Name: Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a avaliar propriedades de células-tronco em carcinomas de ovário humano usando ensaios de esferas baseados em células individuais e múltiplas. Este método identifica populações de células-tronco tumorais com precisão superior.

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Baden-Württemberg Stiftung (Programa II de Células-Tronco Adultas) concedida a C.L. Agradecemos à Dra. Martina Konantz pela contribuição crítica e revisão do manuscrito. Agradecemos a Emmanuel Traunecker e Toni Krebs do DBM FACS Facility (Hospital Universitário de Basileia) pela assistência na classificação do FACS.

1. Geração de células humanas de carcinoma de ovário OVCAR-3 estavelmente transduzidas com Lentiviruses Contendo o Reporter Construct SOX2 Região Regulatory <ol><li> Gerar partículas lentivirais por transfecção da linha celular 293T HEK-embalagem com uma construção repórter reconhecer uma região reguladora SOX2 como descrito 10,21. NOTA: O repórter construir contém ainda um domínio desestabilização do System Shield ProteoTuner à frente da proteína tdTomato fluorescência. Shield1 se liga ao domínio desestabilização impedindo assim o proteassoma para degradar a proteína de fluorescência 22. </li><li> Transduzir células OVCAR-3 com partículas lentivirais durante um período de tempo de 24 horas. Em seguida, remover o sobrenadante viral e lavar as células com solução salina de fosfato tamponada (PBS) e cultivadas em meio completo (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). </li><li> 48 horas depois, 10 ug / ml puromicina foram adicionados às culturas e mantidas durante 5 dias para permitir a selecção de células transduzidas adequadamente. </li></ol> 2. Preparação de células de classificação e Galvanização <ol><li> Adicionar Shield1 a 1: 1000 de diluição 24 h antes da separação de células. Use estavelmente transduzidas OVCAR-3 em células sem tratamento Shield1 como controlos negativos (Figura 1). Aspirar meios de balão, lavar as células com PBS 1x e trypsinize células com 0,05% Tripsina-EDTA durante 3 min. </li><li> Pare tripsina utilizando meio completo (ver acima), contar o número de células, as células de centrifugação a 300 xg à temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender as células cuidadosamente em 0,5-1 ml de PBS estéril. </li><li> Use 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula. </li><li> Ajustar a contagem de células a 5 milhões de células por ml. </li><li> Prepare baixa fixação placas ultra-96 poços com 100 ul esferas médio (MEGM suplementado com fatores de crescimento, citocinas e suplementos,B-27, heparina-sódio; ou DMEM / F12 suplementado com factores de crescimento, citocinas e suplementos, B-27, heparina-sódio, com ou sem adição de 1% de metilcelulose, ver também a Tabela 1). Opcionalmente adicionar antibióticos para o meio a uma concentração de 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina para minimizar o risco de possível contaminação. </li><li> Ordenar as células em RFP- preparadas placas de 96 poços a partir de cima e RFP +, uma célula por cavidade (ensaio de esferas único baseado em células), e 100 células por poço (de ensaio de multi esferas baseados em células), respectivamente. Execute classificador de células tipo em comercialmente disponível (ver Materiais) usando o modo de única célula, Sort setup: 100 μ bocal, pressão do invólucro 20 psi, e rendimento de máscara 0, pureza máscara de 32, a máscara de fase 16. </li><li> Avaliar a eficiência do plaqueamento por microscopicamente conseguir poços contendo células (para o ensaio de base celular único) e por contagem do número de células em poços individuais (para o ensaio baseado em células múltiplas; Figura 2 </strong&gt;). </li><li> Incubar as células em condições normais médias em esferas (para a composição ver passo 2.6) a 37 ° C e 5% de CO 2. Suplemento de bFGF por dia (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml). </li><li> Após uma semana, contar o número de esferas de tumor emergente usando um microscópio padrão com 4X ou ampliação de 10X e um microscópio de fluorescência para