Name: Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a gerar clones de células T humanas alo-específicas a partir de sangue periférico usando separação magnética e citometria de fluxo. Este método permite estudar respostas imunes específicas em imunologia e transplantes.

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O autor gostaria de agradecer ao NIH Tetramer Core Facility pela produção de tetrâmeros. O autor também gostaria de agradecer a E.D. O'Connor e K.E. Marquez do laboratório de citometria de fluxo da UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility pela assistência na classificação de células. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health grant K08AI085039 (GPM).

NOTA: Este protocolo requer a utilização de amostras de sangue periférico de voluntários humanos. Todas as pesquisas com seres humanos deve ser revisado e aprovado por um Estudos Humanos Institutional Review Board para assegurar a conformidade com a Declaração de Helsinque (2013) e do Seguro de Saúde Portabilidade e Responsabilidade Act de 1996. 1. Isolamento das células T a partir de Sangue Total <ol><li> Antes da partida, aquecer o meio de gradiente de densidade até à temperatura ambiente. Aliquota de 4 ml de meio de gradiente de densidade de 2-4 em tubos estéreis de 15 ml de centrífuga cónicos (1 tubo serão utilizados para cada 10 ml de volume total de sangue diluído). </li><li> Obter 10-20 ml de sangue em heparina spray de 2/1 de sódio revestido (verde-top) tubos de coleta de sangue venoso. Coletar amostras humanas sob a supervisão de pessoas treinadas e de acordo com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado. </li><li> Limpe a parte externa dos tubos com álcool a 70%. Remova cuidadosamente os tops da fiencheram tubos de coleta e decantar o sangue para um tubo de centrífuga de 50 ml estéril. </li><li> Adicionar 10 ml estéril tampão fosfato salino (PBS) a cada tubo de coleta de sangue. Recolher o PBS, adicionar ao sangue total decantado, e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 25 ul t Human Enrichment celular Cocktail / 2 ml de volume total. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Utilizando uma pipeta de 10 mL, a camada de até 10 ml de 1: 1 sangue diluído suavemente no topo do meio de gradiente de densidade. Ter cuidado para não perturbar a superfície do meio de gradiente de densidade. </li><li> Centrifugar o sangue em camadas e meio de gradiente de densidade a 1200 xg durante 20 min a 20 o C. </li><li> Retire os tubos da centrifugadora, tendo cuidado para não perturbar a interface entre o meio de gradiente de densidade e a camada de leucócitos na interface entre o meio de gradiente de densidade e o plasma diluído. Usando uma pipeta de 5 ml, cuidadosamente a camada de leucócitos recolher e transferir para um novo 50 ml estéril banheira cónicae. </li><li> Adicionar PBS para perfazer o volume do PBL recolhidos para 50 mL e misturar suavemente. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 o C. Decantar. </li><li> Ressuspender as células sedimentadas em 10 ml de citometria de fluxo estéril triagem tampão (esterilizada por filtração PBS contendo 1% de BSA). Amostra 10 ml de suspensão celular, diluir 1:10 (adicionar a 90 mL) azul de tripan para contar células usando um hemocitômetro (rendimento esperado 1-4 x 10 6 células / tubo de sangue total). <ol><li> Retirar alíquota de 1 ml, transferir para tubo de 5 ml, e manter em gelo para análise de células T não rotulados por tetrâmero. Mantenha suspensão de células no gelo. </li></ol></li></ol> 2. Enriquecimento magnética de células T alo-específicos <ol><li> Diluir aloantigénio pMHC tetrâmero a 1: 100 em tampão de tipo estéril. </li><li> Centrifugar a suspensão de células (9 ml do passo 1.11) a 600 xg durante 5 min a 20 o C. Decantar. </li><li> Adicionar 50 ul de aloantigénio diluída pMHC tetrâmero para sedimentadasAs células (até 10 7 células). Misture por pipetagem suave. Transferir para um tubo esterilizado de 5 ml. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicione 2 ml tipo buffer. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 o C. Decantar. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul tampão tipo. Adicionar 10 ul de coquetel Biotina Selecção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 5 uL Magnética Nanopartículas e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2,5 ml espécie de tampão e misture delicadamente por pipetagem. Remover alíquota de 100 ul, transferir para tubo de 5 ml, e manter em gelo para análise de células de pré-enriquecimento. </li><li> Colocar o tubo contendo 5 ml da suspensão de células no íman de separação de células. A tampa deve ser solta em cima do tubo. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Com cuidado, retire a tampa do tubo. Segurando o tubo e um ímã em conjunto, decantar o conteúdo do tubo para um novo tubo de 5 ml. Não bata nem sacuda o conteúdo do tubo pararemover as últimas gotas de líquido. </li><li> Retirar o tubo do ímã. Adicionar 2 ml de tampão tipo frio e misture delicadamente por pipetagem. Amostra de 10 uL da suspensão de células, diluída 1: 2 (para adicionar 10 ul) de azul de tripano a contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li></ol> 3. Preparação de células T para uma única célula Citometria de Fluxo Seleção celular <ol><li> Adicionar tampão tipo frio em todos os tubos de células (tetrâmero marcado, não-enriquecido, e enriquecido com rótulo tetrâmero marcado com tetrâmero) para trazer volume para 3 ml. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C e tampão de decantar para recuperar as células. </li><li> Ressuspender as células peletizadas em 25 mL de tampão tipo frio. Adicionar 5 uL de bloco Fc humana. Incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Preparar anticorpos para triagem de citometria de fluxo. Misture 15 ul de tampão tipo, 15 ul anti-CD5, 15 ul anti-CD14, e 15 ul anti-CD19. </li><li> Adicionar 20 ul de mistura de anticorpo a cada tubo de células. Incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão de tipo frio a cada tubo. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C e tampão de decantar para recuperar as células. </li><li> Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 -2 6 células / ml em tampão tipo. </li><li> Alíquotas de 100 ul de t meio de cultura de células humanas (DMEM Iscove suplementado com Glutamax 2 mM, HEPES 10 mM, 50 ug / ml de gentamicina, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 10% de soro AB humano inactivado pelo calor, e 2,5 ng ml humana / recombinante IL-2) para cada poço de uma placa redonda de 96 poços de cultura de células de fundo. Manter em gelo. </li></ol> 4. Isolamento de células marcadas com tetrâmero T por uma única célula Citometria de Fluxo Seleção <ol><li> Estabelecer citometria de fluxo para identificar os parâmetros de propagação aloantigénio-pMHC tetrâmero células T marcados (Figura 2.a). Use a fração tetramer pré-enriquecimento marcado para estabelecer gating estratégias para eliminar dobletos, portão em linfócitos, excluir CD19 expressando as células B e CD14expressando monócitos, e identificar as células T por expressão CD5. Utilizar a amostra não marcada como um tetrâmero com fluorescência menos um controlo para estabelecer o gating para identificação de células T de ligação ao tetrâmero (com 0% de CD5 + CD14 - CD19 - células a partir da amostra não marcada pelo tetrâmero deve cair dentro deste portão) . NOTA: Gating estratégias que não são adequadamente rigorosas irá resultar no isolamento de células não-T ou células T que não são antigénio específico, enquanto as estratégias gating excessivamente restritivas vai reduzir o número de células T isoladas. </li><li> Programar os parâmetros da placa para o tipo de célula única. Direcionar o classificador para colocar um CD5 + CD14 - CD19 - tetrâmero + célula em cada poço. Direcione a placa criada para conter um controle negativo (ausência de células classificadas para o bem) e um controle positivo (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - células) em cada linha (Figura 2.B </strong&gt;). </li><li> Utilizando a citometria de fluxo estabelecida estratégia gating e configuração da placa, isolar as células-T de ligação de tetrâmero individuais directamente para a placa de 96 poços utilizando um classificador de células por citometria de fluxo. </li></ol> 5. Cultura e Expansão de clones de células T alo-específicas <ol><li> Após a conclusão da separação de células, a placa de centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 o C. Colocar a placa de cultura a 37 ° C num 6% incubadora de CO 2. </li><li> Vortex estimuladores microesferas anti-CD3 / anti-CD28 durante 30 seg para ressuspender as esferas. </li><li> Calcular o volume de grânulos activadores necessários para a estimulação de células T recolhidas (0,5 ul de microesferas de activadores / poço). Transferir volume calculado de contas estimulador para um tubo estéril de 5 ml. Adicionar 1 ml de meio de cultura de célula T humana e vortex. </li><li> Coloque tubo com suspensão microbead em ímã. A tampa deve ser solta em cima do tubo. Incubar durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Retire com cuidadoda tampa do tubo. Segurando o tubo e um ímã em conjunto, o conteúdo do tubo decante para um novo tubo de 5 ml. Não bata nem sacuda o conteúdo do tubo. </li><li> Retirar o tubo do ímã. Adicionar meio de cultura de células T