Name: Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a derivar epitélio pigmentar da retina (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) utilizando diferentes tamanhos de corpos embrióides. Este método otimiza a diferenciação celular para pesquisas em biologia de células-tronco.

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As opiniões ou afirmações aqui contidas são opiniões privadas dos autores e não devem ser interpretadas como oficiais ou como refletindo as opiniões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene e Jae-Hyek Choi possuíam uma Associação de Pesquisa de Pós-Doutorado do Conselho Nacional de Pesquisa no USAISR. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Medicina de Reabilitação Clínica do Exército dos EUA (CRMRP) e pelo Programa de Pesquisa em Medicina Operacional Militar (MOMRP).

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura <ol><li> Prepare meio de cultura livre de células-tronco-alimentador por adição de 100 ml de suplemento de 5x isento de soro a 400 ml de meio basal de células estaminais. O meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Adicionar 10 mM solução de associado-ró, coiled-coil contendo proteína quinase (Rock) inibidor para comercialmente disponível corpo embryoid (EB) médio de formação (Y-27362). </li><li> Prepare meio de diferenciação pela adição de 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 10% de substituição de soro nocaute (KSR) e 10 ug / ml de gentamicina a Modified Eagle Médium / Nutrient Mixture Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Prepare meio iPS-RPE por adição de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, sal de sódio de 13 ng / ml triiodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina e 15% de soro bovino fetal (FBS) &lt;sup&gt; 21 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM). Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Preparar a solução estoque de sal de sódio triiodo-L-thyronine. Dissolve-se 1 mg de sal de sódio triiodo-L-tironina em 1 N de hidróxido de sódio por agitação suave. Adicionar 49 ml de MEM para fazer 50 ml de 20 ug / ml de sal de sódio triiodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final. </li><li> Preparar a solução de estoque de hidrocortisona. Solubiliza-se 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol a 100% por agitação suave. Adicionar 19 ml de MEM para fazer 20 ml de 50 ug / ml de solução de estoque de hidrocortisona. Alíquotas e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de dispase a 1 mg / ml em DMEM / F12. </li><li> Preparação das placas de matriz revestido <ol><li> Prepare matriz proteína extraída da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma si em DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1 ml da solução de matriz. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Após a incubação de 1 hora, aspirar o excesso de DMEM / F12. Adicionar 0,5 ml de meio de cultura de células estaminais livre de alimentador para evitar a secagem dos poços. As placas de matriz revestida está pronto para uso. </li></ol></li><li> Para preparar as placas de micropoços, por lavagem de cada poço com 2 ml de DMEM / F12. Remover DMEM / F12 e adicionar 0,5 ml de meio de formação de EB suplementado com inibidor da rocha a cada poço. Centrifugar a placa a 2000 xg durante 5 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Preparar tampão de coloração de FACS através da mistura de 2% de FBS e 0,09% de azida de sódio em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ajustar o tampão de pH 7,4. </li><li> Preparar a solução de neutralização de tripsina por adição de 10% FBS para DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Antes da semeadura de células iPS, warm-tronco meio de cultura de células sem alimentador de até 37 ° C, e têm a matrix placas revestidas pronto. </li><li> Rapidamente descongelar as células iPS IMR90-1 em um banho de água a 37 ° C. Em seguida, retire o crio-frasco do banho de água e limpe o frasco com etanol 70%. Transferem-se as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de aglomerados de células. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura de células-tronco quente livre de alimentador para as células, gota a gota e misture delicadamente. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender cuidadosamente os aglomerados de células em 2 ml de meio de cultura de células-tronco sem alimentador e semear os aglomerados de células nos poços de placa revestida com matriz. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2, 95% de humidade. </li><li> Alterar o meio de cultura de células iPS diária. Observe colônias indiferenciadas cinco a sete dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para passagem (colônias com um centro denso) sob um microscópio de luz. </li></ol> 3. Passaging de iPS Cells <ol><li> A passagem das células iPS antes de começar, aqueça a solução dispase, DMEM / F12 e haste meio de cultura de células sem alimentador de 37 ° C em banho-maria. </li><li> Antes passaging células iPS, remova todas as áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirar o meio. Lavar cuidadosamente as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM / F12 duas vezes. