Name: Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a cultivar esferoides de células de mamíferos em grande escala usando alimentação contínua ajustada em biorreatores de suspensão agitada. Este método melhora as taxas de crescimento e a distribuição uniforme de nutrientes para terapias celulares.

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Os autores agradecem a Michael Garwood e Sam Stein por seus comentários úteis e a Kristen M. Maynard pela ajuda na preparação do manuscrito.

Os autores não têm nada a divulgar.

Geração de produtos de células de mamíferos para a produção de agentes biológicos e para terapias celulares requer a cultura e monitorização de células de mamífero em grande escala 55-58. Além disso, estas aplicações requerem condições de cultura definidas e validadas. Simplesmente aumentar o volume de células usando tecnologias de pesquisa não vai atender a todos esses requisitos. Manual de alterações a médio causando flutuações em nutrientes e acúmulo de resíduos de produtos reduzir a ...

A fim de gerar grandes números de células humanas viáveis ​​e funcionais para transplante, a regulação das condições de cultura é imperativo. O esgotamento de nutrientes, juntamente com a acumulação de resíduos metabólicos são importantes contribuintes para a senescência e alterações metabólicas que reduzem a qualidade do produto celular 1-3. Este procedimento demonstra um método para cultura de células de mamífero em esferóides utilizando um biorreactor agitado combinado com um sistema de alimentação de perfusão taxa ajustada para regular a glucose numa gama fisiológica 4 durante toda a duração da cultura. Para a finalidade destes estudos, a gama fisiológica foi definida como entre 100 e 200 mg / dl. Os mesmos métodos podem ser utilizados para regular outros nutrientes e resíduos metabólicos, tais como lactato. culturas estáticas em pequenos volumes (1 - 30 ml) são normalmente utilizados no ambiente de laboratório para manter e diferenciar linhas celulares para experimefins ntal. Passaging celular é realizada com as mudanças de meio completo, conforme necessário, em intervalos regulares. Mais meio de cultura &quot;convencional&quot; tem uma concentração de glucose elevada (450 mg / dl para DMEM utilizado nestes estudos) para permitir as mudanças de meio menos frequentes, sem o risco de limitações nutricionais. No entanto, esse método de alimentação de lote ainda requer manipulação frequente, introduz variabilidade no ambiente celular, e aumenta o risco de contaminação 5-9. Biorreatores suspensão agitada (SSB) fornecer uma melhor mistura e diminuição da manipulação de 3,10 - 20, mas como culturas estáticas, exigir mudanças médias manuais que contribuem para flutuações potencialmente prejudiciais nos níveis de produtos nutricionais e de resíduos. alimentação perfusão de culturas SSB reduz esses problemas por infusão contínua e remoção do meio, mas grandes mudanças nos níveis de nutrientes devido ao crescimento celular continuam a ser um problema. A utilização de uma alimentação adequada rate a partir de cálculos de uso de nutrientes com base em requisitos de células estimados podem proporcionar o ambiente celular estável necessário para otimizar a viabilidade celular e funcionar 21-24. Há um grande corpo de literatura métodos para culturas escaláveis SSB de células de mamíferos, especificamente para a cultura e expansão de células pluripotentes 25 descrevendo - 32, com os outros focados em (beta) células 17,33,34 ilhota, ou a produção de produtos biológicos 24, 35-38. Muitos destes tipos de células investigadas podem ser cultivadas em culturas de esferóides, e procedimentos específicos para o tipo de célula a ser utilizado deve ser optimizado antes da implementação de um sistema de alimentação contínuo. Nesta demonstração, um método de alimentação de perfusão foi usada para expandir uma linha celular cultivada como beta esferóides num biorreactor agitado 39-43. O método aqui descrito proporciona umaimplementação direta de alimentar ajustes de taxa com base em medições de glicose no off-line para alcançar condições de cultura alvo. Ajustando a taxa de alimentação com este método para manter um nível de glucose fisiológica é mostrado para colheitas de células aumenta. As células de mamíferos são dependentes de um nutriente essencial, glucose, para a produção de energia, de modo que o uso desta linha de células representa um modelo para muitas células de mamíferos em cultura 44. Além disso, esta linha exemplifica a complexidade adicional de células beta, que são sensíveis a níveis elevados de glicose 45 crónicas. Para este estudo, as células beta-TC6 permissão para formar esferóides em cultura para aproximar o tamanho médio das ilhotas de Langerhans in vivo. O sistema de bioreactor de perfusão 17 - 19,21,46 com uma taxa de alimentação ajustada ao consumo de glicose, resultou na manutenção de condições fisiológicas e rendimentos mais elevados de células, sem alterações na viabilidade.

