Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar os efeitos de uma variedade de comprimentos de onda e intensidades da terapia com luz infravermelha vermelha no estresse oxidativo in vitro. Para fazer isso, desenvolvemos um novo método de fornecer a luz, onde podemos manipular o comprimento de onda e a intensidade entregues. Montamos uma fonte de luz de xenônio ou banda larga em uma caixa sobre uma base de metal e, em seguida, colocamos uma lente de revestimento, filtro de água e abertura de entrada na frente da luz.

A próxima etapa do procedimento é guiar a luz gerada pela fonte de luz de banda larga através da entrada, abertura e guia de luz líquida e através de uma segunda lente de revestimento. Em seguida, filtros de largura de banda e densidade neutra são instalados para obter o comprimento de onda e a intensidade desejados da luz. Observe que os filtros permitem a passagem de uma faixa estreita de comprimentos de onda chamada de faixa de onda.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de entrega de terapia de luz infravermelha vermelha, como LEDs ou lasers, é que ela permite a manipulação precisa e calibrada dos parâmetros de comprimento de onda e intensidade. Isso nos permite otimizar a entrega da luz para os melhores resultados biológicos que o estudo atual administra, como células dissociadas. Além disso, também pode ser aplicado a outros sistemas, como organotípicos, modelos de neurotrauma.

Ao trabalhar com qualquer fonte de luz de banda larga brilhante, certifique-se de não olhar diretamente para a fonte de luz, pois isso pode resultar em danos visuais permanentes. Para preparar o aparelho de entrega de luz, conecte uma fonte de luz de banda larga, como uma lâmpada de xenônio ou tungstênio, a uma fonte de alimentação apropriada. Posicione uma lente agrupada na frente da fonte de luz para produzir um feixe de luz agrupado.

Passe a luz por um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz. Posicione uma lente agrupada na frente da fonte de luz para produzir um feixe de luz agrupado. Passe a luz por um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz.

Dependendo da aplicação, concentre o feixe agrupado na arture de entrada de uma guia de luz líquida para fornecer uma entrega mais flexível da luz. Na outra extremidade da guia de luz líquida, posicione uma segunda lente de revestimento e, em seguida, um suporte para os filtros de interferência e densidade neutra. Este arranjo deve produzir um ponto de luz uniformemente iluminado com a faixa de onda e intensidade desejadas.

A distância entre a extremidade da guia de luz e o plano da amostra pode precisar variar dependendo da área que deve ser iluminada. É importante lembrar que, de acordo com a lei do inverso do quadrado, à medida que a distância da extremidade da guia de luz aumenta, a intensidade da luz diminuirá no presente estudo. Essa distância é de 14 centímetros, o que resulta na produção de uma seção transversal do feixe que ilumina uniformemente uma área de três por três poços em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.

Certifique-se de que a luz difusa da lâmpada e dos componentes ópticos associados não possa alcançar outras amostras, por ex.ample, usando papelão preto. Uma vez que o dispositivo esteja construído, ligue o refrigerador de água para o filtro de calor líquido e certifique-se de que haja uma troca de água através da camisa do filtro. Ligue a fonte de alimentação da lâmpada e aguarde pelo menos cinco minutos pela fonte de luz de banda larga.

Para estabilizar, selecione um filtro de interferência de banda estreita Para gerar a faixa de onda de iluminação desejada. Meça a luz produzida pela lâmpada no plano onde a amostra deve ser posicionada. Durante o tratamento.

A luz é medida usando uma sonda de irradiância calibrada conectada a um espectro adequado. Radiometer. Use filtros de densidade neutra para ajustar a intensidade da luz até que a saída desejada seja obtida. No presente estudo, a intensidade da luz passada por cada filtro de interferência é ajustada para fornecer uma saída de qualidade igual em cada uma das quatro bandas de onda de tratamento.

O método de entrega de terapia de luz infravermelha vermelha descrita pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou sistema modelo in vitro. Aqui mostramos nossa técnica de entrega de luz às células usando feocromocitoma ou células PC 12. Por exemplo, células de cultura em meios de crescimento.

Em 96, bandejas de poços revestidas com poliol lisina até que estejam 70 a 80% confluentes. Prepare a concentração desejada de glutamato ou estressor alternativo em meios de cultura de crescimento total. Aqui usamos 10 milimolares de glutamato.

Remova o meio das células e lave-as suavemente três vezes com solução salina tampão fosfato. Após a lavagem, adicione o meio contendo glutamato a um volume total de cem microlitros por poço. Imediatamente após a adição de glutamato ou o estressor de escolha, exponha as células ao tratamento de luz nos comprimentos de onda e intensidades desejados, colocando a placa de cultura sob o aparelho de entrega de luz preparado.

Certifique-se de alterar a saída de qualidade do feixe de luz usando as combinações estabelecidas de filtros de densidade neutra. Dependendo do comprimento de onda que está sendo administrado. Após a conclusão do tratamento com luz, coloque as células em uma superfície plana e incube a 37 graus Celsius em condições reguladas por dióxido de carbono por 24 horas.

Doses adicionais de terapia com luz vermelha próxima ao infravermelho também podem ser administradas. Antes de realizar a rodada final de tratamento com luz, prepare os reagentes a serem usados para detecção de espécies reativas de oxigênio como um indicador de estresse oxidativo. Aqui, usamos dietas indicadas que fluorescem quando reagem com uma variedade de espécies reativas, incluindo diluído, acetato de fluoresceína D, administramos tratamento de luz às células conforme descrito na etapa quatro, garantimos que as células estejam sendo tratadas com as gripes desejadas e comprimentos de onda de luz.

Imediatamente após o tratamento com luz, remova o meio contendo glutamato e lave duas vezes com PBS. Prossiga com os ensaios utilizando corantes indicadores que fluorescem quando reagem com espécies reativas de acordo com as instruções do fabricante. Meça a fluorescência gerada pelos corantes indicadores usando um leitor de placas ajustado para as configurações apropriadas de excitação e emissão.

Use a cor do kit métrico para quantificar a concentração de proteína nos poços de acordo com as instruções do fabricante. Expresse as saídas de fluorescência em relação à concentração de proteína para cada poço individual e, em seguida, analise os resultados usando o software estatístico. O desenvolvimento desta técnica abre caminho para pesquisadores que investigam os efeitos de vários comprimentos de onda e intensidades da terapia de luz vermelha próxima ao infravermelho no estresse oxidativo.

Esta técnica pode ser usada em uma variedade de sistemas modelo, incluindo células dissociadas ou culturas organotípicas.