humanas (100 / ul médias 0,5 ul de microesferas inicialmente adicionada). </li><li> Aliquota de 100 ul de suspensão de activador do grânulo para cada poço da placa de 96 poços. Incubar a placa de cultura a 37 ° C em 6% de CO 2 incubadora. </li><li> Monitorar o crescimento celular diariamente pelo exame microscópico. Os pequenos agregados de células em proliferação podem ser observadas ao microscópio após 5-7 dias de cultura (Figura 3.A). NOTA: A visualização das culturas de células T, neste ponto pode ser difícil, e a ausência de agrupamentos de células observáveis, nesta fase, pode não ser indicativa de uma falta de crescimento de células T. </li><li> Aos 14 dias após o isolamento das células, culturas para alimentação animal, removendo cuidadosamente 100 ul de meio para fora do topo da cultura e substitua com 100 μ; L fresco humano T meio de cultura celular. Continuar a incubação placa de cultura a 37 ° C em 6% de CO 2 incubadora. </li><li> Monitorizar o crescimento celular por dia por exame microscópico e avaliação da cor do meio de cultura. Grandes grupos de células deve ser visível microscopicamente 2 - 3 dias após a mudança do meio. Macroscopicamente, pelotas de células deve tornar-se visível durante os 14 dias seguintes à mudança de meio. </li><li> Aos 28 dias após o isolamento de células, identificar clones que crescem através de exame microscópico. Transferir o volume de 200 ul das crescimento positivo de 96 poços da placa de culturas para poços individuais de uma placa de 48 poços de cultura de tecidos contendo 200 ul de meio de cultura de célula T humana. </li><li> Adicionar 100 ul contendo 12,5 ul de microesferas anti-CD3 / anti-CD28 estimuladores (preparada tal como descrito nas secções 5,2-5,6). Incubar a placa de cultura a 37 ° C em 6% de CO 2 incubadora. </li><li> Monitorar o crescimento cultura diariamente por ex microscópicaaminação e avaliação da cor do meio de cultura. Quando a cultura de células T atinge&gt; 2x10 6 / ml (tipicamente 3-5 dias após re-estimulação, pode ser estimado pelo dia em que os meios de comunicação começa a transformá amarelo-palha), cultura da transferência para um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços e adicionar 500 mL meio humana de células T. </li><li> No dia 14/10 siga re-estimulação, coletar 200 mL de cultura de células T para avaliar aloantígeno especificidade análise por citometria de fluxo de pMHC tetramer ligação (utilizando a estratégia de rotulagem e gating descrito nas secções 3 e 4.1). </li></ol> 6. longo prazo Re-estimulação e Cultura de clones de células T <ol><li> Continuamente re-estimular e expandir culturas clonais de células T com a especificidade desejada podem ser a cada 14 dias. Recolhe culturas de células T para um tubo de 5 ml estéril no dia 14 após a última anti-CD3 / CD28 estimulação micropérola. Combinação de várias cavidades do mesmo clone de células T num único tubo, até um volume de 2,5 ml. </li&gt; <li> Adicionar meio para levar o volume final para 2,5 ml e misturar suavemente por pipetagem. </li><li> Colocar o tubo de 5 ml contendo a cultura de células T para o íman de separação de células para remover velhos microesferas a partir da cultura. A tampa deve ser solta em cima do tubo. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Com cuidado, retire a tampa do tubo. Segurando o tubo e em conjunto íman, decanta-se a suspensão de células para um novo tubo de 5 ml. Não bata nem sacuda o conteúdo do tubo para remover as últimas gotas de líquido. </li><li> Adicionar meio para levar o volume final a 4 ml. Amostra de 10 mL para contagem de células usando um hemocitômetro. </li><li> Recuperar as células T através de centrifugação a 600 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante. As células em 10 6 células / ml T humanas meio de cultura de células T Ressuspender. Transferir 1 ml de partes alíquotas para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. </li><li> Re-estimular as células T através da adição de 100 ul contendo meios de 12,5 ul de estimulador anti-CD3 / amicrobeads nti-CD28 (conforme descrito nas seções 5,2-5,6). Incubar a 37 ° C em 6% de CO 2 incubadora. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A aloreatividade das células T é um fenômeno há muito estudado e clinicamente relevante. As respostas proliferativas e efetoras robustas das células T à estimulação alogênica permitiram análises extensivas das respostas das células T humanas in vitro por meio de reações linfocitárias mistas relativamente diretas de células T do sangue periférico contra células alogênicas inativadas. No entanto, essas respostas primárias de células T alorreativas são oligoclonais, compostas por um grande número de células T indiv...

