Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um protocolo simplificado que permita o rápido processamento simultâneo de amostras de sangue total. Em um ambiente não clínico, o processamento de vacutainer é realizado de maneira sobreposta para permitir o isolamento eficiente de frações de alta qualidade de células mononucleares do sangue periférico D-N-A-R-N-A ou soro pbmc e frações residuais de plasma e glóbulos vermelhos. O processamento começa com a centrifugação do vacutaier sérico, remoção de uma alíquota de um frasco contendo vacutainer para centrifugação de isolamento de DNA dos tubos de fibra.

Em seguida, pode ocorrer a conclusão do isolamento de DNA após o isolamento de DNA, isolamento de RNA derivado de leucócitos do vacutainer K dois EDTA. O sangue de cada vacutainer é passado através de um respectivo filtro e lavado com PBS, depois tratado com um agente estabilizador de RNA que retorna ao fial contendo vacutainer. O plasma residual é retirado e a camada mononuclear é lavada com PBS.

Enquanto os tubos estão girando, os glóbulos vermelhos residuais são coletados e o soro separado é alíquota. Finalmente, os pbmc são preservados em meio de congelamento celular. Em última análise, frações de sangue fresco de alta qualidade podem ser produzidas dentro de duas horas após a coleta e todas as amostras prontas para ensaio podem estar disponíveis dentro de dois dias.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que os procedimentos podem ser realizados simultaneamente em um ambiente não clínico, produzindo assim material inicial em dois dias para uma infinidade de aplicações a jusante, incluindo análises de microarray epigenética em tempo real RTPCR e citometria de fluxo. Demonstrando o procedimento estará Amy Weckl, minha gerente de laboratório Para iniciar o processamento de amostras de sangue total. Certifique-se de que os tampões, a centrífuga e o bloco de calor foram preparados.

Documente a hora da entrega do vacutainer na folha de rastreamento da amostra. Após o recebimento das amostras, documente o isolamento do soro. Hora de início no registro de amostras Inicie imediatamente o processamento centrifugando o vacutainer de soro de sete mililitros com o freio e a aceleração desligados.

Usando um rotor de balde oscilante com tampas de aerossol por 20 minutos a 1300 GS quatro graus Celsius enquanto o vacutainer de soro está sendo centrifugado. Documente a hora de início do isolamento do DNA em uma coifa de cultura de duas células BSL. Inverta os recipientes de vácuo contendo o gel fial cinco vezes e adicione 200 microlitros de sangue total do topo de um dos vacutainer em cada uma das duas alíquotas de 20 microlitros de protease.

Deixe os tubos de protease e microcentrífuga sanguínea no exaustor e continue até a centrifugação da chamada contendo recipientes de vácuo. Antes da centrifugação. Documente a hora de início do isolamento do PBMC, que deve ser dentro de duas horas após a coleta de sangue.

Inverta a chamada FI contendo recipientes de vácuo já nos recipientes herméticos de aerossol de oito a 10 vezes. Em seguida, centrifugue o aspirador com a quebra e a aceleração por 30 minutos a 1600 Gs 22 graus Celsius. Retorne às amostras de isolamento de DNA no capô e adicione 200 microlitros de tampão al a cada um dos tubos de protease e microcentrífuga sanguínea.

Tampe os tubos e remova-os do capô. Em seguida, vórtice-os por 15 segundos. Após o vórtice piscar imediatamente, gire as amostras.

Prossiga com o isolamento do DNA conforme descrito no protocolo de texto que acompanha até que o DNA seja aludido da coluna sobre Ellucian. Agrupou o DNA das duas colunas por participante para um rendimento total de 800 microlitros por participante. Documente a hora de início do isolamento do RNA leucocitário.

Perfure o septo de borracha do aspirador K two EDTA com um espigão de transferência. Guarde a bainha e a tampa de rosca para uso posterior após a montagem do sistema de tubos K two EDTA. Use a ponta de uma espátula de metal para desembainhar a agulha com segurança e insira a agulha em um tubo de coleta de sangue evacuado vazio de 10 mililitros.

Inverta o conjunto do tubo receptor do filtro vacutainer K dois EDTA para completar a configuração Após a filtração e a lavagem com A PBS, retire três mililitros do agente estabilizador de RNA usando uma nova seringa de 10 mililitros. Lave o filtro certificando-se de que o agente estabilizador de RNA permaneça conectado. Em seguida, retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.