detectar o sinal de fluorescência a partir do sistema repórter integrada. Contagem de esferas com um diâmetro superior a 100 um, como esferas &quot;grandes&quot; e as esferas com um diâmetro de 50 - 100 mm como &quot;pequenos&quot; esferas (Figura 3). Tenha certeza de que você contar esferas reais e não celular clusters. NOTA: Em ensaios baseados em células individuais formação esfera é mais fácil para marcar microscopicamente após 10 (contra 7) dias de cultura. </li><li> Calcular a proporção de células formadoras de esfera em RFP + e células, respectivamente RFP- em ensaios baseados em células individuais (uma placa de 96 poços para cada experiência individual) ou de multi-célula baesferas ensaios sed (um bem para cada experimento indivíduo), como apresentado por Shaw et al. 16 NOTA: Proporção de células formando esfera (%) = (número de esferas) / (número de células semeadas) x 100 </li></ol> 3. Passaging Serial de Esferas <ol><li> Colocar o conteúdo de cada cavidade dentro de um tubo estéril adequado e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Para baseados em células múltiplas esferas ensaios, reúna as esferas de um bem. Lava-se a bem 3 - 5 vezes com PBS e centrifugação mais 2 min. Para individuais baseados em células esferas ensaios, coletar esferas individuais. Devido ao baixo número de células, utilizar tubos de 1,5 ml para centrifugação e lavagem passos. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> A fim de conseguir a separação celular óptimo, incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min num agitador suave. Otimizar tripsinizaï¿½o tempo para a sua linha de células de menor taxa de morte celular: se nenhuma grandeesferas é triturado visível delicadamente com uma pipeta de ponta de 100 mL. No caso de grandes esferas ainda estão presentes, incube com tripsina outro 3 min e, em seguida, avançar para a etapa de trituração. No caso de um único ensaios baseados em células para se certificar de optimizar o tempo de rendimento óptimo das células de células vivas durante o passo de tripsinização. </li><li> Para inactivar a tripsina, adicionar 500 ul meio completo e centrifugação a 300 xg durante 10 min, no caso de ensaios de células individuais, centrifugar durante mais 2 min. </li><li> Remover sobrenadante e ressuspender as células em meio de esferas cuidadosamente. </li><li> Usar um filtro de 40 um filtro de células de tampão para se obter uma suspensão de célula única. </li><li> No caso de se utilizar células RFP- em ensaios bassed de células multi-RFP + e, avaliar a percentagem de células fluorescentes em cada poço após ressuspensão através de análise de citometria de fluxo. </li><li> Para os ensaios de replating série de células individuais, sementes de 1 célula por cavidade em um novo ultra-baixo fixação placa de 96 poços preparados tal como acima descrito. A partir de uma esfera individual, semear aproximadamente 20 poços individuais. Para os ensaios de esferas replating primários múltiplos baseados em células, as células de semente obtido a partir de um poço de esferas primárias para uma nova placa de 96 poços e contar o número de células no dia seguinte por microscopia. </li><li> Avaliar a percentagem de células formadoras de esfera em esferas secundárias ensaios usando a fórmula descrita no passo 2.11. </li></ol> Análise 4. Resultado <ol><li> Analisar os resultados de experimentos realizados em triplicatas independentes e usar o teste t de Student dois lados para analisar os valores normalmente distribuídos e de outra forma Mann-Whitney-testes para análise estatística. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Esferas culturas é um método amplamente utilizado para testar o potencial de células estaminais do cancro e para enriquecer as células estaminais do tipo em uma ampla variedade de células tumorais humanas 15,25,26. Sob estas condições de cultura, as células cancerosas que não têm capacidade de auto-renovação são esperados para diferenciar e eventualmente sofrem morte celular. Embora eles podem, inicialmente, formar grupos de células tumorais ou mesmo esferas especialmente em ensaios preliminares, eles não são...

