Name: Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda um protocolo otimizado para fracionamento rápido de sangue total em configuração comunitária. Este método permite o isolamento simultâneo de DNA, RNA, plasma e células mononucleares de sangue periférico com alta qualidade.

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Gostaríamos de agradecer a Henriette Mair-Meijers pela inestimável atenção aos detalhes e horas dedicadas ao processamento das coletas de sangue. Somos gratos pela experiência em design gráfico de Natalie Jameson Kiesling. Também agradecemos a aprovação dos fabricantes (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) aqui mencionados para publicar o uso de seus produtos conforme descrito. O financiamento para este trabalho foi generosamente fornecido pelos prêmios nacionais do National Institutes of Health números DA022720, RC1MH088283 e DA022720-05-S1.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Nós descrevemos um protocolo simplificado que tem sido aplicado com sucesso para processar mais de 1.600 amostras de sangue total no Estudo de Saúde Detroit Neighborhood. Apesar de muitas destas técnicas estão disponíveis na literatura existente, a compilação passo-a-passo, incluindo alterações precisamente programado entre cada passo, reflecte, um protocolo optimizado eficiente que produz com sucesso uma variedade de amostras biológicas com uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo a metilação do DNA, expressão...

Vários estudos têm caracterizado diferenças na expressão genética, a metilação do DNA e subconjunto de células no sangue entre os indivíduos com e sem mental (ou outras) doenças 1-4. Esses estudos, no entanto, foram obtidos a partir de situações clínicas em que as diferenças associados à doença podem ser ampliadas devido à natureza geralmente mais grave das doenças para as quais os pacientes procuram tratamento. Devido aos avanços na "ómicas" abordagens, a última década assistiu a uma explosão de interesse em obter amostras biológicas de comunidade e / ou contextos epidemiológicos 5-7, a fim de fornecer estimativas populacionais de prevalência da doença e um quadro mais amplo do determinantes ambientais destas doenças mentais e / ou físicas. Um desafio fundamental a este respeito é a exigência de um rápido processamento dos espécimes coletados. Degradação de células mononucleares, os componentes do sistema imunológico que são fundamentais frequently utilizado para avaliar a saúde de um indivíduo, começa imediatamente após a colheita de sangue com uma diminuição significativa na recuperação após 2 horas de recolha de 8-10. Para enfrentar esse desafio, apresentamos um protocolo otimizado em que vários componentes do sangue humano são simultaneamente isolado a partir de amostras obtidas nas casas de indivíduos que vivem em uma grande área metropolitana. O protocolo é baseado em nossa compilação e modificação das técnicas atuais, incluindo o armazenamento de todas as frações "extra" em caso futuras técnicas permitem um maior isolamento / análises. Enquanto os métodos alternativos ou estojos podem ser utilizados no lugar dos métodos descritos aqui individuais, aqueles descritos provaram ser um meio fiável e eficiente para o processamento de amostras de um modo de alto rendimento. Frações de alta qualidade (PBMC, DNA, soro e RNA) de sangue fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de coleta e todos os espécimes de ensaio-pronto pode estar disponível dentro de 2 dias (Figura 1). Este protocolo foi desenvolvido para permitir o processamento eficiente de amostras coletadas de comunidade-moradia, adultos residentes na cidade de Detroit para testes no Estudo de Saúde Bairro Detroit (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) uma base populacional, estudo dos determinantes sociais e biológicas do transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) e outras doenças mentais. A prevalência de TEPT em Detroit é mais do que o dobro da média nacional 11,12. Identificar os determinantes biológicos de PTSD nesta população pode ajudar a desenvolver farmacológico adequado e / ou intervenções cognitivo-comportamentais para ajudar aqueles que sofrem de transtorno, tanto na população urbana, e em outras populações de alto risco (por exemplo, retornando veteranos militares). Nosso laboratório, anteriormente localizado na Wayne State University, em Detroit, Michigan, foi selecionado para o processamento com base em nossa experiência em lidar com amostras de tecido fresco derivadas de uma variedadede fontes, a necessidade de começar a processar as amostras no prazo de 2 horas da coleta, e nossa proximidade com os locais de coleta. Com esta oportunidade única na mão, o nosso objetivo foi otimizar o processamento para maior rendimento de DNA, RNA, soro e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de cada amostra (de um total de n = 1.639 amostras ao longo de 5 ondas de coleta de amostra). Os procedimentos descritos aqui podem ser realizadas simultaneamente num ambiente não-clínica, produzindo, assim, o material (ver Tabela 1 para os rendimentos médios) a partir de um grande número de aplicações a jusante, incluindo microarrays, epigenética, em tempo real de RT-PCR, e a citometria de fluxo análises. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> Figura 1. fluxo geral de trabalho. O processo global descrito aqui inclui a logística de obtenção das amostras de sangue de identificar consentindo participants para o sangue desenhar a si próprio. De alta qualidade, as fracções (células mononucleares do sangue periférico; PBMC, ADN, soro, ARN) e de sangue inteiro fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de recolha e todas as amostras de ensaio prontos podem estar disponíveis no prazo de 2 dias. Além disso, as fracções preparadas por este método são adequados para armazenamento a longo prazo se as amostras não são para ser testada imediatamente. Todo o cronograma descrito aqui pode ser concluído em um único dia (~ 5 horas total). No entanto, um tal dia seria extremamente trabalhoso, especialmente para um único técnico com experiência substancial com as técnicas. Assim, recomendamos dividindo os procedimentos no dia 1 entre pelo menos dois técnicos e concluir o processamento do RNA no dia 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini Kit QIAamp DNA Blood</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Dia 1: Isolamento de DNA</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered salina (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; Pipetas Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS), inativado por calor</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640,</td><td>Invitrogen</td><td>líquido 11875119</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>0,4% mancha azul de tripano&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Contador Automatizado de Células Countess ou dispositivo de contagem de células, como microscópio e hemocitômetro</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Dia 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Fracionamento LeucoLOCK & Kit de Estabilização&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Dia 1: Isolamento de RNA leucocitário</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 pol. agulhas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Dia 1: Isolamento de RNA de leucócitos</td></tr><tr><td>Seringas (5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>Dias 1 e 2: Isolamento de RNA de leucócitos</td></tr> Solução <tr><td>de lise desnaturante&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Dia 2: Isolamento de RNA leucocitário</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Dia 2: Isolamento de RNA de leucócitos</td></tr><tr><td>TRI Reagent Ambion</td><td></td><td>9738</td><td>Dia 2: Isolamento de RNA de leucócitos</td></tr><tr><td>Bromo-3-cloro-propano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>Dia 2: Cartuchos de spin de isolamento de RNA de leucócitos</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Dia 2: Isolamento de RNA leucocitário</td></tr><tr><td>0,1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Dia 2: Isolamento de RNA leucocitário</td></tr><tr><td>Kit DNA-free</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>Dia 2: Tratamento DNase</td></tr><tr><td>RNA 6000 Ladder&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Dia 2: Análise de bioanalisador</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Dia 2: Análise do bioanalisador</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Dia 2: Análise do bioanalisador</td></tr><tr><td>Etanol >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Água ultra pura sem nuclease&nbsp;</td>Pontas de pipeta <td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>(sem nuclease)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (sorológica)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetters (para volumes abaixo de 1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas (sorológicas)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de congelamento de taxa controlada</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes (para comportar 2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml criogeniais e 1,5&nbsp; tubos de microcentrífuga ml)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para tubos de ensaio</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml tubos de polipropileno</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml e 0,65 tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 e 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml crioviais</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 e 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 tubos</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 EDTA vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 tubos</td></tr><tr><td>8.5&nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 tubo</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de banho seco com bloco de aquecimento para tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtração/vácuo para uso dentro da capa de cultura de células</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo para tubos de microcentrífuga com tampa</td> <td>estanque a aerossóisEppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada com rotor de balde oscilante e tampas à prova de aerossóis para 16 x 125&nbsp; mm vacutainers e 15&nbsp; ml tubos de polipropileno</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, não é necessário refrigerar</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (recomendado para precisão de pequenos volumes) ou outro dispositivo espectrofotométrico</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para objetos cortantes</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de resíduos biológicos</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Nível de Biossegurança 2&nbsp; capuz de cultura de células certificado</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Coleta e processamento de amostras de sangue total em um ambiente não-clínica oferece uma oportunidade única para avaliar indivíduos residentes na comunidade com e sem condições pré-existentes. Transformação rápida destas amostras é essencial para evitar a degradação dos componentes celulares principais. Incluem-se aqui métodos para simultânea de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), DNA, RNA e isolamento de soro a partir de uma única coleta de sangue realizados nas casas dos consentindo participantes através de uma área metropolitana, com o processamento iniciado no prazo de 2 horas da coleta. Temos usado essas técnicas para processar mais de 1.600 amostras de sangue produzindo, materiais de alta qualidade consistente, o que foi posteriormente utilizado na metilação do DNA, genotipagem, expressão gênica bem sucedido e citometria de fluxo analisa. Alguns dos métodos empregados são padrão; No entanto, quando combinados da maneira descrita, permitem um processamento eficiente das amostras a partir de participantes de populacional e / ou comunitáriaestudos baseados que normalmente não seriam avaliadas em um ambiente clínico. Por conseguinte, este protocolo tem o potencial de se obter amostras de dados (e, posteriormente), que são mais representativas da população geral.

