Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios
3 de janeiro de 2015
Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar as propriedades das células-tronco de células de carcinoma de ovário humano usando ensaios de esferas baseadas em múltiplas e células únicas. Isso é feito selecionando primeiro as células transduzidas por lentivírus RFP de dois repórteres SOX pelo tratamento com Pur Mycin na segunda etapa, as células positivas e negativas de RFP são isoladas e revestidas por fatos como colônias de células únicas ou múltiplas por poço. Em seguida, a formação da esfera primária é analisada microscopicamente e, em seguida, as culturas da esfera primária são dissociadas e replaqueadas para análise da formação da esfera secundária.
Em última análise, esses ensaios de esfera são usados para calcular a proporção de células-tronco de câncer de ovário putativas que exibem capacidade de formação de esferas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são algumas populações potenciais de células-tronco cancerígenas e qual é a frequência em toda a bolsa tumoral. Embora esse método possa fornecer informações sobre a identificação de células-tronco do câncer de ovário, ele também pode ser aplicado para isolar células-tronco cancerígenas de outras entidades tumorais sólidas, como carcinoma de mama.
24 horas após a transdução de células de carcinoma de ovário humano com partículas lentivirais, remova o sobrenadante viral e lave as células em cultura de PBS. As células em meio completo por 48 horas. Em seguida, mude o meio e adicione 10 microgramas por mililitro de piromicina após cinco dias.
Trate as culturas com escudo um em uma diluição de um a 1000 no dia seguinte. Lave as células em PBS e depois separe-as com 0,05% de tripsin EDTA. Após três minutos, pare a reação com meio completo.
Contar as células e centrifugá-las durante cinco minutos a 300 vezes G e à temperatura ambiente. Ressuspenda as células cuidadosamente em 0,5 a um mililitro de PBS estéril e, em seguida, coe a suspensão celular resultante através de um filtro de 40 micrômetros. Ajuste as células para uma diluição de cinco vezes 10 para as seis células por mililitro e, em seguida, adicione 100 microlitros de esferas médias a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa em seguida para um ensaio de esfera baseado em célula única.
Use o modo de célula única para classificar uma célula em cada poço da placa. Em seguida, marque microscopicamente as células para avaliar a eficiência do revestimento. Incubar as células em esferas frescas, médias a 37 graus Celsius e 5% de CO2 com suplementação diária de fator de crescimento básico de fibroblastos e fator de crescimento epidérmico.
Após uma semana, determinar o número de esferas tumorais emergentes por microscopia de luz e a presença do sinal fluorescente do sistema repórter integrado por microscopia fluorescente. Conte as esferas com diâmetro superior a 100 micrômetros como esferas grandes e as esferas com diâmetro de 50 a 100 micrômetros como esferas pequenas. Tomando cuidado para contar esferas reais e não aglomerados de células.
Em seguida, calcule a proporção de células RFP positivas ou negativas de RFP formadoras de esferas de acordo com a fórmula de passagem. As esferas começam transferindo o conteúdo de cada poço para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro. Em seguida, enxágue cada poço três a cinco vezes com PBS para coletar todas as esferas e girar as células por 10 minutos a 300 vezes G e temperatura ambiente.
Após a centrifugação, remova o snat e resus suspenda os pellets em 200 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius em um agitador macio por cinco minutos. Se nenhuma esfera grande for visível após cinco minutos, tritrate suavemente a solução celular com uma ponta de pipeta de 100 microlitros e adicione 500 microlitros de meio completo para inativar a tripsina. Gire as células para baixo, ressuspenda os pellets cuidadosamente em esferas médias e drene a suspensão celular resultante através de um filtro de 40 micrômetros, conforme recém-classificado.