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de meio de cultura livre de células-tronco-alimentador para cada poço. </li><li> Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar aglomerados de células. Transfira os aglomerados de células isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar haste meio de cultura de células sem alimentador suficiente para semear a próxima passagem de células. </li></ol> 4. Geração da EBS Usando Microplacas <ol><li> Preparação de uma suspensão de células isoladas de células iPS <ol><li> Remover o medium a partir de células iPS e lave as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. Adicionar 750 ul de Accutase para células iPS em cada poço da placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células a separar da placa (cerca de 5-10 minutos). </li><li> Usar uma pipeta para dissociar suavemente as células restantes e a separar quaisquer células restantes na superfície da placa. Transferem-se as células para um tubo cónico de 50 ml. Lavar a placa com 5 ml de DMEM / F12 e combinar o enxaguado DMEM / F12 com as células no tubo cónico. Passar a suspensão de células através de um coador de células de 40 mm para remover quaisquer possíveis aglomerados de células residuais. </li><li> Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente para remover a Accutase. Ressuspender o sedimento de células em meio de formação de EB modo que a concentração de células é de cerca de 0,5-1,0 x 10 7 células / ml. </li><li> Determinar o número de células viáveis ​​por contagem das células com azul de tripano e um hemocitómetro. </li></ol></li><li> Adjusting densidade celular em micropoços para formar EBs controlada de tamanho <ol><li> Ajustar o número de células para cada poço da placa de micropoços para gerar os desejados tamanhos EB. Adicionar células aos micropoços das placas preparadas no passo 1.9, distribuir uniformemente as células por suavemente pipetando as células várias vezes. NOTA: Número de células por poço requeridas = o número desejado de células por EB x número de micropoços por poço. </li><li> Ajustar a forma formação EB suplementado com inibidor de rocha nos poços para um volume final de 2,0 ml. Redistribuir as células com cuidado pipetando cada poço. Centrifugar as placas de micropoços a 100 xg durante 3 min. Colocar as placas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas. </li></ol></li><li> EBs colheita das placas de micropoços <ol><li> Colheita de EBs micropoços por meio de pipetagem no poço cima e para baixo com uma micropipeta 1 ml para remover a maior parte dos CEs. Passar a suspensão através de uma célula EB 40 um invertidafiltro no topo de um tubo cónico de 50 ml para remover as células individuais. </li><li> Lava-se a placa de micropoços 5 vezes com 1 ml de DMEM / F12 para remover todos os CEs. Recolha lavagens e passar por cima do filtro de células invertido. Vire filtro de células do lado direito para cima para um novo tubo de 50 ml. Recolha as EBs por lavagem com meio formação EB. Contagem EBS para determinar o rendimento. </li></ol></li></ol> 5. chapeamento EBs e Iniciando Diferenciação <ol><li> Placa os CEs em matriz de proteína revestidas placas de seis poços (como no passo 1.8.1), a uma densidade de &lt;1000 EB / poço em meio de formação de EB mais 10 uM de inibidor da rocha. Incubar as CEs a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas. </li><li> 24 horas após a EB chapeamento, substitua-o por meio de diferenciação para iniciar a diferenciação. Mudar metade do meio de diferenciação em dias alternados até as células são recolhidas para análise posterior. </li><li> Recolher amostras no dia 6, 17, 29 e 60 para realizar RT-PCR, immunocytochemistry e FACS para validar a expressão de genes e proteínas do EPR característicos. </li></ol> 6. Extração de RNA e PCR <ol><li> Extrai-se ARN a partir de amostras EB acordo com as instruções fornecidas no kit disponível comercialmente. Determinar a concentração de RNA usando um espectrofotómetro. </li><li> Realizar a transcrição reversa em 100 ng de ARN total de acordo com o ARN em ADNc comercialmente disponível kit de transcrição reversa. </li><li> Executar PCR com 10 ng de ADNc, utilizando os seguintes iniciadores (Tabela 1), a uma concentração de 10 pmol / 10 ng de cDNA. Definir a PCR como se segue: desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 5 min, com 35 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de um ciclo final de 72 ° C durante 10 min. Executar o produto de PCR num gel de agarose 1%. </li></ol> 7. Immunocytochemistry <ol><li> Lavar as CEs com PBS duas vezes à temperatura ambiente. Fixar as EBs na RT em 4% paraformaldehyde durante 10 min. Lavar uma vez com PBS à temperatura ambiente. