Name: Um método de Nodoso Gânglios Injecção em ratos Sprague-Dawley (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a realizar injeções locais de neuroquímicos nos gânglios nodosos de ratos Sprague-Dawley para estudar a modulação da atividade do nervo vago. Este método permite investigar respostas fisiológicas como apneia.

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Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).

Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago animal Institucional. As experiências aqui descritas são experiências agudas não-sobrevivência, e não houve uso de pomada. Manutenção de condições estéreis só ocorre quando os instrumentos cirúrgicos são lavados com etanol 70% em DIH 2 O. Sacrifício de ratos no final da experiência ocorreu através de sobredosagem de IV cetamina / xilazina. 1. Preparação de Instrumentos e Produtos Químicos <ol><li> Preparar a solução de estoque de 0,05 M de 5-HT de HCl em PBS. Depois dilui-se estoque com PBS a uma concentração final de 5-HT de 0,203 mM. </li><li> Diluir dronabinol em óleo de sésamo com uma concentração de 20 ug / uL. </li><li> Corte de 20 cm de comprimento de polietileno (PE) -50 tubagem (ID 0,58 milímetros, 0,965 milímetros OD). Em uma extremidade do tubo, corte uma ponta bisel com uma tesoura, e na outra ponta quadrada, inserir uma agulha de 23 g. Ligue este 23 g agulha para um 1 mlseringa, e encha-o com 0,3 ml de 50 u / ml de heparina. </li><li> Corte quatro pedaços de fio de seda 4-0 trançado e definido para o lado. </li><li> Esterilizar tesouras cirúrgicas, 2 fórceps Graefe curvas, e 3 grampos de micro com etanol a 70% em DIH 2 O. </li></ol> 2. O cateterismo de veia femoral Protocolo para o cateterismo é modificado a partir Jespersen et al 21. <ol><li> Anestesiar uma ratazana Sprague-Dawley com intraperitoneal (IP) de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Aperte o dedo do pé do rato e observar qualquer movimento para confirmar um nível adequado de anestesia. Raspar o aspecto ventral da coxa esquerda, e do aspecto ventral do pescoço. Se necessário pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional do local, aplicar pomada para evitar o ressecamento. </li><li> Rat seguro em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica. Utilize uma tesoura cirúrgica para cortar a pele na coxa posterior esquerda. </li><li> Utilizando uma pinça, conduta dissectio contuson do músculo superficial para expor a veia femoral. Utilizar as pinças para separar a veia a partir da artéria femoral, e colocar dois segmentos em torno da veia femoral. </li><li> Use a pinça Graefe curvas para puxar-up da veia para parar o fluxo de sangue. Usando uma seringa de agulha G 22, por punção da veia femoral e, em seguida, insira a ponta chanfrada do tubo PE-50 na veia. </li><li> Verificar se o tubo PE-50 foi inserida correctamente por retracção do êmbolo da seringa. O sangue deve ser visto de entrar no tubo de PE-50. Amarre 2 nós ao redor da veia e PE-50 tubos usando as duas threads. </li></ol> 3. 5-HT induzido por Apnea via IV Infusion <ol><li> Coloque um medidor de tensão piezoelétrico em torno do rato para medir a respiração. </li><li> Altere as configurações para o nível de amplificação do amplificador eletrônico via software amplificador no computador: para amplificar (100x) e filtro passa-banda (10/01 Hz), os sinais respiratórios obtidos a partir do medidor de tensão, ajuste &quot;filtro highpas&quot; at &amp; #8220; AC @ 1 HZ &quot;e&quot; Filter Lowpass &quot;at&quot; 10 Hz &quot;, e definir a amplificação através da introdução de&quot; 