Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

O objetivo geral deste procedimento é usar a abordagem de montagem de Gibson para criar construções de DNA grandes e complexas que combinam segmentos curtos e longos de várias fontes de DNA diferentes. Primeiro, projete computacionalmente a sequência completa de nucleotídeos dos plasmídeos e, em seguida, projete conjuntos de primers sobrepostos. Os próximos modelos de DNA para a reação de montagem são amplificados por PCR.

Em seguida, é realizada uma purificação dos produtos de PCR. A etapa final é a transformação da reação de montagem dos plasmídeos resultantes e a verificação do clone do plasmídeo. Em última análise, a reação de montagem de Gibson é usada para desenvolver em paralelo plasmídeos que contêm versões marcadas com bandeira do tipo selvagem e proteínas CSTF 64 mutantes sob a regulação transcricional do promotor alfa do fator de alongamento humano um.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o DNA Corning tradicional, é que ela pode criar em paralelo, semelhantes em design, tipo selvagem e plasmídeos mutantes sem etapas sequenciais de Corning. Projete uma sequência contínua de nucleotídeos para representar o plasmídeo final. Agora liste os plasmídeos e fragmentos de DNA reais que serão usados como modelos em fragmentos de DNA de ordem PCR que não estão prontamente disponíveis, como diferentes combinações de tags e promotores como fragmentos de DNA de fita dupla sintéticos simples ou múltiplos.

Em seguida, divida a sequência contínua de nucleotídeos da construção final em fragmentos de DNA adequados para PCR. Confirme se os fragmentos correspondem aos plasmídeos disponíveis e aos fragmentos de DNA sintético. Evite fragmentos de DNA menores que 200 nucleotídeos.

Ao lado de acessar a ferramenta de geração de primer, selecione o menu definir preferências na janela pop-up alterar configurações de montagem Gibson. Selecione a guia alterar pré-requisitos e, em seguida, selecione o menu de construção de construção para inserir os fragmentos de DNA divididos na ferramenta de geração de primer sequencialmente dos cinco primos para os três primos. Abra a janela de entrada de vetor ou inserção de fragmento, cole o primeiro fragmento de DNA que representa as cinco extremidades principais do DNA vetorial no formato A rápido e nomeie esse fragmento de DNA.

Escolha a maneira apropriada de obter o fragmento de DNA. Em seguida, clique na guia continuar. Se houver necessidade de adicionar nucleotídeos extras ou locais de restrição na junção da construção final, abra o fragmento de adição e inserção na janela de montagem nas áreas espaçadoras do primer dianteiro ou reverso.

Insira os nucleotídeos extras ou locais de restrição para apenas um dos fragmentos de DNA. Em seguida, clique na guia concluído. Repita para todos os fragmentos até que a construção seja concluída.

Selecione o menu exibir primers e revise as sequências de primers. Repita também para todas as construções, vetores, backbones e inserções ou para fragmentos de DNA diferentes. Diluir os primers de PCR a 10 micromolares em água ou tampão.

Em seguida, dilua todos os modelos de DNA e DNAs sintéticos de fita simples para os PCRs para um nanograma por microlitro em água. Monte as reações de PCR à temperatura ambiente combinando 2,5 microlitros de 10 micromolares de cada primer. Um microlitro de um nanograma por microlitro de fragmento de DNA molde 25 microlitros de quente.

Comece a revisar a DNA polimerase e 19 microlitros de água. Misture o tubo com movimentos suaves e colete as gotículas de líquido por uma breve centrifugação. Amplificar simultaneamente em tubos separados, os fragmentos de DNA de tamanho semelhante de acordo com as recomendações para a DNA polimerase utilizada.

Realize 25 a 28 ciclos de PCR ou determine o número de ciclos que produzem rendimento de DNA suficiente. Resolva cinco microlitros da PCR usando eletroforese em gel AROS padrão. Verifique se uma única banda de DNA representando o produto de PCR é visível.

Determine o tamanho e a quantidade relativa dos fragmentos de DNA usando os padrões de peso molecular do DNA, se necessário, repita a PCR para obter uma quantidade suficiente de fragmentos de DNA. Transfira os PCRs pré-digeridos com tubos DPN de um a 1,5 mililitro e adicione 81 microlitros de esferas magnéticas de purificação de DNA a cada tubo. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos.

Coloque os tubos no coletor magnético por dois minutos. Agora, descarte o líquido claro. Lave duas vezes com 200 microlitros de etanol a 80% por 30 segundos.

Em seguida, ressuspenda as esferas secas em 10 microlitros de cloridrato de tris 10 milimolares pH 8,0 Após dois minutos, gire brevemente e posicione os tubos no coletor magnético por dois minutos. Remova 8,5 a 10 microlitros da solução transparente e coloque-a em um novo tubo pré-rotulado. Determinar a concentração dos fragmentos de ADN por espectroscopia UV.

Utilizar pelo menos 100 nanogramas de fragmento de ADN que represente a estrutura do vector ou o fragmento de ADN que transporta o marcador selectivo. Calcule o excesso molar triplo para os fragmentos de DNA que serão usados como inserções. Misture as quantidades calculadas de fragmentos de DNA em um tubo de PCR.

Em seguida, ajuste o volume para 10 microlitros. Adicione 10 microlitros da mistura master de montagem Gibson. Incube a reação a 50 graus Celsius em um termociclador de PCR.

Prossiga com a transformação do produto de montagem e coli incompetente ou congele os produtos a menos 20 graus Celsius até que seja necessário. Siga o procedimento de transformação que acompanha as células químicas ou eletrocompetentes. Geralmente use dois microlitros da reação de montagem por reação de transformação.

Finalmente, confirme o sucesso da clonagem de DNA por sequenciamento de DNA usando primers específicos ou padrão. Analise os dados de sequenciamento quanto à precisão. Este experimento foi projetado para clonar a proteína 64 do fator de estimulação de clivagem e também o CSTF 64 mutante.

Proteínas fundidas em uma etiqueta de três x sob a regulação expressiva do promotor alfa HE F1. Um plasmídeo contendo HE F1 alfa seguido por uma etiqueta de três x flag não estava disponível para nós. No entanto, os seguintes plasmídeos estavam disponíveis.

PC DNA 3.1 M assobia HF um alfa contendo plasmídeo e camundongo CSTF 64 plasmídeos. Toda a sequência para a construção foi montada usando os aplicativos de edição de nucleotídeos e texto. Posteriormente, a sequência foi dividida em quatro partes convenientes correspondentes aos DNAs de plasmídeo disponíveis.

Os quatro fragmentos de DNA para as reações de montagem foram amplificados por PCR. Os plasmídeos resultantes de clones individuais foram amplificados e analisados por digestão enzimática de restrição para montagem adequada no vetor de DNA pc. Uma vez dominada a técnica de montagem, incluindo plasmídeo e design primário, a PCR subsequente e a verificação de comunicação podem ser realizadas dentro de cinco dias, excluindo o tempo para síntese e entrega de DNA primário e sintético.