Vede a entrada e a saída do filtro com a bainha e a tampa de rosca retidas do espigão de transferência e deixe o filtro saturado com o agente estabilizador de RNA. Armazene o filtro a menos 80 graus Celsius por pelo menos duas horas até que o tempo permita a conclusão do isolamento do RA. Assim que o vacutainer retornar ao capô BSL dois, remova a rolha e use uma pipeta sorológica para retirar 1,5 mililitros da camada superior de plasma sem se aproximar da camada mononuclear.

Transfira o plasma dos dois vacutainer para um frasco criogênico de cinco mililitros. Em seguida, registre o volume coletado. Transferir o plasma restante e a camada mononuclear usando uma pipeta sorológica para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, adicione um XPBS previamente preparado suficiente para elevar o volume total no tubo cônico para 15 mililitros. Tampe o tubo e inverta-o cinco vezes. Em seguida, centrifugue o tubo com a quebra e a aceleração por 15 minutos a 300 GS 22 graus Celsius.

Retorne ao frasco contendo recipientes de vácuo no capô e colete os glóbulos vermelhos ou hemácias. Use uma pipeta pastier de cinco e três quartos de polegada para girar e soltar a parte externa da camada de gel de frasco e removê-la. Use uma pipeta sorológica para coletar e transferir as hemácias para um frasco criogênico de cinco mililitros.

Em seguida, registre o volume. Em seguida, transfira os frascos criogênicos de plasma e hemácias para um recipiente de congelamento de taxa controlada e armazene-os a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas. Após 24 horas, transfira as amostras para uma caixa criogênica e devolva-as a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo.

Quando a centrifugação estiver concluída, retorne o tubo cônico para a coifa e aspire o líquido, deixando 500 microlitros de PBS sem perturbar o pellet. Adicione um XPBS para trazer o volume para 10 mililitros e ressuspender o pellet. Tampe suavemente o tubo e inverta-o cinco vezes.

Em seguida, centrifugue a amostra com o freio e a aceleração por 10 minutos a 300 GS 22 graus Celsius. Após a centrifugação, alíquota da camada superior de soro do vacutainer em dois frascos criogênicos de mililitros e documente o volume. Use quatro frascos criogênicos e alíquota de 200 microlitros no frasco criogênico.

Um 1000 microlitros em um frasco criogênico dois. Em seguida, divida o volume restante em frascos criogênicos três e quatro. Transfira os frascos criogênicos para uma caixa criogênica e mantenha-os a 80 graus Celsius negativos para armazenamento a longo prazo.

E documente a hora de início do freezer. Continue com o isolamento PBMC. Retornando as amostras à coifa após centrifugação, aspirar o máximo de sobrenadante possível sem perturbar o pellet.

Suspendemos o pellet em 2,5 mililitros de PBMC. Médio. Adicione 2,5 mililitros de PBMC, meio de congelamento dois contendo DMSO e RPMI.

Média para a solução celular previamente preparada e vórtice suavemente a amostra. Em seguida, alíquota de 10 microlitros da solução celular em um tubo de microcentrífuga. Adicione 10 microlitros de mancha azul de 0,4% no tubo de microcentrífuga e misture a solução pipetando várias vezes.

Em seguida, pipete 10 microlitros da mistura em uma câmara de contagem de células. Deslize e coloque a lâmina no contador de células dentro de três minutos após a mistura. Aumente o zoom e concentre-se nas células.

Em seguida, selecione contar células para obter a contagem A-P-B-M-C. Se o número viável de PBMC for superior a 3 milhões de células por mililitro, alíquota da amostra para um máximo de cinco frascos criogênicos a uma concentração de pelo menos 3 milhões de células por mililitro. Cada um documenta a contagem de células por frasco criogênico no registro de amostras.

Consulte o protocolo de texto que acompanha como proceder se o número viável de PBMC estiver abaixo de 3 milhões de células por mililitro. Por fim, transfira os frascos criogênicos para um recipiente de congelamento de taxa controlada e coloque-os a 80 graus Celsius negativos por pelo menos 24 horas. Após 24 horas, transfira os frascos criogênicos para uma caixa criogênica e coloque a caixa na fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

Documente a hora de início do freezer no registro de amostras. Os métodos de isolamento de RNA leucocitário e processamento de filtro produziram esta imagem de gel resultante da eletroforese capilar. Duas bandas distintas foram produzidas com degradação mínima representando ATT s e RNA ribossômico 28 s.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que manter registros precisos é fundamental. Recomendamos o desenvolvimento de um banco de dados para armazenar todas as informações do frasco criogênico, incluindo volume, concentração, qualidade, código de barras e local de armazenamento desde o início. E mais recomendações sobre a organização da amostra podem ser encontradas no protocolo de texto.