Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

O objetivo deste procedimento é cultivar e eletrooperar embrionário de camundongo, cóclea exvivo. A fim de estudar vários aspectos do desenvolvimento coclear, incluindo diferenciação da morfogênese e eventos de crescimento, isso é feito obtendo primeiro a cabeça de um embrião de camundongo embrionário do dia 13. Em seguida, exponha os ouvidos internos removendo o cérebro e isole-os do osso temporal em desenvolvimento, separando-os da base do crânio.

Em seguida, remova a cartilagem sobrejacente e abra o ducto coclear para obter o epitélio sensorial da cóclea. A etapa final é a cultura da cóclea dissecada com ou sem eletroporação por até uma semana. Em última análise, os implantes podem ser analisados para imagens de células vivas ou coloração imunológica fixa e analisados por imagens confocais, a cultura de embrionários de camundongos.

O explanação coclear fornece um excelente sistema para estudar vários aspectos da organogênese, como proliferação, especificação de sulfato e polaridade na cóclea em desenvolvimento e como esses eventos contribuem para o crescimento e a diferenciação. Portanto, essa técnica permite realizar manipulações farmacológicas e monitorar as funções gênicas ex vivo. E assim, essa técnica, juntamente com a transferência de genes via eletroporação, pode-se alterar a expressão do gene de interesse e monitorar sua função em um único nível de célula.

Para iniciar este procedimento, coloque uma cabeça de embrião de camundongo E 13 em um prato de sogar estéril contendo solução de dissecação a frio. Sob um microscópio de dissecação, imobilize a cabeça do embrião colocando pinos de minúcias ao redor da região do olho. Em seguida, usando dois pares de pinças estéreis, remova cuidadosamente a pele e abra o crânio no lado dorsal ao longo da linha média.

Depois disso, remova o cérebro da cavidade craniana. Os ouvidos internos localizados dentro dos ossos temporais podem ser identificados a partir do revestimento do vaso sanguíneo ao seu redor. Em seguida, disseque os ouvidos internos dos ossos temporais, colocando a pinça sob o tecido e isolando o ouvido interno da base do crânio.

Em seguida, transfira as orelhas internas dissecadas para um novo prato contendo solução de dissecação fria. Agora oriente o ouvido interno de modo que o lado ventral fique voltado para cima. Estabilize o ouvido interno inserindo suavemente a extremidade afiada dos pinos do minuchin através da porção vestibular.

Usando uma pinça ultrafina, corte a cartilagem sobrejacente fazendo uma incisão perto da janela oval. Certifique-se de que a pinça não esteja inserida muito profundamente na cartilagem, pois a cartilagem sobrejacente às vezes é fundida com o ducto coclear. Em seguida, remova cuidadosamente a cartilagem da cóclea.

Em seguida, exponha o epitélio sensorial colocando a pinça na base ou no ápice do ducto coclear e puxe suavemente o teto da cóclea para fora. Como última etapa, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo subjacente do epitélio sensorial exposto para que a base do explanamento coclear fique plana. Em seguida, isole a cóclea dissecada da porção vestibular da orelha interna.

Transfira o epitélio sensorial coclear dissecado para a matriz da membrana basal Revestir bem a cultura usando uma colher estéril de 1,5 milímetro Se for necessária uma limpeza adicional para remover o tecido extra, isso pode ser realizado durante este estágio. Em seguida, oriente a explicação coclear com a superfície luminal do epitélio voltada para cima. Aspire a solução DMEM da matriz da membrana basal para achatar cuidadosamente o tecido e adicione suavemente 150 microlitros de meio de cultura fresco ao prato.

Certifique-se de que cada x explane a adira bem à lamínula de vidro revestida e não esteja flutuando no meio de cultura. Em seguida, transfira suavemente a cóclea microdissecada para uma placa de cultura estéril de 150 milímetros e coloque-a em uma incubadora de cultura de tecidos. A 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a seis DIV.

Após 1D IV. Examine a cultura sob um microscópio de dissecação para certificar-se de que a explicação coclear tenha uma boa aderência à placa de cultura. Em seguida, continue a incubar a cultura in vivo pelo período de tempo desejado antes de processá-la para imuno-histoquímica para preparação para eletroporação. Primeiro esterilize um prato de vidro revestido de charuto de 100 milímetros por autoclave ou imersão em etanol a 70% por cerca de 20 minutos.

Em seguida, deixe-o secar ao ar em uma bancada limpa antes de usar. Agora prepare o DNA a partir de um vetor de expressão de sua escolha usando um kit de preparação maxi ou MIDI apropriado. Os vetores de expressão usados neste protocolo são uma construção de expressão H one e uma construção de expressão neuro D one.

E a concentração final de DNA deve ser de pelo menos um micrograma por microlitro em RNAs de DNA estéreis, água livre para eletrooperar o DNA no explanar coclear ênico. Adicione 10 microlitros de solução de DNA de plasma a um prato fresco revestido de charuto de 100 milímetros. Em seguida, transfira uma explicação coclear totalmente dissecada para a solução de DNA com a superfície luminal do epitélio voltada para cima.

Incline a cóclea ligeiramente para que fique perpendicular ao plano da antena. Em seguida, coloque a pá do eletrodo negativo em direção ao epitélio sensorial e a pá do eletrodo positivo próximo à base da cóclea usando o eletrotomador. Fornece nove a 10 pulsos de duração de pulso de 24 milivolts e 30 milissegundos.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura quente à cóclea eletroclassificada. Repita os procedimentos para toda a explicação coclear e para o DNA de todos os genes de interesse antes de transferir a cóclea eletro classificada para a placa revestida com matriz de membrana basal para revestimento. Em seguida, cultive toda a cóclea eletro classificada em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% pelo período de tempo desejado, que será então processada para imunocitoquímica.

Essas imagens mostram os implantes cocleares embrionários do dia 13 dos pubs de camundongos CD one do tipo selvagem, que são eletroporados com um TH one, EEG FP ou neuro D um EGFP Reporter construções. Eles foram imunomarcados com marcador específico de células ciliadas, anti myo sete A ou marcador neuronal dois para um em vermelho. As células eletroavaliadas, que podem ser visualizadas pela expressão de EGFP, são vistas em toda a crista epitelial maior, crista epitelial menor e células epiteliais sensoriais.

As células epiteliais cocleares neuro D one transfectadas após cinco DIV adquiriram o fenótipo neuronal com processos dendríticos, a maioria dos quais foram positivos para dois ou um T oh H. As células transfectadas foram positivas para myo sete. Uma expressão Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas para o intel litro de oito a 10 pops.

Isso permitirá tempo suficiente para cultura de dissecação, eletroporação e plaqueamento do explan.