10 &quot;para o&quot; ganho inicial &quot;e&quot; 100 &quot;para&quot; Total Gain &quot;.. </li><li> Altere as configurações de taxa de amostragem, abrindo &quot;Entrada Analógica&quot; via software de gravação no computador. Para digitalizar (500 taxa de amostragem Hz) usando um conversor analógico-digital, &quot;sample&quot; at &quot;1.000 Hz&quot; e &quot;pular&quot; todos os outros pontos de gravação por &quot;1&quot; (taxa de amostragem eficaz 500 Hz), e depois gravar o sinal usando o software de gravação. </li><li> Remover a seringa de 1 ml a partir do cateter e inserir uma seringa de vidro de 500 mL cheio com precisão de 0,203 mM de 5-HT no interior do cateter. </li><li> Coloque a 500 ul seringa de vidro de precisão em uma bomba de infusão. Infundir 12,5 ug / kg por 350 ul / kg de uma solução de 5-HT a uma taxa de 63 ml / hr. Executar várias infusões e observar apnéia em rato, que é visto umsa pausa na respiração (≥ 2,5 seg) nos sinais respiratórios gravados no monitor do computador. </li><li> Antes de prosseguir com a cirurgia de pescoço, monitorar o padrão respiratório e verificar se há reflexo dor de toe pitada no rato. Se a respiração for irregular, ou se existe um reflexo dor de aperto do dedo do pé, administrar IP cetamina / xilazina (100 mg / kg: 5 mg / kg) e, em seguida, voltar a confirmar a um nível adequado de anestesia. </li></ol> 4. Neck Surgery para expor Nodoso Ganglia <ol><li> Rat seguro em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica. Faça um corte longitudinal mediana usando uma tesoura cirúrgica no pescoço. </li><li> Usando dissecção romba no músculo platisma (usando dois micro grampos para manter esse músculo clara do sítio cirúrgico), expor os músculos sternohyoideus e omohyoideus. Separe esses músculos para expor a artéria carótida interna e um de seus ramos, a artéria pterigopalatina. </li><li> Observe o nervo vago, uma vez que corre ao longo da artéria carótida interna e, em seguida, ao longo th<html> e pterygopalatine artéria. Observe como o nervo vago e artéria pterigopalatina, juntamente com o nervo glossofaríngeo (IX nervo craniano) e do nervo acessório (XI nervo craniano), digite o forame lacerados posteriores na base do crânio. </li><li> Observe que o gânglio nodoso é exibido como um inchaço do nervo vago direito antes de entrar no forame posterior dilacerado. Note também que os ramos da faringe e da laringe nervosas saem os aspectos anterior e posterior, respectivamente, do gânglio nodoso. 5 </li><li> Usando a pinça Graefe, separar o nervo vago a partir das artérias, e coloque um pedaço de fio ao redor do nervo vago. Coloque um grampo na linha para aplicar uma leve tensão no nervo vago, e limpar o gânglio nodoso de qualquer tecido conjuntivo para proporcionar menor resistência ao injetar. </li><li> Repita apnéia 5-HT induzido conforme previsto no ponto 3 para confirmar que nenhum dano foi feito para o gânglio nodoso. </li></ol>itle &quot;&gt; 5. Intranodose Ganglia Injeção de Dronabinol <ol><li> Encha a 10 ul precisão gastight seringa de vidro afixado com um 28 g de meia polegada agulha de seringa feito por encomenda com um 35 ° chanfradas ponta com 5 mL de dronabinol em óleo de gergelim. </li><li> Coloque um grampo micro no segmento de aplicar uma leve tensão no nervo vago, e perfurar o gânglio nodoso tomando cuidado para não perfurar através dele. Pressione a seringa lentamente (≥ 60 seg) para injetar todo o conteúdo da seringa. Note-se que alguns dos conteúdos de seringas vai vazar para fora do gânglio. </li><li> Apneia Repita 5-HT-induzida como indicado na seção 3. </li></ol>