Os linfócitos T são componentes críticos do sistema imunitário adaptativo. As células T são responsáveis ​​não só para mediar directamente respostas imunitárias protectoras para agentes patogénicos através de uma variedade de mecanismos efectores, mas também manter activamente auto-tolerância imunológica e dirigir as respostas de outras células do sistema imunológico. Estas funções são dirigidos através de um número de sinais integrados, incluindo o receptor de células T (TCR) de ligação, citocinas e quimiocinas, e metabolitos 1. Destes sinais, o TCR é de particular importância, uma vez que proporciona a especificidade característica que define o papel de células T na imunidade adaptativa. Um TCR interage com antigénios peptídicos lineares apresentados pelo MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complexos pMHC) de um modo altamente específico e sensível para fornecer os sinais que dão início a função efectora de células T. Os parâmetros bioquímicos das interacções TCR com ligandos pMHC proporcionam não só a especificidade para o tativação celular, mas também tem um impacto qualitativo sobre a função das células T posterior 2. Assim, estudar a função das células T exige frequentemente a examinar as respostas de células T com especificidade antigénica clonais definido. O compartimento da célula T humana, contendo cerca de 10 12 células T αβ, contém uma estimativa de 10 julho-10 agosto αβTCRs distintas 3-4. Este repertório diversificado oferece oportunidade para o reconhecimento da vasta gama de peptídeos de potenciais patógenos que exigiria uma resposta das células T para a imunidade protetora. Estima-se que a frequência de células T de responder a um determinado antigénio estranho apresentado por auto-MHC é da ordem de 10 -4 - -7 10 na ausência de resposta imune antes que o antigénio 5. O repertório de células T naive é moldada por selecção tímica para assegurar a capacidade de reconhecer auto-MHC que apresenta antigénios peptídicos e limite reagemivity contra antigénios auto-péptido, a maximização da utilidade potencial para mediar a imunidade protectora 2. No entanto, em violação da presente concebido reactividade, uma relativamente grande frequência, 10 -3 - -4 10, de células T a partir de indivíduos imunologicamente naive respondem à estimulação com células alogénicas, que reconhece ambas as moléculas MHC estranhos, bem como os peptídeos endógenos que apresentem 6. O reconhecimento de ligandos pMHC alogénicos é estruturalmente semelhante ao do reconhecimento de antigénios estranhos apresentados pelas auto-MHC; o TCR faz interacções bioquímicas críticas, tanto com a molécula de MHC alogénico, bem como o péptido apresentado 7. A natureza robusta da resposta das células T para estimulação resulta alogénicas a partir da diversidade de complexos pMHC presente na superfície de células alogénicas 8. Estima-se que cada MHC apresenta cerca de 2 x 10 4 diferentes antigénios peptídicos endógena 9. Este breadth de resposta à estimulação alogénica é um aspecto importante da patologia clinicamente relevantes, tais como a rejeição de aloenxertos ou a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), que resulta a partir de células T alloreactivity. Estudo de células T respostas alorreativas humanos tradicionalmente invocado examinar as respostas policlonais de células T naive após a estimulação com células alogênicas. Estimulação repetida com a mesma linha de célula alogénica combinado com análises de diluição limitante é capaz de gerar células T clonais com reconhecimento definido alogénica de HLA de 10. No entanto, esta abordagem é problemática para examinar respostas aos ligandos alogénicos pMHC individuais, como o repertório grande e diverso de complexos pMHC endógeno presente para um dado alogénica de HLA estimula um amplo repertório de células T. Esta estimulação população a granel e de diluição limitante abordagem exigiria o rastreio de grandes números de clones para isolar as células T com a desejada Reactividade contra um único ligando pMHC. Além disso, a frequência de células T que respondem a uma célula alogénica ligando pMHC individuais é relativamente baixo entre as populações de células T ingénuas, o que apresenta uma barreira eficiente para a geração de clones de células T humanas que respondem a um dado antigénio. Identificação e isolamento de células T específicas de antigénios a partir de populações policlonais têm sido activado pelo desenvolvimento de marcado com fluoróforo pMHC multímeros 11. Esta abordagem utiliza antigénios peptídicos específicos carregados em moléculas de MHC recombinantes solúveis, biotinilados que são marcados por ligação