Finalmente, para o replaqueamento em série das células individuais, semeie células únicas de uma esfera primária em 100 microlitros de esferas, médio por poço em uma nova placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Em seguida, use a mesma fórmula do ensaio de esferas primárias para avaliar a proporção de células formadoras de esferas nas esferas secundárias. Ensaios em esferas baseadas em múltiplas células analisam quase 40% das células de carcinoma de ovário humano positivas para RFP em comparação com apenas 20% das células negativas para RFP deram origem a uma esfera tumoral individual no ensaio de esferas primárias.
Surpreendentemente, um número maior de esferas é contado a partir de um número menor de células plaqueadas em meios baseados em MGEM e DMEF 12, demonstrando que as modalidades de plaqueamento influenciaram muito os resultados neste ensaio. Em contraste, quando as células são imobilizadas pela adição de 1% de metilcelulose, a eficiência da formação da esfera é principalmente independente da densidade celular em culturas de esferas baseadas em várias células. Aproximadamente 35% das células das esferas positivas para RFP perdem seu sinal fluorescente vermelho após sete dias de cultivo, sugerindo que essas células sofreram diferenciação, enquanto mais de 65% das células retêm um sinal de RFP sugerindo uma capacidade de auto-renovação.
Em contraste, as células de esferas geradas a partir de células inicialmente negativas para RFP permanecem negativas para RFP, indicando que não podem restabelecer o potencial das células-tronco nessas condições. A microscopia de fluorescência realizada em esferas geradas a partir de células únicas confirma esses dados, demonstrando que esferas únicas derivadas de células positivas para RFP contêm células positivas para RFP e negativas para RFP. Considerando que as esferas derivadas de células negativas RFP mantêm sua falta de sinal vermelho Seguindo este procedimento.
Outros métodos, como anticorpos, coloração ou análise de expressão gênica via PCR quantitativo, podem ser realizados para caracterizar ainda mais as células com capacidade de formação severa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que ensaios de transplante in vivo em camundongos imunossuprimidos precisam ser realizados para validar as propriedades das células-tronco tumorais das células iniciadoras da esfera.
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Visão Geral
Este estudo avalia as propriedades de células-tronco de células de carcinoma ovariano humano utilizando ensaios de esferoides baseados em uma única célula e em múltiplas células. Os resultados sugerem que os ensaios baseados em uma única célula fornecem resultados mais precisos em comparação com os ensaios baseados em múltiplas células, que podem ser influenciados pela densidade celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Células-Tronco Cancerígenas
- Carcinoma de Ovário
- Técnicas de Cultura de Células
Contexto
- Ensaios de esferoides in vitro são essenciais para identificar células-tronco cancerígenas.
- Ensaios baseados em célula única são mais trabalhosos, mas proporcionam maior precisão.
- Ensaios baseados em múltiplas células podem ser afetados pela densidade das células em cultura.
- Esta pesquisa pode ser estendida a outros tumores sólidos, como o carcinoma de mama.
Objetivo do Estudo
- Avaliar as características de células-tronco em células de câncer de ovário.
- Comparar a eficácia de ensaios de esferoides baseados em uma única célula versus múltiplas células.
- Identificar populações potenciais de células-tronco cancerígenas dentro de tumores.
Métodos Utilizados
- Seleção de células transduzidas com lentivírus reporter de SOX2-RFP.
- Isolamento de células positivas e negativas para RFP para semeadura.
- Análise microscópica da formação de esferas primárias.
- Dissociação e ressemadura de culturas de esferas primárias para análise secundária.
Resultados Principais
- Ensaios baseados em célula única forneceram resultados mais confiáveis.
- Ensaios baseados em múltiplas células mostraram variabilidade conforme a densidade celular.
- Identificou a proporção de células-tronco de câncer de ovário com capacidade de formação de esferoides.
- Metodologia aplicável a outros tipos de câncer.
Conclusões
- Ensaios baseados em célula única são recomendados para a identificação precisa de células-tronco cancerígenas.
