Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

O objetivo geral desse processo é cultivar um grande número de células sob condições controladas de nutrientes. Utilizando equipamentos convencionais encontrados em laboratório de cultura celular. Os algoritmos associados permitem o controle e manipulação de nutrientes dentro de intervalos experimentais.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para aplicações de cultura de células em larga escala. Como terapias celulares humanas. A principal vantagem desta técnica é que facilita o cultivo de células em larga escala com distribuição uniforme de nutrientes e gases.

Isso permite densidades celulares mais altas do que as culturas de células estáticas ou alimentadas a granel, aumenta o rendimento e reduz a perda de células. Isso pode ser feito com equipamentos comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura de células. A demonstração visual desse método pode ser útil para novos investigadores, pois essas técnicas usadas podem ser difíceis de dominar, devido ao grande número de etapas que devem ser realizadas em uma ordem específica em condições estéreis.

Colete os cinco componentes primários necessários para o sistema de alimentação. Um reservatório médio, bomba peristáltica, biorreator agitado, reservatório de resíduos e conjunto de amostragem de tubulação personalizado. Estabeleça o reservatório médio usando uma garrafa de vidro de um litro.

O reservatório de resíduos usando uma garrafa de vidro de dois litros. O biorreator agitado usando um reator de vidro de volume de 250mL. Use uma bomba peristáltica digital ou uma bomba similar com um cabeçote de bomba de oito canais para controlar a troca do meio.

Monte o reservatório e as tampas do biorreator modificado de plástico rígido e autoclavável. Com portas de passagem de tubos de aço inoxidável para fornecer ventilação através de filtros estéreis e permitir a transferência de meio entre reservatórios e biorreatores. Conecte um tubo de saída fabricado a partir de tubos de aeração de vidro poroso à tampa do biorreator de suspensão agitada modificada.

Monte conjuntos de tubos de perfusão autoclaváveis a partir de conectores de tubos de fluoreto de polivinilideno e tubos de bomba peristáltica duráveis. O comprimento da seção depende da distância entre os diferentes componentes. Monte a linha de alimentação usando dois diâmetros de tubulação.

Use L / S 14 para a tubulação primária que abrangerá a distância do biorreator ao reservatório médio. Insira um comprimento de classificação da tubulação L/S 13 no meio do comprimento da tubulação para a seção da bomba, usando os adaptadores PVDF apropriados. Use adaptadores de tubulação farpada de mangueira PVDF padrão para unir duas peças de tubulação L / S 14 em ambos os lados da tubulação da seção da bomba mais curta.

Monte a seção da tubulação da seção para remoção de resíduos usando uma tubulação L/S 16 de diâmetro maior e insira uma seção curta da tubulação L/S 14 no meio para a seção de bombeamento. Isso é feito da mesma forma que o conjunto da linha de alimentação usando adaptadores farpados de mangueira PVDF. Monte o componente final do conjunto de tubos construindo o conjunto a partir de três comprimentos curtos de tubos L/S 14.

Conectado junto com um conector HVDF tipo T e duas pequenas braçadeiras de mangueira em dois dos comprimentos de tubulação. Conecte o sample conjunto ao conector de amostra de aço inoxidável preso na tampa do biorreator. Após a esterilização, um filtro de gás estéril será conectado para ventilação de gás em um dos comprimentos fixados.

O outro é usado para conexão a uma seringa de amostragem estéril. Autoclave o conjunto de amostragem enquanto estiver conectado ao biorreator, antes de iniciar o experimento, conforme descrito no protocolo de texto. Use este conjunto para coletar amostras estéreis do biorreator conforme necessário, sem perturbar o processo de alimentação contínua.

Conecte as aberturas estéreis nos locais apropriados nas tampas do frasco giratório, do recipiente médio, dos recipientes de resíduos e das portas de amostra. Cultive e colha as células conforme descrito no protocolo de texto. Deixe as células incubarem em temperatura ambiente em tripsina por dois a três minutos em um gabinete de biossegurança e, em seguida, colete-as em um tubo cônico.

Uma pequena amostra de células é então coletada e corada com azul de tripano. Conte a densidade celular usando um microscópio e hemocitômetro padrão com coloração com azul de tripano, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione o número desejado de células totais aos biorreatores de suspensão agitada estéril para cada condição.