a um fluoroforo marcado com estreptavidina. Multimerização de pMHC aumenta a avidez, compensando a afinidade intrínseca baixa (M) de TCR para ligantes pMHC solúveis. As células marcadas podem ser identificadas e isoladas por citometria de fluxo. No entanto, esta abordagem é ainda limitada pela baixa frequência de células T específicas do antigénio entre as populações de células T naive, que são tipicamenteordens de grandeza menor do que o limite de identificação e quantificação precisas sobre a maioria das citómetros de fluxo. Para resolver esta limitação, um método de rotulagem pMHC tetrâmero e subsequente enriquecimento esfera magnética para células marcadas com tetrâmero foi desenvolvida 12. Este método tem demonstrado uma detecção fiável, enumeração e isolamento de células específicas para o antigénio T de baixa frequência. Este protocolo descreve um protocolo eficaz para a geração de clones de células T humanas que respondem especificamente a ligandos alogénicos pMHC individuais. O protocolo aplica pMHC (HLA) de rotulagem e enriquecimento multímero para o isolamento de células T humanas específicas do aloantigénio com citometria de fluxo de células de triagem e um método robusto para a cultura in vitro de células T humanas, para permitir a produção de clones de células T a partir de células separadas individuais ( Resumo na Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Tubo de coleta de sangue venoso de heparina sódica 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Kit de Enriquecimento de Células T Humanas</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, 1x sem Ca ou Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>de soro bovinoSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Tetrâmero pMHC marcado com fluoróforo</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de Seleção de Biotina</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>Ímã de seleção</td><td>EasySep Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Solução de bloqueio de Fc humano</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM, sem b-ME ou L-glutamina</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB humano, doador masculino</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Tecnologias</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Mídia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td><td></td>de classificação de células</tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr>Meio <td></td><td></td><td></td>de<td>cultura de células T humanas</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>351,6 ml</td><td></td> <td>da Iscove</td></tr><tr><td>Soro AB humano inativado pelo calor</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células t humanas alo-específicos a partir de sangue periférico

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

O estudo da biologia dos linfócitos T humanos geralmente envolve o exame das respostas aos ligantes ativadores. As células T reconhecem e respondem aos antígenos peptídicos processados apresentados pelas moléculas de MHC (ortólogo HLA humano) através do receptor de células T (TCR) de maneira altamente sensível e específica. Enquanto a função primária das células T é mediar respostas imunes protetoras a antígenos estranhos apresentados pelo auto-MHC, as células T respondem de forma robusta a diferenças antigênicas em tecidos alogênicos. As respostas das células T aos aloantígenos podem ser descritas como aloreatividade direta ou indireta. Na aloreatividade, a célula T responde por meio do reconhecimento altamente específico do peptídeo apresentado e da molécula de MHC. A resposta oligoclonal robusta das células T à estimulação alogênica reflete o grande número de aloantígenos potencialmente estimulatórios presentes nos tecidos alogênicos. Embora a amplitude das respostas aloreativas das células T seja um fator importante no início e mediação da patologia associada a respostas alorreativas biologicamente relevantes, como doença do enxerto contra o hospedeiro e rejeição do aloenxerto, ela pode impedir a análise das respostas das células T aos ligantes alogênicos. Para este fim, este protocolo descreve um método para gerar células T aloreativas a partir de leucócitos do sangue periférico humano (PBL) virgens que respondem a aloantígenos peptídicos-MHC (pMHC) conhecidos. O protocolo aplica marcação de multímero pMHC, enriquecimento de esferas magnéticas e citometria de fluxo a métodos de cultura in vitro de célula única para a geração de clones de células T específicos para aloantígenos. Isso permite estudos da bioquímica e função das células T que respondem à estimulação alogênica.

