Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as propriedades das células-tronco de células de carcinoma de ovário humano usando ensaios de esferas baseadas em múltiplas e células únicas. Isso é feito selecionando primeiro as células transduzidas por lentivírus RFP de dois repórteres SOX pelo tratamento com Pur Mycin na segunda etapa, as células positivas e negativas de RFP são isoladas e revestidas por fatos como colônias de células únicas ou múltiplas por poço. Em seguida, a formação da esfera primária é analisada microscopicamente e, em seguida, as culturas da esfera primária são dissociadas e replaqueadas para análise da formação da esfera secundária.

Em última análise, esses ensaios de esfera são usados para calcular a proporção de células-tronco de câncer de ovário putativas que exibem capacidade de formação de esferas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são algumas populações potenciais de células-tronco cancerígenas e qual é a frequência em toda a bolsa tumoral. Embora esse método possa fornecer informações sobre a identificação de células-tronco do câncer de ovário, ele também pode ser aplicado para isolar células-tronco cancerígenas de outras entidades tumorais sólidas, como carcinoma de mama.

24 horas após a transdução de células de carcinoma de ovário humano com partículas lentivirais, remova o sobrenadante viral e lave as células em cultura de PBS. As células em meio completo por 48 horas. Em seguida, mude o meio e adicione 10 microgramas por mililitro de piromicina após cinco dias.

Trate as culturas com escudo um em uma diluição de um a 1000 no dia seguinte. Lave as células em PBS e depois separe-as com 0,05% de tripsin EDTA. Após três minutos, pare a reação com meio completo.

Contar as células e centrifugá-las durante cinco minutos a 300 vezes G e à temperatura ambiente. Ressuspenda as células cuidadosamente em 0,5 a um mililitro de PBS estéril e, em seguida, coe a suspensão celular resultante através de um filtro de 40 micrômetros. Ajuste as células para uma diluição de cinco vezes 10 para as seis células por mililitro e, em seguida, adicione 100 microlitros de esferas médias a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa em seguida para um ensaio de esfera baseado em célula única.

Use o modo de célula única para classificar uma célula em cada poço da placa. Em seguida, marque microscopicamente as células para avaliar a eficiência do revestimento. Incubar as células em esferas frescas, médias a 37 graus Celsius e 5% de CO2 com suplementação diária de fator de crescimento básico de fibroblastos e fator de crescimento epidérmico.

Após uma semana, determinar o número de esferas tumorais emergentes por microscopia de luz e a presença do sinal fluorescente do sistema repórter integrado por microscopia fluorescente. Conte as esferas com diâmetro superior a 100 micrômetros como esferas grandes e as esferas com diâmetro de 50 a 100 micrômetros como esferas pequenas. Tomando cuidado para contar esferas reais e não aglomerados de células.

Em seguida, calcule a proporção de células RFP positivas ou negativas de RFP formadoras de esferas de acordo com a fórmula de passagem. As esferas começam transferindo o conteúdo de cada poço para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro. Em seguida, enxágue cada poço três a cinco vezes com PBS para coletar todas as esferas e girar as células por 10 minutos a 300 vezes G e temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova o snat e resus suspenda os pellets em 200 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius em um agitador macio por cinco minutos. Se nenhuma esfera grande for visível após cinco minutos, tritrate suavemente a solução celular com uma ponta de pipeta de 100 microlitros e adicione 500 microlitros de meio completo para inativar a tripsina. Gire as células para baixo, ressuspenda os pellets cuidadosamente em esferas médias e drene a suspensão celular resultante através de um filtro de 40 micrômetros, conforme recém-classificado.

Finalmente, para o replaqueamento em série das células individuais, semeie células únicas de uma esfera primária em 100 microlitros de esferas, médio por poço em uma nova placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Em seguida, use a mesma fórmula do ensaio de esferas primárias para avaliar a proporção de células formadoras de esferas nas esferas secundárias. Ensaios em esferas baseadas em múltiplas células analisam quase 40% das células de carcinoma de ovário humano positivas para RFP em comparação com apenas 20% das células negativas para RFP deram origem a uma esfera tumoral individual no ensaio de esferas primárias.

Surpreendentemente, um número maior de esferas é contado a partir de um número menor de células plaqueadas em meios baseados em MGEM e DMEF 12, demonstrando que as modalidades de plaqueamento influenciaram muito os resultados neste ensaio. Em contraste, quando as células são imobilizadas pela adição de 1% de metilcelulose, a eficiência da formação da esfera é principalmente independente da densidade celular em culturas de esferas baseadas em várias células. Aproximadamente 35% das células das esferas positivas para RFP perdem seu sinal fluorescente vermelho após sete dias de cultivo, sugerindo que essas células sofreram diferenciação, enquanto mais de 65% das células retêm um sinal de RFP sugerindo uma capacidade de auto-renovação.

Em contraste, as células de esferas geradas a partir de células inicialmente negativas para RFP permanecem negativas para RFP, indicando que não podem restabelecer o potencial das células-tronco nessas condições. A microscopia de fluorescência realizada em esferas geradas a partir de células únicas confirma esses dados, demonstrando que esferas únicas derivadas de células positivas para RFP contêm células positivas para RFP e negativas para RFP. Considerando que as esferas derivadas de células negativas RFP mantêm sua falta de sinal vermelho Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como anticorpos, coloração ou análise de expressão gênica via PCR quantitativo, podem ser realizados para caracterizar ainda mais as células com capacidade de formação severa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que ensaios de transplante in vivo em camundongos imunossuprimidos precisam ser realizados para validar as propriedades das células-tronco tumorais das células iniciadoras da esfera.