- Ensaios com múltiplas células podem ser úteis, mas exigem cuidadosa consideração da densidade celular.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão da dinâmica das células-tronco cancerígenas em tumores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação precisa de populações de células-tronco cancerígenas é fundamental para reduzir os riscos na validação de alvos oncológicos e melhorar a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. Ensaios de esferoides baseados em células individuais fornecem uma leitura funcional mais confiável da condição de tronco, minimizando artefatos decorrentes da densidade celular e agregação, além de apoiar a compreensão mecanicista no estágio inicial de descoberta. Essa abordagem permite que equipes de biofármacos priorizem alvos com maior validação biológica e reduzam a desistência em fases avançadas devido à compreensão incompleta do alvo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar e avaliar a capacidade de formação de esferoides em subpopulações putativas de células-tronco cancerígenas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da medição quantitativa da eficiência de formação de esferoides em células positivas para RFP versus células negativas para RFP.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao distinguir células verdadeiramente semelhantes a células-tronco de seus descendentes diferenciados com base em marcadores de auto-renovação e diferenciação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: O plaqueamento de células individuais em meio para esferoides com adesão ultra-baixa permite a quantificação padronizada e reprodutível de unidades formadoras de esferoides.
- Resultado quantitativo: Permite a contagem da formação de esferoides primários e secundários para avaliar a capacidade de autorrenovação ao longo de passagens seriadas.
- Consideração sobre escalabilidade: A suplementação com metilcelulose em ensaios com múltiplas células reduz artefatos mecânicos e a variabilidade dependente da densidade, melhorando a robustez do ensaio para aplicações de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Os ensaios de esferoides conectam a descoberta e a validação pré-clínica ao fornecerem um correlato funcional da frequência de células iniciadoras de tumor.
- Alinhamento de Biomarcadores: A retenção do sinal de RFP em esferoides derivados de células positivas para o repórter SOX2 apoia o uso de repórteres fluorescentes como biomarcadores translacionais de potencial de células-tronco.
- Avanço Ajustado ao Risco: A formação diferencial de esferoides entre populações positivas e negativas para RFP permite a estratificação de subconjuntos celulares para estudos mecanicistas ou terapêuticos subsequentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai da validação do alvo à identificação de compostos ativos, no qual ensaios funcionais com células-tronco fornecem subsídios para a confiança no alvo e orientam a triagem de compostos em sistemas relevantes para a doença.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre marcadores de células-tronco e atividade de vias ao associar a expressão de SOX2-RFP à formação funcional de esferoides.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio do plaqueamento de célula única ou condições multicitárias suplementadas com metilcelulose, garantindo a quantificação reprodutível de esferoides.
- Análises: Gera leituras quantitativas, como frequência de formação de esferoides e capacidade de replante secundário, apoiando análises comparativas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao identificar células com capacidade de autorrenovação que podem estar correlacionadas com a iniciação tumoral in vivo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma funcional de ensaio reutilizável, aplicável a modelos de tumores sólidos para enriquecimento e validação de células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na identificação de células-tronco cancerígenas ao fornecer uma leitura funcional direta das propriedades de tronquidade.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de condições padronizadas de semeadura e do uso opcional de metilcelulose para mitigar artefatos dependentes da densidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao aumentar a confiança na biologia do alvo e reduzir o risco de investigar populações não-tronco.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na frequência validada de células-tronco cancerígenas e na capacidade de auto-renovação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em classificação celular, técnicas de cultura estéril de esferoides e microscopia de fluorescência para o rastreamento de repórteres.
- Depende do acesso à citometria de fluxo ou FACS para isolamento de células individuais e infraestrutura para transdução com lentivírus.
- Necessita otimização da densidade de plaqueamento e da formulação do meio, incluindo suplementação com fatores de crescimento (bFGF, EGF).
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a outros tipos tumorais ou sistemas de repórter além do SOX2-RFP.
- Limitado pela necessidade de replante seriado e cultura de longo prazo para avaliar a autorrenovação, o que aumenta o tempo e a demanda por recursos.