Este protocolo descreve a geração de culturas de células T humanas clonal com aloantigénio especificidade definida por meio de um cordão de enriquecimento magnética e fluxo de uma única célula citometria de triagem estratégia. A Figura 1 apresenta um esboço do processo. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figura 1: Vista geral Protocolo O protocolo aqui descrito proporciona um...

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar, isolar e clonar células T humanas com uma especificidade de antígeno alo. Isso é feito isolando primeiro os linfócitos T do sangue periférico total por centrifugação com gradiente de densidade. Na segunda etapa, as células T específicas do antígeno alológico são marcadas com peptídeo conjugado com flúor quatro, HLA, tetrâmeros e enriquecidas por separação magnética.Em seguida, as células T marcadas são isoladas por classificação de células por citometria de fluxo de célula única. Finalmente, as culturas de células únicas são estimuladas com anticorpos anti CD três e anti CD 25. Em última análise, a alo-reatividade das células T específicas do antígeno pode ser avaliada por análise citométrica de fluxo.A principal vantagem desta técnica sobre outras técnicas, como estimulação de linfócitos em massa e diluição limitante, é que esta técnica permite a geração de clones de células T com reatividade específica a aloantígenos bem definidos. Geralmente, os indivíduos que são novos neste método podem ter dificuldade em cultivar e expandir os clones de células T. Isso requer um monitoramento diário cuidadoso das culturas antes de iniciar o procedimento.Alíquota de quatro mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente em dois a quatro tubos de centrífuga cônicos estéreis de 15 mililitros usam 70% de etanol para limpar a parte externa de um a dois tubos de coleta de sangue verdes cheios contendo sangue de um voluntário saudável e, em seguida, remova cuidadosamente as tampas, decantar o sangue em um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros, e, em seguida, resse cada tubo de coleta com 10 mililitros de PBS. Agrupar as lavagens com o sangue total decantado e misturar uma solução suavemente, depois incubar as células com 25 microlitros de cocktail de enriquecimento de células T humanas por dois mililitros de volume total de sangue diluído. Após 20 minutos, use uma pipeta de 10 mililitros para colocar até 10 mililitros de sangue suavemente em cima do meio gradiente de densidade, tomando cuidado para não perturbar a superfície do gradiente.Centrifugue as células durante 10 minutos e, em seguida, utilize uma pipeta de cinco mililitros para transferir cuidadosamente a camada de leucócitos da interface do gradiente de densidade e do plasma diluído para um tubo cónico estéril de 50 mililitros. Aumente o volume dos linfócitos do sangue periférico coletados para 50 mililitros com PBS e misture suavemente a suspensão celular. Em seguida, conte as células e remova uma alíquota de um mililitro para análise.Em seguida, depois de girar as células resus, suspenda os pellets em um mililitro de tampão de citometria de fluxo e misture 50 microlitros do peptídeo aloantígeno diluído MHC tetrâmero na suspensão celular. Transfira as células para um tubo estéril de cinco mililitros e, após 30 minutos, lave as células em dois mililitros de tampão de resus. Suspenda o palato em 100 microlitros de tampão de classificação e, em seguida, incube as células em 10 microlitros de coquetel de seleção de biotina por 15 minutos.Em seguida, incube as células em cinco microlitros de partículas magnéticas por 10 minutos e, em seguida, misture suavemente a suspensão celular com 2,5 mililitros de tampão de classificação. Remova uma alíquota de 100 microlitros de análise de células de enriquecimento de pré-enriquecimento e coloque o tubo no ímã de separação de células. Após cinco minutos, segure o tubo e o ímã juntos e transvase o conteúdo em um novo tubo de cinco mililitros.Em seguida, remova o tubo do ímã e lave as células em dois mililitros de tampão de classificação, ressuspenda o pellet em tampão de classificação a frio e alíquota das células em dois mililitros de tampão de classificação a frio por tipo de amostra. Depois de girar as amostras novamente, suspenda novamente os pellets em 25 microlitros de tampão de classificação a frio e incube as células