Adicione o meio ao biorreator de suspensão agitada usando uma pipeta para atingir o volume total de cultura desejado. Mova o biorreator de suspensão agitada com células para uma placa de agitação dentro de uma incubadora de cultura de células. Células de cultura nos biorreatores sem alimentação por três dias a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, 100% de umidade relativa e uma taxa de agitação de 70 rpm para permitir a formação de esferoides.

Após a formação do esferóide, remova o biorreator de suspensão agitada da incubadora. Monte os componentes para o sistema de alimentação contínua em uma cabine de segurança biológica. Primeiro encha um reservatório de meio fresco com o meio de cultura desejado e, em seguida, conecte a um lado da linha de alimentação.

Certifique-se também de que o reservatório de meio fresco esteja devidamente ventilado com um filtro estéril. Um filtro estéril deve ser substituído na porta de entrada do biorreator para filtrar o meio antes que ele entre no biorreator. Conecte a linha de resíduos ao reservatório de resíduos médio e certifique-se de que o reservatório de resíduos seja devidamente ventilado com um filtro estéril.

Coloque o biorreator de suspensão agitada na placa de agitação dentro da incubadora usando os mesmos parâmetros de cultura da formação de esferoides. Coloque o reservatório de meio fresco dentro de um frigobar próximo. Certifique-se de que as linhas de alimentação possam sair do refrigerador sem impedir que as portas se fechem.

Também é fundamental que as linhas de alimentação não sejam fechadas pelas portas do refrigerador ou da incubadora. O reservatório de meio residual pode ser colocado na bancada fora da incubadora em um local conveniente. Passe as extremidades restantes da tubulação para a incubadora e conecte a linha de alimentação ao filtro na porta de entrada do biorreator.

Em seguida, conecte a linha de resíduos à porta do tubo de saída. Em seguida, coloque a seção da bomba das linhas de alimentação e resíduos no cabeçote da bomba, garantindo a orientação adequada para que as linhas de alimentação bombeiem o meio do reservatório de meio fresco para o biorreator de suspensão agitada e as linhas de resíduos bombeiem o meio do biorreator e para o reservatório do meio de resíduos. Calcular o avanço utilizando a equação do avanço ajustado, conforme descrito no protocolo de texto.

Use a amostra mais recente com informações de contagem de células, juntamente com a previsão da taxa de crescimento e as medições de glicose média para estimar a taxa de alimentação necessária para manter a concentração de glicose desejada na cultura. Defina a velocidade da bomba com base na taxa de alimentação calculada. Repita o cálculo da taxa de alimentação e ajuste a velocidade da bomba para cada ponto de amostragem.

As medições de glicose média são mostradas a partir de culturas de esferóides de insulinoma Beta-TC6 usando biorreatores estáticos de suspensão agitada e métodos de cultura de biorreatores de suspensão agitada alimentados continuamente. Alimentação com meio padrão de alta glicose. A alimentação contínua é capaz de eliminar as flutuações de glicose, mas os níveis médios de glicose no meio mudam drasticamente durante o período de cultivo e estão muito acima da faixa fisiológica.

A alimentação ajustada é capaz de eliminar as flutuações, bem como manter as concentrações de glicose próximas aos níveis fisiológicos durante o período de cultivo. Aqui, o crescimento celular relatado como mudança de dobra no número de células durante o período de cultura de 21 dias é comparado para biorreatores de suspensão agitada com mudanças regulares de meio, culturas de biorreatores de suspensão agitada com taxa de alimentação constante e culturas de biorreatores de suspensão agitada com taxa de alimentação ajustada. Seguindo este procedimento, outros métodos, como condições variadas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como requisitos de nutrientes para novas linhagens celulares ou resultados experimentais específicos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem os requisitos metabólicos em células de humanos com câncer ou outros distúrbios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar um sistema de cultura de células de profusão para controlar melhor as condições de cultura e maximizar o rendimento das células. Não se esqueça de que trabalhar com células humanas pode ser extremamente perigoso, e precauções como proteção contra patógenos transmitidos pelo sangue devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.