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até ser utilizado para a coloração. </li><li> No dia da coloração, tratar as células fixas com fixação e permeabilização reagentes. Incubar as amostras com a solução (10% de soro de cabra em solução de permeabilização) durante 1 h à TA bloqueio. </li><li> Realizar imunoquímica em 10% de soro de cabra em solução de permeabilização utilizando os seguintes anticorpos primários nas diluições indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubar as amostras com anticorpos O / N correspondente a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, remover o anticorpo primário a partir das células e lavar as amostras três vezes com PBS. Incubar as amostras com anticorpos secundários fluoróforos, durante 1 h à TA. </li><li> Remover o anticorpo secundário a partir das células e lavar as amostras três vezes em PBS. Montar a tampa desliza sobre lâminas de vidro com meio de montagem contendo DAPI e permitir que as amostras para definir O / N em câmara escura.Usar um microscópio de fluorescência para visualizar a coloração. </li></ol> 8. Coloração para análise FACS <ol><li> Lavar as CEs cultivadas em PBS duas vezes. Incubar as CEs com 0,5 ml de 0,25% de tripsina, durante 5-10 minutos para se obter uma suspensão de célula única. Neutraliza-se a tripsina com uma solução de tripsina neutralizante (1 ml / poço). </li><li> Transferir a suspensão de células individuais para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de DMEM / F12 para as células no tubo. Inverter cuidadosamente para misturar as células. Centrifuga-se a 600 x g. Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de coloração de FACS. </li><li> Contar o número total de células. Centrifugar a 600 xg por 10 min. Após centrifugação descarte sobrenadante. Fixar as células imediatamente por adição de 0,5 ml de paraformaldeído a 4%. Misture bem em vórtice suave. Incubar as células a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover osobrenadante. Vortex suavemente para perturbar o sedimento celular. Permeabilizar as células por adição de 1 ml de solução de permeabilização refrigeradas. Vortex suavemente para misturar e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS e ressuspender. Repita este passo para mais uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração de FACS a uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células (0,5 x 10 6 células) para cada um de microcentrífuga tubos e adicionar o volume recomendado de anticorpo primário. Para Pax6, adicionam-se 5 ul de PE anti-Pax6 em 100 ul de suspensão de células. Para MITF, adicionam-se 5 ul de anti-MITF em 100 ul de suspensão de células. </li><li> Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 60 min. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS. Misturar e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e repetir 8,16 por duas vezes adicionais. </li><li> Para a coloração de MITF, incubar as células na Antibo secundáriody, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488, a uma diluição de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para a coloração Pax6, evitar este passo. </li><li> Lavam-se as células com 5 ml de tampão de coloração de FACS e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Repetir o processo por mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células em 500 ul de tampão de coloração de FACS e vórtice suavemente para perturbar o sedimento celular. As amostras estão prontos para análise de citometria de fluxo. </li></ol> 9. iPS-RPE Isolamento e Cultura <ol><li> No dia 29, cuidadosamente cortadas à volta das colónias pigmentadas seleccionados a partir da placa de cultura utilizando uma pipeta de ponta de 200 ul. Transfira as colônias flutuantes para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se as colónias a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as colónias de células em 10 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células individuais por incubação das colónias com 2 ml de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Gentilmente vortex a suspensão de células de dissociar as colônias. </li><li> Neutralizar a tripsina, adicionando 2 ml de meio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células individuais em 2 ml de meio iPS-RPE. Transferem-se as células em uma matriz proteica revestido placa de 6 poços e lugar numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Para realizar o pleno potencial das células-tronco pluripotentes para terapia celular, é necessário regulamentar a sua diferenciação de uma forma consistente e reproduzível. Este relatório descreve os protocolos para formar EBs controlada porte usando tecnologia de microplaca, iniciar a diferenciação em direção RPE e identificar marcadores de proteínas e genes de RPE. Para sincronizar a diferenciação in vitro, tamanhos homogêneos da EBS foram formados por um número conhecido de células iPS centrifugado em placa...