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<li>Barann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+by+cannabinoids+of+human+5-HT3A+receptors%3A+probable+involvement+of+an+allosteric+modulatory+site%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site.</a> Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).</li>
<li>Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+stimulation%3A+from+epilepsy+to+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).</li>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos críticos para o sucesso da injecção de neurotransmissores na gânglios nodosos são: 1) a identificação e a limpeza do tecido conjuntivo fora do gânglios nodosos; 2) confirmando a integridade do gânglio nodoso antes da injecção; 3) e usando uma agulha de calibre pequeno para injectar delicadamente em, mas não completamente, através de punção, os gânglios nodosos. O nervo vago inerva muitos órgãos no pescoço e abdômen, e transmite informações importantes, tais como a freqüência cardía...

A sinalização aferente através do nervo vago (nervo craniano X) transmite informações viscerais gerais importantes para o sistema nervoso central (SNC) a partir de receptores baro, quimio, hepático, ósseo, cardíaco, pulmonar e gástrico localizados nos órgãos do abdômen e tórax. O nervo vago comunica informações de estímulos como frequência cardíaca, pressão arterial, irritação broncopulmonar e distensão gastrointestinal ao núcleo do trato solitário (NTS) da medula. Os corpos celulares dos neurônios pseudounipolares do nervo vago estão localizados nos gânglios nodoso e petroso, dos quais a maioria é encontrada nos primeiros. As células ganglionares Nodose contêm uma riqueza de receptores para aminoácidos, monoaminas, neuropeptídeos e outros neuroquímicos que, quando ativados, podem modificar a atividade aferente do nervo vago. 1 Numerosas inervações dos nervos vagos aferentes, juntamente com a diversidade de receptores localizados nos gânglios nodose, ilustram a importância biológica desse nervo craniano, e drogas sistêmicas que não atravessam o SNC direcionadas a receptores nos gânglios nodose podem ser usadas para tratar várias doenças, como apneia do sono, doença do refluxo gastroesofágico, ou tosse crônica. 2-4
A facilidade de acesso aos gânglios nodosos se presta à manipulação experimental por incisão longitudinal na linha média feita no pescoço. O nervo vago emerge do forame lacerado posterior na base do crânio e imediatamente exibe um inchaço do nervo que é o gânglio nodose. O gânglio nodose é facilmente reconhecível devido a dois ramos nervosos que surgem dele: anteriormente o ramo faríngeo; e ramo laríngeo superior posterior. 5 Manipulações experimentais anteriores dos gânglios nodosos envolveram registros eletrofisiológicos,6 injeções de compostos imuno-histoquímicos ou imunofluorescentes para traçados nervosos,7-10 superfusão ou injeções de neuroexcitotoxinas,11-13 injeções de vírus adeno-associados para receptores knockdown,14,15 e injeções de neuroquímicos específicos do receptor para alterar a atividade do nervo vago. 16,17
As injeções sistêmicas de neuroquímicos são problemáticas, pois o tratamento sistêmico afeta os sistemas nervoso periférico e central. Assim, o tratamento sistêmico não isola o efeito dos neuroquímicos na atividade do nervo vago aferente. Este protocolo descreve um método usando equipamentos prontamente disponíveis de injeções intranodose no rato Sprague-Dawley que modula a atividade do nervo vago sem afetar o sistema nervoso central. A estimulação dos receptores de serotonina tipo 3 (5-HT3) nos gânglios nodosos por infusão intravenosa (IV) de serotonina (5-HT) induz o reflexo de Bezold-Jarisch, uma resposta vagal trifecta de bradicardia, hipotensão e apneia, que pode ser abolida pela vagatomia supranodose. 11,17-19 A apneia é facilmente medida pela colocação de um transdutor respiratório ao redor do abdome do rato. 17,18 Os canabinóides diminuem a corrente induzida por 5-HT nas células dos gânglios nodosos,20 e as injeções intranodose de dronabinol nos gânglios atenuam a apneia induzida por 5-HT.

<table><tbody><tr><td>5-HT HCl</td><td>MP Biomedicals</td><td>215376591</td><td>12.5 &micro; g/kg por 350 &micro; l/kg</td></tr><tr><td>Dronabinol (Marinol) 10 mg Cápsulas (80 &micro; g/&micro; l)</td> <td>AbbVie</td><td>NDC 0051-0023-21</td><td>Diluir com óleo de gergelim para 20 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Óleo de Gergelim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno-50</td><td>BD</td><td>Intramedic 427411</td><td>Encomendado da VWR (Cat. # 63019-047)</td></tr><tr><td>Graefe Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5138</td><td>Dois são necessários</td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7441</td><td>Três são necessários</td></tr><tr><td>Medidor de Tensão Piezoelétrico</td><td>Ambu</td><td>813255-100</td><td></td></tr><tr><td>Subsistemas USB de Aquisição de Dados</td><td>DataWave Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sciworks Experimenter Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyberAmp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 500 &micro; l, Modelo 1750 TLL</td><td>Seringa Hamilton Company</td><td>81220</td><td></td></tr><tr><td>, 10 &micro; l, Modelo 1801 RN</td><td>7659-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha, 28 G, Cubo Pequeno RN</td><td>7803-02</td><td>Estilo de Ponta 4, Ângulo 35, Comprimento 0.5 in</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de nodoso gânglios injecção em ratos sprague-dawley

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

A sinalização aferente através do nervo vago transmite informações viscerais gerais importantes para o sistema nervoso central a partir de diversos receptores localizados nos órgãos do abdômen e tórax. O nervo vago comunica informações de estímulos como frequência cardíaca, pressão arterial, irritação broncopulmonar e distensão gastrointestinal ao núcleo do trato solitário da medula. Os corpos celulares do nervo vago estão localizados nos gânglios nodoso e petroso, dos quais a maioria está localizada nos primeiros. Os gânglios nodosos contêm uma riqueza de receptores para aminoácidos, monoaminas, neuropeptídeos e outros neuroquímicos que podem modificar a atividade aferente do nervo vago. A modificação dos aferentes vagais por meio de tratamentos medicamentosos periféricos sistêmicos direcionados aos receptores nos gânglios nodose tem o potencial de tratar doenças como apneia do sono, doença do refluxo gastroesofágico ou tosse crônica. O protocolo aqui descreve um método de injeção de neuroquímicos diretamente no gânglio nodose. A injeção de neuroquímicos diretamente nos gânglios nodosos permite o estudo dos efeitos apenas nos corpos celulares que modulam a atividade nervosa aferente e evita a complicação do envolvimento do sistema nervoso central, como visto no tratamento neuroquímico sistêmico. Usando equipamentos prontamente disponíveis e baratos, as injeções intranodosas de gânglios são facilmente feitas em ratos Sprague-Dawley anestesiados.

