Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

O objetivo geral deste procedimento é entregar bactérias de forma não invasiva diretamente nos pulmões de camundongos. Isso é feito carregando primeiro uma almofada de ar de 150 microlitros em uma seringa à prova de gás, seguida por 50 microlitros da suspensão bacteriana preparada. Na segunda etapa, um camundongo anestesiado é intubado com um cateter de calibre 20 usando um fio-guia para auxiliar na colocação.

Então, depois de confirmar o sucesso da intubação usando um medidor de fluxo simples, o inóculo bacteriano é administrado através do cateter diretamente no pulmão com uma agulha romba de calibre 22. Em última análise, a inoculação intratraqueal mediada por intubação ou omitir pode ser usada para estudar a doença do trato respiratório inferior em camundongos, evitando o envolvimento concomitante do trato respiratório superior. A principal vantagem do imit sobre os métodos de inoculação internasal é que essa técnica permite a entrega precisa e reprodutível de um inóculo diretamente nos pulmões.

Como o IIT é uma técnica não cirúrgica, também reduz o potencial de complicações associadas a procedimentos intratraqueais cirúrgicos. Embora esse método possa fornecer um mecanismo confiável para fornecer bactérias ao pulmão para estudar a patogênese, o IMA também pode ser aplicado à entrega de outros reagentes, como compostos ambientais para estudar danos pulmonares, entrega de terapias para tratamento e entrega de sondas de imagem ou SRNA para estudar a biologia pulmonar básica. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a etapa de intubação, pois a etapa requer um posicionamento cuidadoso do animal e do escopo automático para inserção do fio-guia.

A demonstração visual desse método é útil, pois a colocação inicial do fio-guia na traqueia é conceitualmente difícil de descrever para novos pesquisadores. 15 horas antes da instalação, inocule três mililitros de cultura de caldo com uma única colônia bacteriana e cultive a cultura a 37 graus Celsius e um agitador a 200 RPM. Após 15 horas, gire um mililitro das células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e ressuspenda o palato em um mililitro de PBS.

Em seguida, medir uma diluição de uma a 10 da suspensão de reserva bacteriana a uma OD 600 para determinar a concentração bacteriana. Em seguida, dilua as células bacterianas em PBS até a concentração desejada de bactérias por 50 microlitros de inóculo. Para a instalação do IIT, os camundongos são preparados para o IIT administrando uma solução de lidocaína a 2% a um camundongo levemente anestesiado por camundongos com agulha de gavagem.

Um retorno à anestesia enquanto a lidocaína faz efeito. Agora aspire 150 microlitros de ar em uma seringa de rescisão do tipo gás de 250 microlitros, equipada com uma agulha romba de calibre 22. Em seguida, avance o êmbolo de Teflon da marca de 150 microlitros para a marca de 200 microlitros no corpo da seringa para extrair 50 microlitros do inóculo bacteriano quando a seringa estiver carregada.

LA, um rato sedado em decúbito dorsal em uma plataforma de intubação prendendo o animal pelos incisivos em um anel sem anel preso a uma tira de Velcro conectada à plataforma. Levante o mouse para uma inclinação de 45 graus e, em seguida, use um aplicador de micro algodão para retrair a língua com um movimento de rolamento com a mão dominante. Em seguida, com a mão não dominante, use um otoscópio cirúrgico ajustado com um especular de intubação para manter a retração da língua e visualizar a epiglote.

Em seguida, segurando um fio-guia enfiado em um cateter de calibre 20 na mão dominante, intube o camundongo a uma profundidade de 10 milímetros dentro da traqueia e remova o otoscópio. Prenda o cateter com a mão não dominante. Em seguida, prenda brevemente um comprimento conectado à isca de um 16º tubo transparente contendo um corante colorido ao cateter.

O corante deve migrar rapidamente para frente e para trás em resposta à respiração do animal quando o animal tiver sido intubado com sucesso. Insira a agulha romba de calibre 22 no cateter e dispense o inóculo diretamente no pulmão em um único movimento de fluido. Em seguida, remova imediatamente a agulha e o cateter do animal e retorne o camundongo à sua gaiola com monitoramento até que o animal esteja totalmente recuperado da anestesia.

Para avaliar a carga bacteriana do tecido pulmonar infectado, remova os pulmões usando a técnica estéril e coloque o tecido em um saco de amostra estéril pré-pesado de uma onça. Depois de pesar o saco de amostra mais os pulmões, adicione um mililitro de PBS estéril ao tecido e revenda o saco de amostra. Em seguida, role suavemente uma pipeta sorológica de 25 mililitros sobre o saco de amostra para homogeneizar o tecido.

Remova o tecido conectado através de um filtro de poliéster estéril e trate o homogeneizado com tritton X 100 a uma concentração final de 1% para liberar as bactérias. Em seguida, use uma pipeta multicanal para conduzir uma diluição serial sêxtupla do homogenato em uma placa de 96 poços UBO. Em seguida, use um multicanal de oito poços para colocar as alíquotas de 10 microlitros triplicadas homogeneizadas em uma placa de ágar LBA.

Finalmente, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius e enumere as unidades formadoras de colônias no dia seguinte. A entrega da bactéria é altamente eficiente por meio deste método, com mais de 98% do inóculo de aerogênio de pseudomonas recuperado dos pulmões dos animais instilados neste experimento representativo. Além disso, a instalação do IIT é altamente reprodutível, independentemente da concentração do inóculo administrado.

Para visualizar a distribuição do material instilado, através do método IIT, 50 microlitros de corante azul brilhante Kumasi 0,1% podem ser entregues aos pulmões, conforme demonstrado para o inóculo. Observe a distribuição do corante para todos os lobos do pulmão Uma vez dominado. Este método pode ser realizado rapidamente com uma equipe de dois pesquisadores em um tempo médio de dois a três minutos, incluindo anestesia, inoculação de IMA e recuperação da anestesia.

Ao tentar este procedimento, é importante não fazer mais de duas tentativas fracassadas de intubar o mouse. A falha na intubação pode resultar em trauma potencial ao inserir o cateter no esôfago em vez da traqueia. Muitos patógenos respiratórios, incluindo aqueles que requerem contenção abs L três, podem ser efetivamente administrados por imed, pois esse procedimento pode ser realizado conforme demonstrado em gabinetes de segurança e, adicionalmente, por pesquisadores usando proteção respiratória total, incluindo um protetor facial.

Demonstramos que o imit é um método muito preciso e eficiente para a entrega de materiais diretamente nos pulmões de camundongos. Essas propriedades tornam o imit adequado para estudos do tipo GLP que requerem sistemas modelo altamente reprodutíveis.