Há evidências crescentes de que os carcinomas de ovário são compostos por misturas heterogêneas de células e abrigam as chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pelo início, manutenção e recidiva da doença após terapias citotóxicas convencionais1-3. Portanto, o desenvolvimento de estratégias moleculares direcionadas às CSCs de ovário é um objetivo importante e promete melhorar a terapia de pacientes com câncer de ovário.
Um pré-requisito para a compreensão das características moleculares das CSCs é seu isolamento confiável das não-CSCs. No entanto, a identificação de CSCs ovarianos parece desafiadora. Embora a expressão de CD133 e a atividade da aldeído desidrogenase (ALDH)4,5 tenham sido relatadas para marcar CSCs ovarianas, alguns dados indicam que esses marcadores são instáveis6. Consistentemente, no câncer de ovário, exceto, por exemplo, no carcinoma de mama7, a expressão de ALDH1 se associa a um resultado favorável8 e a expressão da variante CD44 do marcador de células-tronco proposto não tem valor prognóstico9. Mais recentemente, mostramos que a expressão da proteína de células-tronco embrionárias SOX2 confere estaminalidade às células de carcinoma de ovário10 e a alta expressão de SOX2 se associa a carcinomas de ovário e mama clinicamente agressivos11,12. Portanto, neste relatório, usamos uma construção repórter lentiviral contendo uma proteína de fluorescência vermelha (RFP) cuja expressão é controlada por uma região regulatória SOX2, como um método para isolar CSCs ovarianos putativos.
Por definição, as CSCs podem se auto-renovar e se diferenciar, dando origem a todos os tipos de células tumorais. As populações putativas de CSC precisam ser analisadas em ensaios funcionais realizados in vivo. Por razões óbvias, em células humanas, esses testes funcionais são confinados a ensaios de xenoenxerto, compreendendo principalmente o transplante de células tumorais humanas em camundongos imunocomprometidos10,13.
Um método alternativo in vitro foi oferecido por Brent Reynolds e Sam Weiss, que primeiro relataram o chamado ensaio da neuroesfera como um ensaio substituto avaliando o potencial da haste em células neurais14. Dontu e colegas confirmaram mais tarde o uso deste ensaio para avaliação do potencial de células-tronco em células mamárias15,16. Aqui, as células mamárias humanas foram plaqueadas em diferentes números em meio livre de soro suplementadas com fator de crescimento epidérmico (EGF), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), B-27 e heparina e cultivadas em condições não aderentes por sete a dez dias antes da formação da esfera ser pontuada por microscopia. Seguindo este protocolo com alguns ajustes no número de células, meio de crescimento e suplementos, vários grupos exploraram in vitro o potencial de células-tronco de vários tipos de câncer, como tumores de mama17, cérebro18, pâncreas19 e cólon20. No carcinoma de ovário, relatamos recentemente a viabilidade do ensaio em esferas e comparamos seus resultados com os coletados em modelos de xenoenxerto murino in vivo 10. Descobrimos que a superexpressão da proteína de células-tronco SOX2 aumentou tanto a formação de esferas in vitro quanto a tumorigenicidade in vivo de células de carcinoma de ovário humano10. No entanto, a frequência de células iniciadoras de esferas foi maior do que a frequência de células iniciadoras de tumor medidas in vivo10, sugerindo que o ensaio de esfera pode levar a resultados falso-positivos devido a razões técnicas ou, alternativamente, o ensaio in vivo pode ser ineficiente e resultar em resultados falso-negativos.
Neste relatório, analisamos ensaios de esferas ovarianas baseadas em múltiplas células com mais detalhes, revisamos os diferentes protocolos disponíveis na literatura e os comparamos com um único ensaio baseado em células. Mostramos que o ensaio baseado em células únicas fornece resultados mais precisos e reprodutíveis do que os ensaios baseados em várias células, que podem ser altamente influenciados pela densidade das células plaqueadas, a menos que a metilcelulose seja adicionada às culturas para imobilizar as células. No entanto, também em ensaios baseados em células únicas, o potencial de iniciação de esferas in vitro é observado com frequência mais alta do que o potencial de iniciação de tumor in vivo.