É essencial que o procedimento geral produzir material de alta qualidade, para análise num grande número de aplicações a jusante, incluindo a expressão do gene através de microarray e análise por RT-PCR, a detecção de modificações epigenética, e variações de subconjuntos de células. A Tabela 1 indica que o rendimento médio e qualidade de materiais a partir de cada um dos processos. A Figura 3 proporciona um exemplo de saída dos métodos de processamento de isolamento de ARN de leucócitos...

Descrevemos uma metodologia para o processamento de sangue total para obter uma variedade de componentes para análise posterior. Otimizamos um protocolo simplificado que permite o processamento simultâneo rápido e de alto rendimento de amostras de sangue total em um ambiente não clínico.

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um protocolo simplificado que permita o rápido processamento simultâneo de amostras de sangue total. Em um ambiente não clínico, o processamento de vacutainer é realizado de maneira sobreposta para permitir o isolamento eficiente de frações de alta qualidade de células mononucleares do sangue periférico D-N-A-R-N-A ou soro pbmc e frações residuais de plasma e glóbulos vermelhos. O processamento começa com a centrifugação do vacutaier sérico, remoção de uma alíquota de um frasco contendo vacutainer para centrifugação de isolamento de DNA dos tubos de fibra.Em seguida, pode ocorrer a conclusão do isolamento de DNA após o isolamento de DNA, isolamento de RNA derivado de leucócitos do vacutainer K dois EDTA. O sangue de cada vacutainer é passado através de um respectivo filtro e lavado com PBS, depois tratado com um agente estabilizador de RNA que retorna ao fial contendo vacutainer. O plasma residual é retirado e a camada mononuclear é lavada com PBS.Enquanto os tubos estão girando, os glóbulos vermelhos residuais são coletados e o soro separado é alíquota. Finalmente, os pbmc são preservados em meio de congelamento celular. Em última análise, frações de sangue fresco de alta qualidade podem ser produzidas dentro de duas horas após a coleta e todas as amostras prontas para ensaio podem estar disponíveis dentro de dois dias.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que os procedimentos podem ser realizados simultaneamente em um ambiente não clínico, produzindo assim material inicial em dois dias para uma infinidade de aplicações a jusante, incluindo análises de microarray epigenética em tempo real RTPCR e citometria de fluxo. Demonstrando o procedimento estará Amy Weckl, minha gerente de laboratório Para iniciar o processamento de amostras de sangue total. Certifique-se de que os tampões, a centrífuga e o bloco de calor foram preparados.Documente a hora da entrega do vacutainer na folha de rastreamento da amostra. Após o recebimento das amostras, documente o isolamento do soro. Hora de início no registro de amostras Inicie imediatamente o processamento centrifugando o vacutainer de soro de sete mililitros com o freio e a aceleração desligados.Usando um rotor de balde oscilante com tampas de aerossol por 20 minutos a 1300 GS quatro graus Celsius enquanto o vacutainer de soro está sendo centrifugado. Documente a hora de início do isolamento do DNA em uma coifa de cultura de duas células BSL. Inverta os recipientes de vácuo contendo o gel fial cinco vezes e adicione 200 microlitros de sangue total do topo de um dos vacutainer em cada uma das duas alíquotas de 20 microlitros de protease.Deixe os tubos de protease e microcentrífuga sanguínea no exaustor e continue até a centrifugação da chamada contendo recipientes de vácuo. Antes da centrifugação. Documente a hora de início do isolamento do PBMC, que deve ser dentro de duas horas após a coleta de sangue.Inverta a chamada FI contendo recipientes de vácuo já nos recipientes herméticos de aerossol de oito a 10 vezes. Em seguida, centrifugue o aspirador com a quebra e a aceleração por 30 minutos a 1600 Gs 22 graus Celsius. Retorne às amostras de isolamento de DNA no capô e adicione 200 microlitros de tampão al a cada um dos tubos de protease e microcentrífuga sanguínea.Tampe os tubos e remova-os do capô. Em seguida, vórtice-os por 15 segundos. Após o vórtice piscar imediatamente, gire as amostras.Prossiga com o isolamento do DNA conforme descrito no protocolo de texto que acompanha até que o DNA seja aludido da coluna sobre Ellucian. Agrupou o DNA das duas colunas por participante para um rendimento total de 800 microlitros por participante. Documente a hora de início do isolamento do RNA leucocitário.Perfure o septo de borracha do aspirador K two EDTA com um espigão de transferência. Guarde a bainha e a tampa de rosca para uso posterior após a montagem do sistema de tubos K two EDTA. Use a ponta de uma espátula de metal para desembainhar a agulha com segurança e insira a agulha em um tubo de coleta de sangue evacuado vazio de 10 mililitros.Inverta o conjunto do tubo receptor do filtro vacutainer K dois EDTA para completar a configuração Após a filtração e a lavagem com A PBS, retire três mililitros do agente estabilizador de RNA usando uma