A Figura 1 representa gravação respiração amostra em ratos que tinham infusão de 5-HT para provocar apneia antes e depois da injecção dos gânglios intranodose de dronabinol. 5-HT activa 5-HT3 sobre os gânglios nodosos que contribuem para o reflexo de Bezold-Jarisch de bradicardia, hipotensão, e apneia. 11,17-19 injecções gânglios Intranodose dronabinol de activar os receptores CB inibitórios, ou modula alostericamente 5-HT 3 receptores que inibem a excitação de 5-HT-indu...

A sinalização vagal aferente transmite informações importantes ao sistema nervoso central a partir de receptores localizados em órgãos do abdômen e tórax. Os gânglios nodosos dos nervos vagos contêm muitos tipos de receptores que modulam a atividade vagal. Este protocolo descreve um método de injeções locais de neuroquímicos nos gânglios nodosos.

Um método de Nodoso Gânglios Injecção em ratos Sprague-Dawley

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar injeções locais de neuroquímicos diretamente nos gânglios do laço para estudar o efeito dos neuroquímicos no comportamento fisiológico relacionado ao nervo vago. Isso é feito primeiro realizando uma cirurgia no pescoço para visualizar os gânglios do laço e os nervos vagos. O segundo passo é isolar e limpar os gânglios do laço dos tecidos conjuntivos.Em seguida, injete o neuroquímico de interesse nos gânglios sem dose. A etapa final é medir os efeitos fisiológicos e comportamentais da modulação da atividade do nervo vago por injeções locais de neuroquímicos nos gânglios sem dose. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como se os neuroquímicos administrados localmente modulam ou não a atividade do nervo vago.Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque são necessárias habilidades motoras muito finas para injetar nos gânglios sem dose. A prática é fundamental. Primeiro, prepare uma solução estoque de cloridrato de serotonina 0,05 molar em PBS.Em seguida, diluir a solução-mãe com PBS até uma concentração final de serotonina milimolar ponto 203, em seguida, diluir o dronabin

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Cheah, M., et al. Injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal como modelo para regeneração sensorial do axônio. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar uma suspensão viral nos gânglios da raiz dorsal (DRGs) e induzir uma lesão axonal controlada por meio de um esmagamento da raiz dorsal em um rato anestesiado. O protocolo envolve a exposição dos DRGs, a entrega de um vetor viral promotor de crescimento para...

Modelagem da regeneração sensorial do axônio em um rato usando injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal

A injeção direta no nervo óptico do rato é útil para a pesquisa regenerativa. Demonstramos uma técnica minimamente invasiva para injeção direta em um nervo óptico de rato que não envolve a abertura do crânio. Usando este método, as complicações cirúrgicas são minimizadas e a recuperação é mais rápida.

Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

Este protocolo apresenta o uso de uma injeção de gânglio da raiz dorsal (DRG) com um vetor viral e uma lesão concomitante por esmagamento da raiz dorsal em um rato adulto como modelo para estudar a regeneração sensorial do axônio. Este modelo é adequado para investigar o uso da terapia gênica para promover a regeneração sensorial do axônio.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Nós descrevemos um método para laminotomy em suínos que fornece acesso aos gânglios lombares raiz dorsal (DRG) para injeção intraganglionic. Progresso de injeção é monitorado no intraoperatório e histologicamente confirmado acima de 21 dias após a cirurgia. Este protocolo pode ser usado para futuros estudos pré-clínicos envolvendo injeção DRG.

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Apresentamos um protocolo para injeção direta do nervo vago em ratos, permitindo a administração do medicamento diretamente no nervo sem complicações pós-injeção. Este método se aplica a estudos neurológicos pré-clínicos envolvendo manipulação do sistema nervoso autônomo. Pode ser usado para injeção direta de nervos para outros nervos em ratos e outras espécies, com as modificações necessárias.

Protocolo de injeção direta do nervo vago para ratos

Este protocolo descreve uma técnica única usando uma abordagem transconjuntival para acessar o nervo óptico de rato para injeções.

Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

Aprenda a realizar injeções locais de neuroquímicos nos gânglios nodosos de ratos Sprague-Dawley para estudar a modulação da atividade do nervo vago. Este método permite investigar respostas fisiológicas como apneia.

Um método de Nodoso Gânglios Injecção em ratos Sprague-Dawley

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