Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão de antígenos de superfície e intracelulares em células neurais usando citometria de fluxo. Isso é feito primeiro colhendo células neurais de culturas in vitro ou tecido neural primário. Em seguida, uma coloração intracelular não específica opcional é aplicada às células.

Em seguida, os antígenos de superfície desejados são imediatamente marcados com um anticorpo primário, enquanto os antígenos intracelulares desejados são marcados após a fixação e permeação celular. Em última análise, os resultados podem ser obtidos usando a análise de citometria de fluxo para co-expressão dos antígenos de superfície em subpopulações neurais específicas de interesse, conforme definido pela marcação intracelular. Este protocolo demonstrará como preparar células neurais derivadas de cultura de tecidos para interrogação de antígenos de superfície e intracelulares com citometria de fluxo multicolorida.

Para começar, colha as células neurais aderentes cultivadas em frascos T 75, primeiro lavando suavemente as células uma vez com cinco mililitros de PBS livre de magnésio e cálcio à temperatura ambiente. Em seguida, retire as células do frasco adicionando três mililitros de substituição de tripsina e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos. Extinguir a digestão enzimática adicionando seis mililitros de tampão de fluxo depois de soltar os aglomerados de células pipetando a suspensão celular para cima e para baixo algumas vezes, transfira toda a suspensão celular para um tubo novo de 15 mililitros para isolar as células.

Coloque o tubo em uma centrífuga, gire as células por cinco minutos em temperatura ambiente e aspire o snat em preparação para a marcação do corante intracelular. Suspenda novamente o pellet celular com cinco mililitros de PBS mais 0,1% BSA. Caso contrário, adicione cinco mililitros de tampão de fluxo em conjunto com o protocolo de coloração trian blue padrão.

Use um hemocitômetro para estimar a contagem efetiva de células viáveis. Reajustar a concentração celular da suspensão existente para 1 milhão de células viáveis por mililitro com o mesmo tampão utilizado no passo anterior. Essas células agora estão prontas para duas opções de coloração, uma coloração de anticorpo de antígeno de superfície ou uma coloração intracelular fluorescente opcional com carboxifluoresceína seguida pela coloração de antígeno de superfície mencionada acima.

Para realizar uma etapa de marcação intracelular com corante éster carboxifluoresceína CIN, primeiro adicione 10 microlitros de solução estoque CFSE. Para cada mililitro de suspensão celular, coloque o tubo em um agitador a 200 RPM e incube a mistura por cinco minutos. À temperatura ambiente, evite o fotobranqueamento protegendo o tubo da exposição direta à luz.

Extinguir todos os corantes não reativos adicionando cinco volumes de soro contendo tampão de fluxo e pipetar suavemente para cima e para baixo algumas vezes para misturar. Em seguida, gire as células por cinco minutos em uma centrífuga em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante para remover vestígios residuais de corantes não reativos. Lave o pellet da célula suspendendo-o novamente com cinco volumes de tampão de fluxo.

As células são então giradas mais uma vez em uma centrífuga em temperatura ambiente por cinco minutos antes de descartar o SUP natant. Finalmente, suspenda novamente o pellet celular com tampão de fluxo de modo que a concentração final de células seja de 1 milhão de células viáveis por mililitro. Para um experimento multiplexado, adicione um número igual de células não coradas de interesse de uma condição experimental diferente à suspensão de células coradas com CFSC.

As células agora estão prontas para a marcação de antígenos de superfície com anticorpos para iniciar a coloração da superfície celular. Transfira 100 microlitros da suspensão celular com ou sem etiquetas CFSC para um tubo novo de 1,5 mililitro. Adicione anticorpos conjugados com flúor quatro à suspensão celular em uma quantidade previamente determinada por testes de titulação de anticorpos.

Coloque o tubo em um agitador orbital à temperatura ambiente a 100 RPMs e incube a mistura por 30 minutos. Na ausência de luz, diluir a mistura de anticorpos adicionando um mililitro de tampão de fluxo. Pipete suavemente para cima e para baixo para misturar e girar as células em uma microcentrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius por quatro minutos.

Aspirar o supinato para remover os anticorpos não ligados e repetir esta centrifugação de lavagem e aspiração. Dê mais um passo. Reus suspende o pellet celular em 100 microlitros um tampão de fluxo para as células previamente coradas.

Adicione 500 microlitros do tampão de fixação a 100 microlitros da suspensão celular. Coloque o tubo em um agitador orbital à temperatura ambiente a 100 RPMs e incube por 15 minutos no escuro. O formaldeído fará a reticulação de todas as espécies de proteínas e DNA que estão próximas umas das outras e produzirá suspensões celulares não viáveis.