nova seringa de 10 mililitros. Lave o filtro certificando-se de que o agente estabilizador de RNA permaneça conectado. Em seguida, retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.Vede a entrada e a saída do filtro com a bainha e a tampa de rosca retidas do espigão de transferência e deixe o filtro saturado com o agente estabilizador de RNA. Armazene o filtro a menos 80 graus Celsius por pelo menos duas horas até que o tempo permita a conclusão do isolamento do RA. Assim que o vacutainer retornar ao capô BSL dois, remova a rolha e use uma pipeta sorológica para retirar 1,5 mililitros da camada superior de plasma sem se aproximar da camada mononuclear.Transfira o plasma dos dois vacutainer para um frasco criogênico de cinco mililitros. Em seguida, registre o volume coletado. Transferir o plasma restante e a camada mononuclear usando uma pipeta sorológica para um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, adicione um XPBS previamente preparado suficiente para elevar o volume total no tubo cônico para 15 mililitros. Tampe o tubo e inverta-o cinco vezes. Em seguida, centrifugue o tubo com a quebra e a aceleração por 15 minutos a 300 GS 22 graus Celsius.Retorne ao frasco contendo recipientes de vácuo no capô e colete os glóbulos vermelhos ou hemácias. Use uma pipeta pastier de cinco e três quartos de polegada para girar e soltar a parte externa da camada de gel de frasco e removê-la. Use uma pipeta sorológica para coletar e transferir as hemácias para um frasco criogênico de cinco mililitros.Em seguida, registre o volume. Em seguida, transfira os frascos criogênicos de plasma e hemácias para um recipiente de congelamento de taxa controlada e armazene-os a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas. Após 24 horas, transfira as amostras para uma caixa criogênica e devolva-as a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo.Quando a centrifugação estiver concluída, retorne o tubo cônico para a coifa e aspire o líquido, deixando 500 microlitros de PBS sem perturbar o pellet. Adicione um XPBS para trazer o volume para 10 mililitros e ressuspender o pellet. Tampe suavemente o tubo e inverta-o cinco vezes.Em seguida, centrifugue a amostra com o freio e a aceleração por 10 minutos a 300 GS 22 graus Celsius. Após a centrifugação, alíquota da camada superior de soro do vacutainer em dois frascos criogênicos de mililitros e documente o volume. Use quatro frascos criogênicos e alíquota de 200 microlitros no frasco criogênico.Um 1000 microlitros em um frasco criogênico dois. Em seguida, divida o volume restante em frascos criogênicos três e quatro. Transfira os frascos criogênicos para uma caixa criogênica e mantenha-os a 80 graus Celsius negativos para armazenamento a longo prazo.E documente a hora de início do freezer. Continue com o isolamento PBMC. Retornando as amostras à coifa após centrifugação, aspirar o máximo de sobrenadante possível sem perturbar o pellet.Suspendemos o pellet em 2,5 mililitros de PBMC. Médio. Adicione 2,5 mililitros de PBMC, meio de congelamento dois contendo DMSO e RPMI.Média para a solução celular previamente preparada e vórtice suavemente a amostra. Em seguida, alíquota de 10 microlitros da solução celular em um tubo de microcentrífuga. Adicione 10 microlitros de mancha azul de 0,4% no tubo de microcentrífuga e misture a solução pipetando várias vezes.Em seguida, pipete 10 microlitros da mistura em uma câmara de contagem de células. Deslize e coloque a lâmina no contador de células dentro de três minutos após a mistura. Aumente o zoom e concentre-se nas células.Em seguida, selecione contar células para obter a contagem A-P-B-M-C. Se o número viável de PBMC for superior a 3 milhões de células por mililitro, alíquota da amostra para um máximo de cinco frascos criogênicos a uma concentração de pelo menos 3 milhões de células por mililitro. Cada um documenta a contagem de células por frasco criogênico no registro de amostras.Consulte o protocolo de texto que acompanha como proceder se o número viável de PBMC estiver abaixo de 3 milhões de células por mililitro. Por fim, transfira os frascos criogênicos para um recipiente de congelamento de taxa controlada e coloque-os a 80 graus Celsius negativos por pelo menos 24 horas. Após 24 horas, transfira os frascos criogênicos para uma caixa criogênica e coloque a caixa na fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.Documente a hora de início do freezer no registro de amostras. Os métodos de isolamento de RNA leucocitário e processamento de filtro produziram esta imagem de gel resultante da eletroforese capilar. Duas bandas distintas foram produzidas com degradação mínima representando ATT s e RNA ribossômico 28 s.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que manter registros precisos é fundamental. Recomendamos o desenvolvimento de um banco de dados para armazenar todas as informações do frasco criogênico, incluindo volume, concentração, qualidade, código de barras e local de armazenamento desde o início. E mais recomendações sobre a organização da amostra podem ser encontradas no protocolo de texto.