em cinco microlitros de bloco FC humano no gelo por 20 minutos. Em seguida, incube os tubos com 20 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado.Após 20 minutos, lave as células em mais dois mililitros de tampão de classificação a frio e ressuspenda os pellets em um a 2 milhões de células por mililitro. Em mais tampão, alíquota de 100 microlitros de meio de cultura de células T humanas em cada poço de uma placa de cultura de células de fundo redondo de 96 poços e armazene a placa no gelo até que a classificação seja concluída. Após a classificação, centrifugue a placa e coloque as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de 6% de CO2.Em seguida, misture o volume apropriado de grânulos ativadores por vórtice e transfira o volume apropriado de grânulos para um tubo estéril de cinco mililitros. Depois de lavar as esferas do ímã, transvase a solução de lavagem e adicione 100 microlitros de cultura de células T humanas, meio por 0,5 microlitros de microesferas ao tubo. Em seguida, alíquota de 100 microlitros da suspensão do cordão ativador para cada poço da placa de 96 poços e retorne as células para a incubadora.Pequenos aglomerados de células em proliferação podem ser observados microscopicamente após cinco a sete dias de cultivo, 14 dias após o isolamento celular. Substitua cuidadosamente 100 microlitros de meio do topo das culturas por 100 microlitros de cultura de células T humanas frescas. Os aglomerados de células médias grandes devem ser visíveis microscopicamente dois a três dias após a alimentação macroscopicamente, os pellets celulares devem se tornar visíveis durante os 14 dias após a mudança do meio.Após 28 dias após o isolamento celular, transfira todo o volume de 200 microlitros das culturas positivas para o crescimento para poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços contendo 200 microlitros de meio de cultura de células T humanas. Em seguida, adicione 12,5 microlitros das microesferas estimulatórias anti CD três, anti CD 28 em 100 microlitros de meio de cultura de células T humanas e retorne a placa à incubadora três a cinco dias após a reestimulação. O meio deve começar a ficar amarelo palha.Neste ponto, transfira as culturas para poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e adicione 500 microlitros de meio de células T humanas a cada cultura. Finalmente, 10 a 14 dias após a reestimulação, colete 200 microlitros de cada cultura de células T para avaliar sua especificidade aloantígeno por análise de citometria de fluxo de seu peptídeo. MHC Ligação tetrâmero O rendimento esperado de células T específicas do antígeno alo, dependerá do doador, do antígeno alo, do antígeno usado e da frequência correspondente de células T reativas no doador.Por exemplo, um doador saudável médio terá de 4.500.000 a 10 milhões de leucócitos por mililitro de sangue, aproximadamente 20% dos quais são linfócitos T. Esses gráficos de pontos ilustram os resultados da medição da ligação de células T de um doador HLAD quatro negativo a um antígeno alológico específico. Por exemplo, neste experimento, uma frequência de uma em 4.776 células T específicas do antígeno alo-antígeno foram enumeradas a partir de um número inicial de 20 milhões de leucócitos dessa população de células iniciais.88 células T individuais marcadas com temer puderam ser isoladas e, após duas rodadas de estimulação e cultura de microesferas, duas culturas positivas de crescimento foram identificadas por um exame microscópico e sua especificidade aloantígeno foi avaliada examinando sua ligação do A 2 30 48 HLA DR. Quatro tetrâmeros. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar as culturas de células diariamente para evitar a morte celular e o crescimento excessivo das culturas. Após esse procedimento, os clones de células T podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como examinar a bioquímica do reconhecimento alogênico de ligantes e como isso se traduz em respostas imunes eficazes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a gerar clones de células T humanas alo-específicas a partir de sangue periférico usando separação magnética e citometria de fluxo. Este método permite estudar respostas imunes específicas em imunologia e transplantes.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

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