por células PC12 está em meio RPMI, reagente DCFH-DA para células RMC1 está em meio DMEM. Note-se que os reagentes de detecção disponíveis comercialmente têm sensibilidades diferenciadas para ROS específico e reagentes devem ser escolhidos com cuidado para fornecer a informação desejada para uma aplicação individual. </li><li> Administrar o tratamento de luz para as células, como descrito no passo 4.1-4.1.2. Assegurar que as células estão sendo tratados com as fluências desejados / comprimentos de onda da luz. </li><li> Imediatamente após o tratamento de luz, remova a mídia contendo glutamato e lavar duas vezes com solução tampão apropriado (para células PC12, PBS é usado e para células RMC1, HBSS é usado). Realizar os ensaios de ROS nas células, como se segue: <ol><li> H 2 O 2 2 durante 15 minutos. Adicionar 50 ul de H 2 O 2 a solução de trabalho de detecção e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Medir a fluorescência utilizando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm. </li><li> DCF ensaio: adicionar 100 uL da solução de DCFH-DA de cada um dos poços de 100 uM e incubar durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Remover o meio contendo 100 uM DCFH-DA e lava-se com solução tampão adequado (como descrito acima) duas vezes. Adicionar 90 ul de solução tampão e 10 ul de Triton X-100 a cada um dos poços e agitar suavemente num agitador orbital durante 30 segundos antes dos 15 minutos de incubação a 37 ° C. Meça DCF fluorescência derivada usando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um Wavel emissãoength de 530nm. </li><li> Expresso ROS valores relativos à concentração de proteína de células remanescentes nos poços, utilizando um kit colorimétrico para quantificar a concentração de proteína de acordo com as instruções do fabricante, com referência a uma curva padrão para calcular mg de proteína. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Temos adaptadas com êxito um sistema de entrega de luz preciso e calibrado para proporcionar um mecanismo para o estudo de optimização de R / NIR-LT in vitro. Parâmetros de comprimento de onda e intensidade da R / NIR-LT são capazes de ser manipulado com precisão e de forma eficaz usando este sistema. Determinou-se que o tratamento de luz das células não levar à morte da célula, apesar de ROS não foram reduzidos nos comprimentos de onda e as doses entregues, nos tipos de células testadas. As intensidades máxima...