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Medicine

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Este vídeo demonstra a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) de alta qualidade por meio da triagem da contagem de plaquetas, coleta e centrifugação de sangue e isolamento de plaquetas. Este PRP é usado em aplicações terapêuticas para regeneração e cicatrização de tecidos.

Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de sangue periférico humano

Leucócitos e plaquetas do sangue pode ser usado como um marcador de saúde bioenergética geral de um indivíduo e assim têm potencial para controlar processos patológicos e o impacto de tratamentos. Aqui nós descrevemos um método para isolar e medir a função mitocondrial e do burst oxidativo nestas células.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

A Fibrina Rica em Plaquetas Leucocitárias (L-PRF) representa uma preparação aprovada pela FDA de concentrados de plaquetas autólogos que possui arquitetura única de fibrina, plaquetas enriquecidas e fatores de crescimento abundantes. Aqui, apresentamos um protocolo para geração de L-PRF em consultório, bem como avaliamos suas propriedades mecânicas, incluindo testes uniaxiais e testes de resistência à retenção de sutura.

Caracterização de leucócito-rico em plaquetas de fibrina, A Novel Biomaterial

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Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Este protocolo detalha a preparação clinicamente implementável de biosamples de PBMC e plasma de alta qualidade no local do ensaio clínico que pode ser usado para análise de biomarcadores translacionais.

Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

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Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

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Isolamento de neutrófilos humanos de whole blood e buffy coats

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

Este protocolo detalha um método compatível com automação de alto rendimento para isolar células mononucleares do sangue periférico humano para biobancos e outros fins.

Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

Aprenda um protocolo otimizado para fracionamento rápido de sangue total em configuração comunitária. Este método permite o isolamento simultâneo de DNA, RNA, plasma e células mononucleares de sangue periférico com alta qualidade.

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária (Vídeo) | JoVE Journal

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

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