High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar rapidamente as células-tronco geneticamente modificadas usando um sistema de triagem de alto conteúdo ou HCS. Isso é feito primeiro projetando e preparando experimentos para uma placa de 96 poços e, em seguida, revestindo as diferentes populações de células-tronco modificadas. Em seguida, o sistema de triagem de alto conteúdo é preparado para imagens de células vivas e, em seguida, a imagem de lapso de tempo é iniciada para o período de tempo desejado.

Em seguida, após concluir a imagem de lapso de tempo, a placa de cultura é preparada para procedimentos de coloração celular, como iodeto de propídio, coloração para morte celular ou imunomarcação KI 67 para caracterizar a proliferação celular. Finalmente, a placa de 96 poços é recarregada no sistema de triagem de alto conteúdo para imagens de fluorescência e aquisição de imagens. Em última análise, o software de análise de imagem é usado para realizar análises de dados para determinação de diferentes parâmetros de crescimento celular.

Essa metodologia pode ajudar a abordar questões-chave no campo da biologia de células-tronco, como a identificação e caracterização de fatores que estimulam a diferenciação de células-tronco. As implicações dessa técnica se estendem às estratégias terapêuticas baseadas em células devido à importância de caracterizar os tipos de células antes de serem usados in vivo. Este método pode fornecer informações sobre o comportamento das células e pode ser aplicado a praticamente qualquer outro tipo de célula que cresça bem em cultura.

Além disso, essas abordagens podem ser usadas em organismos inteiros, como larvas de peixe-zebra. Para começar, crie um mapa, como mostrado aqui, da placa de 96 poços, descrevendo os diferentes substratos e tipos de células a serem examinados sob uma capa de cultura estéril. Prepare uma estação de trabalho com diferentes substratos e uma placa de 96 poços.

Adicione 100 microlitros de solução de substrato a cada um, bem de acordo com o mapa. Em seguida, use uma tira de perfil para selar a tampa e armazene a quatro graus Celsius durante a noite após isolar as células-tronco mesenquimais de camundongos e infectá-las com vetores lentivirais de acordo com o protocolo de texto, remova as soluções de substrato da placa de 96 poços e use cerca de 200 microlitros de PBS estéril para lavar os poços duas vezes. Uma vez que o enxágue final tenha sido removido a 200 microlitros de meio de cultura de células e equilibre a placa em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Enquanto isso, em condições estéreis, colha as MSCs coletando primeiro o meio de crescimento, agora referido como meio condicionado, do frasco em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione oito mililitros de PBS estéril ao frasco e agite suavemente antes de aspirar o tampão Para separar as células do frasco, adicione um mililitro de 0,05% de tripsina e 0,01% de solução de EDTA. Quando as células se separarem, adicione oito mililitros do meio condicionado antes de coletar a suspensão celular e replaquear as células a cerca de 300 células por poço.

De acordo com o protocolo de texto, incube a placa por duas horas para permitir que as MSCs se prendam ao substrato enquanto as células estão incubando. Inicie o sistema HCS e aguarde duas horas para que ele se equilibre. Defina o controlador ambiental para 37 graus Celsius e ligue cuidadosamente o cilindro de gás misto contendo 5% de dióxido de carbono no ar para o sistema HCS, câmara ambiental que fornece uma fonte de ar constante.

Em seguida, após o período de incubação de duas horas, remova a placa de 96 poços da incubadora e coloque-a diretamente na câmara ambiental do sistema HCS. Depois de permitir que a placa se equilibre por 30 minutos, inicie o software para definir as configurações da placa. Uma vez que os parâmetros de imagem tenham sido configurados, de acordo com o protocolo de texto, use o foco automático a laser para focar no fundo do poço e tire imagens de teste de vários locais e vários poços para encontrar um plano focal otimizado.

Uma vez estabelecido o foco, comece a capturar imagens a cada cinco minutos por 48 horas para todos os 60 poços. No final do experimento, remova a placa de 96 poços do sistema HCS em condições estéreis, colete amostras de meio condicionado de cada poço e transfira-as para uma nova placa de 96 poços. Essas amostras podem ser usadas posteriormente para um ELIZA para realizar um ensaio de proliferação celular KI 67.

Use tampão fosfato 0,1 molar para enxaguar as culturas de células por um minuto. Depois de repetir a lavagem, use 4% para formaldeído ou PFA em temperatura ambiente por 20 minutos para fixar as culturas após a fixação. Remova o PFA e use PBS para enxaguar os poços três vezes por sete minutos cada.

Depois de bloquear as células de acordo com o protocolo de texto, aplique 100 microlitros de solução de anticorpo primário em cada uma. Cubra bem a placa e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de lavar as células três vezes por sete minutos.

Para cada lavagem, aplique um anticorpo secundário. Coloque as células no escuro e incube em temperatura ambiente por 90 minutos após outras três lavagens. Cubra a placa e guarde-a a quatro graus Celsius até a imagem.

Para realizar imagens automatizadas, carregue a placa imunomarcada no sistema HCS e deixe a placa se equilibrar por 20 minutos. Abra o software de aquisição e análise de imagens do sistema HCS. Escolha as configurações de aquisição para a objetiva de 10 x usando a curvatura da câmera em um e uma configuração de ganho de dois.

Use a função de exposição automática para encontrar o plano Z no qual as células residem e calcule o deslocamento para cada comprimento de onda de interesse para a análise demonstrada aqui. Capture imagens para DAP, EGFP e S3. Escolha o nível de intensidade máxima no qual os poços de controle negativo não mostram sinal para aquisição de imagem. Use as mesmas configurações de limite para poços positivos.

Por fim, capture imagens e salve-as em um banco de dados antes de realizar a análise de imagens. De acordo com o protocolo de texto, conforme mostrado aqui, cinco populações diferentes de subtipos de MSC foram semeadas em 96 placas de cultura de tecidos de poços pré-codificadas com diferentes substratos nesta figura, anti KI 67, que identifica células em proliferação, e DAPI foi usado para avaliar se os diferentes substratos influenciaram a proliferação das diferentes populações de MSCs projetadas, conforme ilustrado aqui, embora tenha havido variação nas porcentagens de proliferação de MSCs, todos os substratos suportaram considerável proliferação celular para cada subtipo de MSC. Este gráfico mostra que a porcentagem de células com coloração de iodeto de propídio ou IP, que identifica células mortas em uma população, é baixa em todos os substratos examinados, células tratadas com etanol a 70%, que mata a maioria das células, exibiram uma alta taxa de marcação de IP e serve como um controle positivo para investigar o comportamento das MSCs em diferentes substratos.

A migração celular durante um período de 29 horas foi analisada usando microscopia digital de lapso de tempo. O caminho de migração para a célula um e a célula dois são marcados pela linha verde e azul, respectivamente. Como mostrado aqui, todos os subtipos de MSCs apresentaram a taxa de migração mais rápida na matriz extracelular, superfícies revestidas, e a mais lenta em superfícies de poliestireno não revestidas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de planejar e projetar cuidadosamente o experimento para um formato de placa de vários poços, como uma placa de 96 poços Seguindo este procedimento. Outros métodos como Eliza S podem ser realizados em meios de condição para responder a perguntas adicionais sobre a produção e secreção de fatores terapêuticos pelas células-tronco projetadas após seu desenvolvimento. Procedimentos de triagem de alto conteúdo abriram caminho para pesquisadores nas áreas de biologia de células-tronco e descoberta de medicamentos explorarem sistemas biológicos complexos de maneira de alto rendimento.