Espécies reactivas de oxigénio (ROS) são necessárias para uma variedade de vias de transdução de sinal, e por reacções normais do metabolismo celular, incluindo aqueles de uma neuroprotecção. No entanto, quando o mecanismo antioxidante endógeno são incapazes de controlar a produção de ROS, as células podem sucumbir ao estresse oxidativo 2,3. Após lesão do SNC, os aumentos associados na presença de ROS e stress oxidativo estão pensados ​​para desempenhar um papel importante na progressão da lesão 4,5. Apesar da extensa série de estratégias para atenuar o estresse oxidativo que foram avaliados, não existem actualmente, estratégias anti-oxidantes clinicamente relevantes totalmente eficazes para atenuar a produção de ROS e estresse oxidativo associado no uso clínico seguinte neurotrauma 6. Por conseguinte, a atenuação de estresse oxidativo continua a ser um objectivo importante para a intervenção terapêutica 7. Melhorias seguiring R / NIR-LT têm sido relatados em uma ampla gama de lesões e doenças, incluindo reduções no tamanho do infarto do miocárdio, complicações renais e hepáticas durante diabetes, degeneração da retina, lesões do SNC e acidente vascular cerebral 8, talvez por reduzir o estresse oxidativo. Com especial atenção às lesões do SNC, os estudos pré-clínicos de eficácia de luz 670nm têm mostrado bons efeitos em modelos de degeneração da retina 9-11, lesão medular 12, a morte neuronal 13. Os ensaios clínicos foram conduzidos para a idade degeneração macular relacionada à seca e estão em andamento para o curso de 14, no entanto, os resultados destas experiências não parecem promissores, talvez devido a uma falha de empregar um tratamento eficaz parâmetros 15. Como tal, R / NIR-LT não tem sido amplamente adotado como parte da prática clínica normal em neurotrauma, apesar de ser um fácil de administrar, não-invasivo e tratamento relativamente barato. Barreiras à tradução clínica incluem a falta de uma clprimitiva entendeu mecanismo de ação e ausência de uma efetiva 16,17 protocolo de tratamento padronizado. A literatura atual sobre a terapia da luz revela uma infinidade de variações nos parâmetros de tratamento no que diz respeito às fontes de irradiação (LED ou laser), comprimento de onda (por exemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), a dose total (joules de irradiação / unidade de área), duração (tempo de exposição), timing (pré ou pós-insulto), frequência de tratamento e tipo de parto (pulso ou contínuo) 8. A variabilidade dos parâmetros de tratamento entre os estudos torna a comparação difícil e tem contribuído para o ceticismo quanto à eficácia 16. Portanto, a optimização de R / NIR-LT é claramente necessária, com sistemas de cultura de células com capacidade para fornecer o mecanismo de rastreio de alto débito necessário para comparar as múltiplas variáveis. No entanto, existem alguns sistemas de iluminação disponíveis no mercado que podem fornecer flexibilidade e controle suficiente sobre wavelength e intensidade para realizar tais experimentos de otimização. Comercialmente disponíveis dispositivos LED, geralmente não são capazes de fornecer múltiplos comprimentos de onda ou de intensidade, resultando em vários investigadores que utilizam dispositivos de diferentes fabricantes de LED, a qual pode variar não só na intensidade, mas também o espectro de comprimento de onda da luz emitida. Temos abordado esta questão através do emprego de uma fonte de luz Xenon banda larga filtrada através de filtros de interferência de banda estreita, gerando assim uma gama de comprimentos de onda e fluências de luz, permitindo um controlo apertado, preciso dos parâmetros do R / NIR-LT. É importante notar que a dose terapêutica do tratamento é definido pelo número de fotões que interagem com o photoacceptor (cromóforo), que, no caso de R / NIR-LT é postulada como sendo o citocromo c oxidase (COX) 18. Energia Photon entregue varia de acordo com o comprimento de onda; significando doses iguais de energia em diferentes comprimentos de onda será comvalorizada de diferentes números de fótons. Por conseguinte, a luz emitida a partir do dispositivo foi calibrado para emitir um igual número de fótons por cada um dos comprimentos de onda escolhidos para ser testado. Nós desenvolvemos um sistema que pode ser utilizado para entregar R / NIR-LT a uma gama de comprimentos de onda e intensidades para as células in vitro e demonstraram a capacidade para medir os efeitos da entregues R / NIR-LT sobre a produção de ROS nas células sujeitas a estresse glutamato.

<table><tbody><tr><td>Kit de Ensaio ROS Intracelular OxiSelect (Fluorescência Verde)</td><td>Cell Biolabs</td><td>STA-342</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed Reagente</td><td>Molecular Probes</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de Arco Xenon de 300 Watts</td><td>Newport Corporation</td><td>6258</td><td>Fonte de luz muito intensa, não olhe diretamente para a lâmpada. Certifique-se de que há resfriamento suficiente para a lâmpada enquanto ela está ligada</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Fluorescência USB4000-FL</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-3-UV Corretor de Cosseno para Coleta de Emissões</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200&mu; Fibra óptica de quartzo de diâmetro</td><td>m Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Espectroscopia SpectraSuite</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2300 EnSpire Leitor de Placas Multimodo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Toxicidade aguda, use luvas ao manusear.</td></tr><tr><td>Hidrato de sal monossódico de ácido L-glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142-47-2 (anidro)</td><td></td></tr><tr><td>Feocromocitoma medula adrenal de rato (PC12) células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, origem americana</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Quente para 37 & graus; C em banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>Horse Serum, origem neozelandesa</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Quente a 37 &deg; C em banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Quente até 37 &graus; C em banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Warm to 37 &deg; C em banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Quente a 37 &graus; C em banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>100X MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Quente até 37 &deg; C em banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Células Retinal Muller (rMC1)</td><td>Universidade da Califórnia, San Diego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Quente para 37 &deg; C em banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>75 cm2 Frascos</td><td>BD Biosciences</td><td>B4-BE-353136</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Alíquota e armazene a -20 &deg; </td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de C Hank (HBSS)</td> <td>Gibco</td><td>14025-134</td><td>Quente a 37 &deg; C em banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td>Quente a 37 &graus; C em banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>Proteína de Rato Laminina, Natural</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Alíquota e armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1X Neurobasal Médio</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Quente a 37 &deg; C em banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>165U Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços Corning, fundo transparente, preto</td><td>Corning</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Costar Placas de Poliestireno Transparente de 96 Poços Não Tratadas; Forma do poço: Redondo; Estéril.</td><td>Costar</td><td>07-200-103</td><td></td></tr><tr><td>Balancim Balancim</td><td>Centrífuga de laboratório</td><td></td><td></td>padrão</tr> Papel de filtro de densidade neutra de <tr><td></td><td>equipamento de laboratório</td><td></td><td></td>padrão</tr><tr><td>(0.3)</td><td>THORLABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de 442 nm</td><td>THORLABS</td><td>FL441.6-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de 550 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB550-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de 670 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB670-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de 810 nm</td><td>THORLABS</td><td>FB810-10e</td><td></td></tr><tr><td>desmontado e oslash; Filtros de Densidade Neutra Absortiva de 25 mm (0.1)</td><td>THORLABS</td><td>NE01B</td><td></td></tr><tr><td>Desmontado & Oslash; Filtros de Densidade Neutra Absortiva de 25 mm (0.2)</td><td>THORLABS</td><td>NE02B</td><td></td></tr><tr><td>Não Montado & Oslash; Filtros de Densidade Neutra Absortiva de 25 mm (0.3)</td><td>THORLABS</td><td>NE03B</td><td></td></tr><tr><td>Desmontado &Oslash; Filtros de Densidade Neutra Absortiva de 25 mm (0.5)</td><td>THORLABS</td><td>NE05B</td><td></td></tr><tr><td>Desmontado &Oslash; Filtros de Densidade Neutra Absortiva de 25 mm (0.6)</td><td>THORLABS</td><td>NE06B</td><td></td></tr><tr><td>Desmontado &Oslash; Filtros de densidade neutra absorvente de 25 mm (1.0)</td><td>THORLABS</td><td>NE10B</td><td></td></tr></tbody></table>

