Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma abordagem minimamente invasiva para injetar drogas ou células-tronco no nervo óptico de um rato vivo. Isso é feito primeiro anestesiando o rato, posicionando-o no suporte de dissecção e inserindo uma sutura na conjuntiva para manipulação do olho. Mais tarde, o segundo passo é dissecar a crista orbital atrás do olho para expor o nervo óptico.

Em seguida, a pipeta de vidro é inserida no nervo óptico e a droga ou células-tronco são injetadas antes do fechamento do local da cirurgia e reanimar o rato da anestesia. Por fim, após um certo período de tempo, o rato é sacrificado, o nervo óptico dissecado e os efeitos da injeção cirúrgica ou transplante podem ser visualizados por microscopia. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que essa abordagem é minimamente invasiva e permite que o rato sobreviva o tempo que você precisar.

Estude os efeitos da injeção cirúrgica ou transplante. Demonstrando o procedimento estará Kate Schwartz, uma estudante técnica do meu laboratório. Realize todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia com dois a 3% de flúor.

Confirme o nível apropriado de anestesia por pinça do dedo do pé e a frequência respiratória. Verifique se o rato não vacila em resposta a um dedo do pé. Beliscar. Prenda o animal conforme necessário para evitar o movimento da cabeça durante o procedimento.

Em seguida, coloque uma gota de lidocaína no olho cirúrgico. Use lágrimas artificiais a cada 10 minutos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Administre uma injeção pré-operatória de buprenorfina a 0,01 miligramas por quilograma por via subcutânea e, em seguida, a cada seis a oito horas, conforme necessário.

Mantenha o animal aquecido com uma almofada de aquecimento. Molhe o pelo do couro cabeludo com álcool. Tomando cuidado para evitar a exposição nos olhos.

Certifique-se de usar ferramentas estéreis e técnicas estéreis para minimizar o risco de infecções pós-operatórias. Em seguida, coloque uma sutura de quatro oh na conjuntiva lateral e amarre-a com sutura suficiente para permitir uma tração suave. Faça uma incisão de aproximadamente uma polegada na pele que cobre a crista orbital.

Usando um bisturi tamanho 10. Retraia a pele e a fáscia subjacente e disseque cuidadosamente a fáscia. Coloque uma sutura na pele retraída para permitir a exposição do saco orbital superior para evitar sangramento excessivo no local da cirurgia.

Evite cortar os vasos sanguíneos durante a dissecação da fáscia. Com tração suave na conjuntiva, puxando o olho para baixo e para fora da órbita, o músculo orbital superior ficará visível. Para expor o nervo óptico, a gordura retroorbital deve ser removida e esse músculo cortado.

A gordura pode ser descartada e não deve ser substituída após a injeção. A partir deste ponto, a fáscia do nervo óptico deve ser visível como um feixe do próprio nervo óptico, juntamente com os vasos sanguíneos envoltos em dura-máter. Para fazer a dissecção mais profunda, faça uma pequena incisão na DRA usando o bisturi ou uma agulha chanfrada de calibre 31 para tornar a perfuração menos traumática, preparei uma micropipeta de vidro puxado com um diâmetro de 50 a 100 mícrons para fornecer estabilidade.

Monte a micropipeta em um micromanipulador e conecte-a a uma seringa de plástico de 20 cc. Puxe grânulos ou células-tronco reconstituídas em 0,5 a um microlitro para a micropipeta retrógrada, juntamente com 0,5 microlitros de solução de azul de metila antes e depois que a pipeta de vidro for carregada com corante. Usando uma seringa de um cc e uma agulha de calibre 30, abaixe a ponta da micropipeta no nervo óptico logo acima da dura-máter cortada.

Um movimento minúsculo, mas rápido, da ponta do vidro no nervo óptico resulta em menos danos ao aplicar pressão lenta e constante no êmbolo. O corante azul de Evans deve destacar a área do nervo óptico injetado. O corante deve permanecer localizado dentro do nervo óptico sem vazar no espaço subaracnóideo.

Siga a segunda banda do corante azul de Evan para determinar quando a injeção de células-tronco está completa. Quando o volume necessário for injetado no nervo óptico, solte o êmbolo. Mantenha a micropipeta imóvel dentro do nervo óptico por cinco minutos para evitar a ejeção de alta pressão após a retirada da micropipeta quando a injeção estiver completa.

Remova a micropipeta junto com quaisquer pontas de algodão usadas para fornecer hemostasia. Suturar a pele com seda 3.0 e remover a sutura conjuntival. Mantenha os ratos aquecidos em uma almofada de aquecimento até que saiam da anestesia.

Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter o esterno reclinado. Se o animal estiver exibindo sinais de dor, incluindo letargia excessiva, ataxia ou dificuldade para respirar, administre analgesia apropriada com buprenorfina intramuscular até três vezes ao dia. Após o experimento, os ratos foram sacrificados e perfundidos com paraldeído.

Os nervos ópticos foram cuidadosamente dissecados e montados para seccionamento de criostato mostrado aqui é um exemplo de um nervo óptico de buraco de rato em menor potência no qual o corante azul de Evan foi injetado. Para visualizar o local, a seta identifica a localização precisa da injeção. Esta dissecção foi feita dentro de alguns dias após a injeção, conforme indicado pela difusão restrita do corante pelo nervo após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurologia regenerativa explorarem novas maneiras de regenerar o nervo óptico e potencialmente restaurar a visão perdida neste modelo de rato de doença desmielinizante.