<table><tbody><tr><td>&#946; Células TC-6</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>Linha celular de insulinoma de camundongo (tipo de célula aderente)</td></tr> <tr><td>DPBS No Ca, No Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>Veja abaixo os números do produto&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM Glicose Alta (500 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM Glicose Baixa (100 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note que este meio já contém piruvato)</a></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=pesquisar-produto">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=produto-de-pesquisa">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Soro suíno inativado por calor</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=produto-de-pesquisa">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 Frascos tratados com cultura de tecidos</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430825</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>NuAire Incubadora de cultura de células</td><td>Princeton, MN</td><td></td><td>US Autoflow. Qualquer incubadora de cultura de células reguladora de CO2 com camisa de água pode ser usada.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>Sorvall RT 7 (Qualquer centrífuga de bancada semelhante pode ser usada)</td></tr><tr><td>Geladeira</td><td></td><td></td><td>Qualquer refrigerador de laboratório pode ser usado (uma pequena versão de mesa foi usada para esses estudos)</td></tr><tr><td>Garrafa de vidro de 1 L</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-1L</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>2 L Garrafa de Vidro</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-2L</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado</td></tr><tr><td>biorreatores agitados de 250 ml&nbsp;</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>Placa de Agitação</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-496-104A</td><td>Qualquer placa de agitação segura para incubadora pode ser usada, qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos 100 mm de Diâmetro</td><td>Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado (encomendado através da Fisher Sci)</td></tr><tr><td>Tubos Cônicos FALCON 50 ml</td><td>Falcon, San Jose, CA</td><td>1256598</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado</td></tr><tr><td>Plástico Delran Usado para Peças Personalizadas</td><td>McMaster Carr</td><td>Vários</td><td>Qualquer material de escolha pode ser usado, mas Deran é escolhido porque é seguro para autoclave, não reativo e fácil de usinar. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td></tr><tr><td>Tubo de Aço Inoxidável para tampas personalizadas</td><td>McMaster Carr</td><td>Vários</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>Tampas de biorreator Delran modificadas personalizadas para alimentação contínua</td><td>Não</td><td></td><td>tenho conhecimento de nenhum fornecedor que produza um produto similar</td></tr><tr><td>Tampas de garrafas de vidro modificadas personalizadas para alimentação</td><td>contínua Feitas</td><td></td> sob medida <td>Alguns fornecedores (e.g., Fischer Sci, Corning) fabricam produtos semelhantes nos links abaixo.</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica Digital Masterflex Cole</td><td>Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>Qualquer bomba peristáltica de precisão pode ser usada. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>Conectores de tubulação PVDF (vários)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>veja o link</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>Tubulação BPT Pharmed L/S 16</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>Tubulação BPT Parmada L/S 14</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-14</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>Tubulação BPT Parmada L/S 13</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-13</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Membrana Millipore Millex GP PES 0,22 &#181; l filtro de seringa estéril (usado para ventilação e filtração média)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado</td></tr><tr><td>Pipeta graduada de 25 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-11</td><td>Qualquer fornecedor pode ser usado, e vários tamanhos podem ser usados</td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td>Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>Microscópio de Luz Invertida</td><td>Leica</td><td></td><td>Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado</td></tr><tr><td>Medidor de Glicose no Sangue One Touch Ultra</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>Qualquer fornecedor, ou produto similar pode ser usado (e.g., Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>Qualquer fornecedor ou produto similar pode ser usado (por exemplo, Bayer)</td></tr></tbody></table>

nutrient regulamento, a alimentação contínua de expansão em grande escala de células de mamíferos em spheroids

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

Nesta demonstração, esferoides formados a partir da linhagem celular de insulinoma β-TC6 foram cultivados como um modelo de fabricação de um produto de célula de ilhota de mamífero para demonstrar como a regulação dos níveis de nutrientes pode melhorar o rendimento celular. Em estudos anteriores, os biorreatores facilitaram o aumento dos volumes de cultura em relação às culturas estáticas, mas nenhum aumento no rendimento das células foi observado. Limitações em nutrientes essenciais, como a glicose, que foram consumidos entre as alimentações em lote, podem levar a limitações na expansão celular. Foram observadas grandes flutuações nos níveis de glicose, apesar do aumento das concentrações de glicose na mídia. O uso de sistemas de alimentação contínua eliminou as flutuações nos níveis de glicose e melhorou as taxas de crescimento celular quando comparado com os métodos de cultura estática e SSB alimentados em lote. Aumentos adicionais nas taxas de crescimento foram observados ajustando a taxa de alimentação com base no consumo calculado de nutrientes, o que permitiu a manutenção da glicose fisiológica ao longo de três semanas em cultura. Este método também pode ser adaptado para outros tipos de células.

Níveis de glicose médio e flutuações Restringir Expansão celular em culturas SSB Padrão Os níveis de glicose flutuar nas culturas estáticas e culturas SSB durante todo o período de cultura 3. Estas flutuações intensificar com o aumento do número de células durante o período de cultura de 21 dias e eram quase idênticas em ambas as culturas estáticas e SSB. Estas observações são apresentados na nossa publicação anterior 3. Os níveis de glicose pode ser su...

A regulação de nutrientes usando alimentação ajustada ao crescimento contínuo melhora as taxas de crescimento de esferoides de células de mamíferos em comparação com a alimentação em lote intermitente para culturas em biorreatores de suspensão agitada. Este estudo demonstra os métodos necessários para estabelecer culturas alimentadas com taxa ajustada simples.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

O objetivo geral desse processo é cultivar um grande número de células sob condições controladas de nutrientes. Utilizando equipamentos convencionais encontrados em laboratório de cultura celular. Os algoritmos associados permitem o controle e manipulação de nutrientes dentro de intervalos experimentais.Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para aplicações de cultura de células em larga escala. Como terapias celulares humanas. A principal vantagem desta técnica é que facilita o cultivo de células em larga escala com distribuição uniforme de nutrientes e gases.Isso permite densidades celulares mais altas do que as culturas de células estáticas ou alimentadas a granel, aumenta o rendimento e reduz a perda de células. Isso pode ser feito com equipamentos comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura de células. A demonstração visual desse método pode ser útil para novos investigadores, pois essas técnicas usadas podem ser difíceis de dominar, devido ao grande número de etapas que devem ser realizadas em uma ordem específica em condições estéreis.Colete os cinco componentes primários necessários para o sistema de alimentação. Um reservatório médio, bomba

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Bioengineering

Bioengenharia

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Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.

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