método de avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de terapia da luz vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo in vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red / terapia near-infrared luz (R / NIR-LT), entregue por laser ou diodo emissor de luz (LED), melhora os resultados funcionais e morfológicas em uma série de lesões do sistema nervoso central em vivo, possivelmente reduzindo o estresse oxidativo. No entanto, os efeitos do R / NIR-LT sobre o stress oxidativo têm sido mostrados para variar, dependendo do comprimento de onda, ou a intensidade da irradiação. Estudos comparando parâmetros de tratamento são escassos, devido à ausência de dispositivos disponíveis no mercado que oferecem vários comprimentos de onda ou intensidade, adequado para alta through-colocar em estudos de otimização in vitro. Este protocolo descreve uma técnica para a distribuição de luz num intervalo de comprimentos de onda e intensidades para optimizar as doses terapêuticas requeridas para um dado modelo de lesão. Colocámos a hipótese de que um método de entrega de luz, na qual os parâmetros de comprimento de onda e intensidade pode ser facilmente alterada, pode facilitar a determinação de uma dose óptima de R / NIR-LT para reduzir as espécies reactivas de oxigénio(ROS) in vitro. Luz de xénon não coerente foi filtrada através de filtros de interferência de banda estreita para proporcionar diferentes comprimentos de onda (comprimentos de onda centro de 440, 550, 670 e 810 nm) e as densidades de energia (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de luz para células de cultura. A emissão de luz a partir do aparelho foi calibrado para emitir, as doses terapeuticamente relevantes quantais iguais de luz em cada comprimento de onda. Espécies reactivas foram detectados em glutamato salientou células tratadas com a luz, utilizando DCFH-DA e H 2 O 2 corantes fluorescentes sensíveis. Nós entregue com sucesso luz na faixa de fisiologicamente e comprimentos de onda e intensidades terapeuticamente relevantes, para células de cultura expostas a glutamato como um modelo de lesão do SNC. Embora as densidades de energia de R / NIR-LT utilizados no presente estudo, não exerceu um efeito sobre ROS gerada pelas células cultivadas, o método de entrega de luz é aplicável a outros sistems incluindo mitocôndrias ou mais modelos de cultura fisiologicamente relevantes fatia organotípicas isolado, e poderia ser utilizado para avaliar os efeitos sobre uma gama de medidas de resultado do metabolismo oxidativo.

A saída de luz emitido num comprimento de onda de 670 nm foi calibrado usando filtros de densidade neutra, de modo a irradiar células com uma gama de densidades de energia que engloba uma dose de luz de 670 nm previamente demonstrado ser benéfico in vivo (0,3 J / cm 2) 20. Como o número de filtros de densidade neutra em frente da fonte de luz aumentou, a intensidade (W / m 2) diminuída, permitindo que menos que a luz passe para a área alvo. A Tabela 1 apresenta os dados de calibração de lu...