<table><tbody><tr><td>Placa de baixa fixação</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>concentração final: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>concentração final: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>concentração final: 1X</td></tr><tr><td>Heparina-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td> <td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>diluição 1: 1.000</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 (pó)</td> <td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Cell classificador</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III classificador de células</td></tr><tr><td>FACS analisador</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 citômetro de fluxo</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

avaliação das propriedades stem cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células esferas ensaios

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Anos de pesquisa indicam que os cânceres de ovário abrigam uma mistura heterogênea de células, incluindo uma subpopulação das chamadas "células-tronco cancerígenas" (CSCs) responsáveis pela iniciação, manutenção e recidiva do tumor após quimioterapias convencionais. A identificação de CSCs ovarianos é, portanto, um objetivo importante. Um método comumente usado para avaliar o potencial de CSC in vitro é o ensaio de esferas no qual as células são plaqueadas em condições de cultura não aderentes em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e a formação de esferas é pontuada após alguns dias. Aqui, revisamos os protocolos atualmente disponíveis para ensaios de esferas de câncer de ovário humano e realizamos uma análise lado a lado entre os ensaios baseados em várias células comumente usados e um sistema mais preciso baseado em placas de células únicas. Nossos resultados indicam que tanto os ensaios baseados em células múltiplas quanto os de esferas baseadas em células únicas podem ser usados para investigar a formação de esferas in vitro. Os ensaios baseados em células únicas, mais trabalhosos e caros, são mais adequados para a avaliação funcional de células individuais e levam a resultados gerais mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células podem ser fortemente influenciados pela densidade das células plaqueadas e requerem experimentos de titulação antecipadamente. A suplementação de metilcelulose para ensaios baseados em múltiplas células pode ser efetivamente usada para reduzir artefatos mecânicos.

Em ensaios de esferas convencionais, cerca de 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de células RFP- deu origem a uma esfera tumor individual no ensaio de esferas primário (Figura 4A). Além disso, as esferas formadas por RFP + células eram maiores em tamanho do que os que são formados por células RFP-. Quando colocadas em ensaios baseados em células individuais, células RFP + também formou mais esferas do que as células RFP-, confirmando os resultados acima. No entanto, havia ...

Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as propriedades das células-tronco de células de carcinoma de ovário humano usando ensaios de esferas baseadas em múltiplas e células únicas. Isso é feito selecionando primeiro as células transduzidas por lentivírus RFP de dois repórteres SOX pelo tratamento com Pur Mycin na segunda etapa, as células positivas e negativas de RFP são isoladas e revestidas por fatos como colônias de células únicas ou múltiplas por poço. Em seguida, a formação da esfera primária é analisada microscopicamente e, em seguida, as culturas da esfera primária são dissociadas e replaqueadas para análise da formação da esfera secundária.Em última análise, esses ensaios de esfera são usados para calcular a proporção de células-tronco de câncer de ovário putativas que exibem capacidade de formação de esferas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são algumas populações potenciais de células-tronco cancerígenas e qual é a frequência em toda a bolsa tumoral. Embora esse método possa fornecer informações sobre a identificação de células-tronco do câncer de ovário, ele também pode ser aplicado para isol

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Research

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Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Células-tronco cancerosas (CSCs) estão implicados na reincidência do tumor devido a chemoresistance. Nós otimizamos um protocolo para a seleção e expansão dos CSCs de linhas celulares de cancro do ovário. Ao tratar as células com a cisplatina quimioterapêutico e a cultura de uma célula-tronco nos meios de promoção para enriquecer culturas CSC não aderentes.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Os ensaios de mamosfera flutuante podem investigar o subconjunto de células-tronco de câncer de mama que sobrevivem em condições de suspensão e mostram tumorigênese aumentada quando implantadas em camundongos.  Este protocolo fornece uma medida in vitro conveniente da capacidade de formação de esferas, um proxy para a tumorigênese in vivo, ao mesmo tempo em que facilita a análise da paisagem transcricional associada ao tronco.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

As células-tronco do câncer de pâncreas (CSCs) podem ser expandidas in vitro usando a técnica de cultura de esfera independente de ancoragem, que representa uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do CSC e pode servir como o primeiro passo para desenvolver novas terapias direcionadas ao CSC. Aqui é fornecida a metodologia para expansão, análise e direcionamento de CSCs pancreáticas.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

As células-tronco do câncer de ovário (OCSC) são responsáveis pelo início, recorrência, resistência terapêutica e metástase do câncer. Considera-se que o nicho vascular do OCSC promove a auto-renovação dos OCSCs, levando à quimiorresistência. Este protocolo fornece a base para o estabelecimento de um modelo de nicho vascular OCSC reprodutível in vitro.

Avaliando as propriedades angiogenéticas de células-tronco do câncer de ovário usando o Sistema de Cocultura Tridimensional, NICO-1

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Aprenda a avaliar propriedades de células-tronco em carcinomas de ovário humano usando ensaios de esferas baseados em células individuais e múltiplas. Este método identifica populações de células-tronco tumorais com precisão superior.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

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