Dilua a mistura de fixação adicionando um mililitro de PBS e pipete suavemente para cima e para baixo algumas vezes para misturar. Em seguida, gire as células fixas em uma centrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius por três minutos. Aspire o supinato de forma que 100 microlitros de líquido permaneçam acima do pellet celular para permear a membrana celular para subsequente marcação intracelular do antígeno.

Adicione 500 microlitros de tampão de permeação a 100 microlitros de suspensão celular. Coloque o tubo em um agitador orbital à temperatura ambiente a 100 RPMs e incube por 15 minutos no escuro. Dilua a mistura de permeação adicionando um mililitro de PBS pipeta suavemente para cima e para baixo algumas vezes para misturar e girar as células fixas em uma centrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius por três minutos.

Aspire o SUP natant completamente antes da incubação. Prepare um estoque de trabalho de anticorpo primário diluindo o anticorpo em um tampão PBS mais 0,5% entre 20. Isso é ainda enriquecido com soro de burro 1% BSA 10% ou soro de cabra 10%.

Em seguida, ressuspenda o pellet de células permeáveis à membrana com 100 microlitros do estoque de trabalho do anticorpo primário. Coloque o tubo em um agitador orbital à temperatura ambiente a 200 RPM e incube por 30 minutos no escuro. Diluir a mistura de anticorpos primários adicionando um mililitro de tampão de fluxo.

Pipete suavemente para cima e para baixo algumas vezes para misturar e girar as células em uma centrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius por quatro minutos. Aspire o supinato completamente para remover os anticorpos não ligados. Em seguida, ressuspenda o pellet com 100 microlitros do estoque de trabalho do anticorpo secundário.

Repita a incubação à temperatura ambiente protegida da luz por 30 minutos. No mesmo agitador, diluir a mistura de anticorpos secundários adicionando um mililitro de tampão de fluxo. Repita a mesma mistura de inversão de tubo, rotação para baixo e remoção do sobrenadante para eliminar todos os anticorpos não ligados.

Repita as mesmas etapas de centrifugação de lavagem de um mililitro e remoção do sobrenadante por mais duas vezes, mas com PBS fresco como tampão de lavagem. Em vez disso, o resultado final será um pellet de célula limpa marcado com anticorpos fluorescentes direcionados extracelulares ou intracelulares CFSC ou qualquer combinação dos três ressuspende, o pellet de célula marcada em 150 microlitros de tampão de fluxo. Transferir a suspensão da célula para o citómetro de fluxo e iniciar a análise com as definições adequadas do filtro de excitação e emissão do laser para cada piso de quatro.

Usando os dados de dispersão direta e lateral como guia, configure a dispersão direta inicial versus lateral no software de análise de citometria de fluxo para excluir pontos de dados não específicos, como detritos celulares e células mortas. Em seguida, usando dados brutos de uma suspensão de células não coradas como controle negativo, configure várias portas de integração fluorescente que selecionam sinais de emissão positiva de marcadores de antígenos extracelulares e intracelulares para contabilizar o fundo fluorescente de multicolorido. Os efeitos de sobreposição espectral reajustam as portas fluorescentes usando dados brutos de controles corados com anticorpos únicos.

Em um experimento de fax multiplexado, as etiquetas de carboxifluoresceína podem ser usadas como um sinal de linha de base que pode discriminar entre células de duas linhagens diferentes ou condições experimentais sem o uso de um anticorpo. Por exemplo, em uma suspensão celular heterogênea, pode-se diferenciar imediatamente entre células neurais marcadas com CFSC e fibroblastos não marcados apenas observando a presença ou ausência de fluorescência no canal verde. Além disso, em conjunto com a marcação CFSE Esther, pode-se usar anticorpos fluorescentes de cores diferentes para determinar a expressão diferencial de antígenos de superfície entre os subconjuntos marcados com CFSE versus não marcados em uma amostra mista.

Por exemplo, as células de neuroblastoma Y SHSY cinco marcadas com CFSE no canal de fluorescência verde, co-expressaram altos níveis de antígeno de superfície CD 24, mas não do marcador de fibroblastos CD 54. Em contraste, os fibroblastos BJ negativos para CFSC são positivos para CD 54 com níveis mais baixos de CD 24. A análise de antígenos de superfície neural também pode ser realizada em conjunto com a detecção baseada em anticorpos de antígenos intracelulares.

A inclusão de amostras não coradas e controles de coloração única para antígenos de superfície e antígenos intracelulares é crítica como uma alternativa à marcação primária e secundária baseada em anticorpos de antígenos intracelulares, como o mapa de marcadores neurais dois mostrado aqui. A marcação fluorescente não covalente do anticorpo primário pode produzir resultados comparáveis na análise de co-expressão e encurta o protocolo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células neurais para análise citometria de fluxo básica usando várias abordagens alternativas de rotulagem e combinações das mesmas.