A luz de xenônio não coerente foi passada através de interferência de banda estreita e filtros de densidade neutra para fornecer luz de comprimento de onda e intensidade variados para células cultivadas. Este protocolo foi usado para avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha / infravermelha próxima na produção de espécies reativas in vitro: nenhum efeito foi observado usando os parâmetros testados.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar os efeitos de uma variedade de comprimentos de onda e intensidades da terapia com luz infravermelha vermelha no estresse oxidativo in vitro. Para fazer isso, desenvolvemos um novo método de fornecer a luz, onde podemos manipular o comprimento de onda e a intensidade entregues. Montamos uma fonte de luz de xenônio ou banda larga em uma caixa sobre uma base de metal e, em seguida, colocamos uma lente de revestimento, filtro de água e abertura de entrada na frente da luz.A próxima etapa do procedimento é guiar a luz gerada pela fonte de luz de banda larga através da entrada, abertura e guia de luz líquida e através de uma segunda lente de revestimento. Em seguida, filtros de largura de banda e densidade neutra são instalados para obter o comprimento de onda e a intensidade desejados da luz. Observe que os filtros permitem a passagem de uma faixa estreita de comprimentos de onda chamada de faixa de onda.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de entrega de terapia de luz infravermelha vermelha, como LEDs ou lasers, é que ela permite a manipulação precisa e calibrada dos parâmetros de comprimento de onda e intensidade. Isso nos permite otimizar a entrega da luz para os melhores resultados biológicos que o estudo atual administra, como células dissociadas. Além disso, também pode ser aplicado a outros sistemas, como organotípicos, modelos de neurotrauma.Ao trabalhar com qualquer fonte de luz de banda larga brilhante, certifique-se de não olhar diretamente para a fonte de luz, pois isso pode resultar em danos visuais permanentes. Para preparar o aparelho de entrega de luz, conecte uma fonte de luz de banda larga, como uma lâmpada de xenônio ou tungstênio, a uma fonte de alimentação apropriada. Posicione uma lente agrupada na frente da fonte de luz para produzir um feixe de luz agrupado.Passe a luz por um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz. Posicione uma lente agrupada na frente da fonte de luz para produzir um feixe de luz agrupado. Passe a luz por um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz.Dependendo da aplicação, concentre o feixe agrupado na arture de entrada de uma guia de luz líquida para fornecer uma entrega mais flexível da luz. Na outra extremidade da guia de luz líquida, posicione uma segunda lente de revestimento e, em seguida, um suporte para os filtros de interferência e densidade neutra. Este arranjo deve produzir um ponto de luz uniformemente iluminado com a faixa de onda e intensidade desejadas.A distância entre a extremidade da guia de luz e o plano da amostra pode precisar variar dependendo da área que deve ser iluminada. É importante lembrar que, de acordo com a lei do inverso do quadrado, à medida que a distância da extremidade da guia de luz aumenta, a intensidade da luz diminuirá no presente estudo. Essa distância é de 14 centímetros, o que resulta na produção de uma seção transversal do feixe que ilumina uniformemente uma área de três por três poços em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.Certifique-se de que a luz difusa da lâmpada e dos componentes ópticos associados não possa alcançar outras amostras, por ex.ample, usando papelão preto. Uma vez que o dispositivo esteja construído, ligue o refrigerador de água para o filtro de calor líquido e certifique-se de que haja uma troca de água através da camisa do filtro. Ligue a fonte de alimentação da lâmpada e aguarde pelo menos cinco minutos pela fonte de luz de banda larga.Para estabilizar, selecione um filtro de interferência de banda estreita Para gerar a faixa de onda de iluminação desejada. Meça a luz produzida pela lâmpada no plano onde a amostra deve ser posicionada. Durante o tratamento.A luz é medida usando uma sonda de irradiância calibrada conectada a um espectro adequado. Radiometer. Use filtros de densidade neutra para ajustar a intensidade da luz até que a saída desejada seja obtida. No presente estudo, a intensidade da luz passada por cada filtro de interferência é ajustada para fornecer uma saída de qualidade igual em cada uma das quatro bandas de onda de tratamento.O método de entrega de terapia de luz infravermelha vermelha descrita pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou sistema modelo in vitro. Aqui mostramos nossa técnica de entrega de luz às células usando feocromocitoma ou células PC 12. Por exemplo, células de cultura em meios de crescimento.Em 96, bandejas de poços revestidas com poliol lisina até que estejam 70 a 80% confluentes. Prepare a concentração desejada de glutamato ou estressor alternativo em meios de cultura de crescimento total. Aqui usamos 10 milimolares de glutamato.Remova o meio das células e lave-as suavemente três vezes com solução salina tampão fosfato. Após a lavagem, adicione o meio contendo glutamato a um volume total de cem microlitros por poço. Imediatamente após a adição de glutamato ou o estressor de escolha, exponha as células ao tratamento de luz nos comprimentos de onda e intensidades desejados, colocando a placa de cultura sob o aparelho de entrega de luz preparado.Certifique-se de alterar a saída de qualidade do feixe de luz usando as combinações estabelecidas de filtros de densidade neutra. Dependendo do comprimento de onda que está sendo administrado. Após a conclusão do tratamento com luz, coloque as células em uma superfície plana e incube a 37 graus Celsius em condições reguladas por dióxido de carbono por 24 horas.Doses adicionais de terapia com luz vermelha próxima ao infravermelho também podem ser administradas. Antes de realizar a rodada final de tratamento com luz, prepare os reagentes a serem usados para detecção de espécies reativas de oxigênio como um indicador de estresse oxidativo. Aqui, usamos dietas indicadas que fluorescem quando reagem com uma variedade de espécies reativas, incluindo diluído, acetato de fluoresceína D, administramos tratamento de luz às células conforme descrito na etapa quatro, garantimos que as células estejam sendo tratadas com as gripes desejadas e comprimentos de onda de luz.Imediatamente após o tratamento com luz, remova o meio contendo glutamato e lave duas vezes com PBS. Prossiga com os ensaios utilizando corantes indicadores que fluorescem quando reagem com espécies reativas de acordo com as instruções do fabricante. Meça a fluorescência gerada pelos corantes indicadores usando um leitor de placas ajustado para as configurações apropriadas de excitação e emissão.Use a cor do kit métrico para quantificar a concentração de proteína nos poços de acordo com as instruções do fabricante. Expresse as saídas de fluorescência em relação à concentração de proteína para cada poço individual e, em seguida, analise os resultados usando o software estatístico. O desenvolvimento desta técnica abre caminho para pesquisadores que investigam os efeitos de vários comprimentos de onda e intensidades da terapia de luz vermelha próxima ao infravermelho no estresse oxidativo.Esta técnica pode ser usada em uma variedade de sistemas modelo, incluindo células dissociadas ou culturas organotípicas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve a técnica de visualização do estresse oxidativo em organoides cultivados. Este trabalho ajuda a entender o nível de estresse oxidativo devido ao acúmulo de ROS nos vários tipos celulares presentes em um organoide após o tratamento com diferentes moduladores de ROS.

Ensaio de imagem por sonda fluorescente: uma técnica para visualizar o estresse oxidativo nas células organoides intestinais cultivadas tratadas com indutor de espécies reativas de oxigênio

Este vídeo demonstra o ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas.

Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

Este vídeo demonstra um ensaio de placa pontual adaptado para avaliar as respostas ao estresse oxidativo de cepas bacterianas. Algumas cepas produzem piomelanina, um pigmento antioxidante. Por outro lado, as cepas tratadas com um agente de teste, levando à redução da produção de piomelanina, exibem maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, resultando em diminuição da viabilidade celular em comparação com as cepas produtoras de piomelanina.

Um ensaio de placa pontual para avaliar as respostas ao estresse oxidativo em cepas bacterianas

Apresentamos uma abordagem espectroscópica óptica difusa (DOS) que fornece biomarcadores ópticos quantitativos da resposta da pele à radiação. Descrevemos o projeto de instrumentação DOS, algoritmos de extração de parâmetros ópticos e os procedimentos de manuseio de animais necessários para produzir dados representativos de um modelo pré-clínico de camundongo de eritema induzido por radiação.

Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

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Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

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Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

A quantificação das formas oxidada e reduzida de glutationa (GSSG e GSH, respectivamente) foi obtida através do uso de orto-ftalaldeído (OPA). O OPA torna-se altamente fluorescente uma vez conjugado ao GSH, mas é incapaz de conjugar o GSSG até que seja reduzido. Aqui, descrevemos um ensaio multiparamétrico para quantificar ambos usando quantificação de proteínas para normalização.

Quantificação rápida de formas oxidadas e reduzidas de glutationa usando orto-ftalaldeído em células de mamíferos cultivadas in vitro

Aprenda a avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha/near-infrared sobre o estresse oxidativo in vitro. Este método permite manipular precisamente comprimentos de onda e intensidades em células cultivadas.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

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