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são um tipo de célula-tronco pluripotentes derivadas através da reprogramação de células adultas com fatores extrínsecos 1. Em contraste, as células estaminais embrionárias (CES), um outro tipo de célula de tronco pluripotente, são gerados a partir da massa celular interna do blastocisto 2-3. Apesar de suas origens diferentes, as células iPS e CES são comparáveis ​​em sua capacidade ilimitada para replicar in vitro e na sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula 4-5. Estas características de células iPS torná-los os candidatos ideais para aplicações em medicina regenerativa personalizado. Os recentes esforços de pesquisa estão focados no desenvolvimento de protocolos de diferenciação robustos para a produção de células adultas especializadas, incluindo epitélio pigmentar da retina (RPE) 6-11. Para potenciais aplicações clínicas de células iPS derivadas, uma diferenciação direcionado para esse tipo específico de célula é essencial. Existem vários métodospublicado pela diferenciação dirigida de ambas as células iPS CES e em RPE que varia muito em sua eficiência 6-7, 12-16. Nós ainda não sabemos muitos dos eventos moleculares que governam o destino de células / tecidos durante o desenvolvimento ou diferenciação. Nos últimos anos, foram feitos esforços para desenvolver o protocolo de diferenciação que pode imitar o desenvolvimento embrionário, tanto quanto possível. Durante a fase de blastocisto, a população não confirmadas de células-tronco estão juntos em um microambiente tridimensional. Assim, várias estratégias foram aplicados para tornar as células CES / iPS reunidos e crescê-las em três dimensões. Estes agregados de células-tronco são chamados de corpos embrióides (EBS). Estudos têm mostrado que a EB diferenciação de células estaminais imitar fase precoce do desenvolvimento do embrião e pode dar origem espontaneamente a endoderme primitiva na sua superfície exterior. Mais tarde, como EB desenvolvimento progride, os fenótipos de células diferenciadas de todas as três linhagens germinais aparecer 17-18. Therefore, o EBS protocolos de diferenciação com base têm atraído muita atenção para a diferenciação in vitro de células ESC / IPS e é um bom candidato para a geração EPR ​​a partir de células-tronco pluripotentes 13. EB pode ser feita usando vários métodos de células ESC / IPS. Inicialmente, foram feitas EBs raspando as colónias aderentes e mantê-las em cultura em suspensão não-aderente. No entanto, esta abordagem produz população heterogénea de EBs que provoca baixa reprodutibilidade. Suspensão de cultura de células de queda e micropoco formação EBs baseado outras técnicas populares para formação EBs que produzem EBs homogêneos de tamanhos definidos que são altamente reprodutível. Além disso, a técnica de micropoços podem produzir grande número de agregados com menos esforço. Diferenciação de células dentro EBS é regulada por um multiplex de pistas morfogénicos do microambiente extracelular e intracelular. Em contraste com a diferenciação em um monformato olayer, o EBS fornecer uma plataforma para montagem complexa de células e sinalização intercelular para ocorrer 17. Curiosamente, foi observado o número de células estaminais pluripotentes usados ​​para fazer EBs individuais para influenciar o destino das células. Por exemplo, em um estudo diferenciação hematopoiética da CES humanos, observou-se que 500 células EB promoveu a diferenciação no sentido de linhagem mielóide enquanto que 1.000 células EB empurrado na direcção da linhagem eritróide 20. Em outro estudo, a EBS menores favoreceu diferenciação endoderme Considerando EB maiores promovidas no sentido de neuro-ectoderma diferenciação 11, 17. Estes estudos anteriores sugerem fortemente que o número de células ESC / IPS usados ​​para fazer EBs individuais afetam as EBs diferenciação com base para quaisquer tipos de células. No entanto, a nosso conhecimento, não há estudos atuais que elucidaram o impacto do tamanho EBs em sua propensão de se diferenciar em direção RPE. O objetivo deste estudo é caracterizar a influência deTamanho EB em induzida células-tronco pluripotentes (IPS) - epitélio pigmentar da retina (iPS-RPE) diferenciação e para identificar o número célula ideal para fazer as EBs para a diferenciação dirigida para RPE linhagem.

<table><tbody><tr><td>Mídia mTeSR1 + suplemento 5x Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inibidor de Rocha)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Substituição de soro knockout</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM mídia Life</td><td>Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 suplemento</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td></td><td>Sigma H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovino soro</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium sal Sigma</td><td></td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate tamponado salina</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 placa</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Cytoperm Fixation / Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-PAX6 anticorpo</td><td>Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse&nbsp; Anticorpo anti-MITF</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Coelho Anti-ZO-1 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>RNA de alta capacidade para kit de cDNA</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

derivando retinal pigment epithelium (rpe) de pluripotentes induzidas (ips) stem cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

As células-tronco pluripotentes possuem a capacidade de proliferar indefinidamente e de se diferenciar em quase qualquer tipo de célula. Além disso, o desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) gerou interesse e entusiasmo pela possibilidade de medicina regenerativa pessoal personalizada. No entanto, a eficiência da diferenciação de células-tronco em direção a uma linhagem desejada permanece baixa. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo para derivar o epitélio pigmentar da retina (EPR) a partir de células iPS (iPS-RPE) aplicando uma abordagem de engenharia de tecidos para gerar populações homogêneas de corpos embrióides (EBs), um intermediário comum durante a diferenciação in vitro. O protocolo aplica a formação de tamanho específico de EBs usando a tecnologia de placa de micropoços. Os métodos para identificar marcadores proteicos e genéticos de EPR por imunocitoquímica e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) também são explicados. Finalmente, é descrita a eficiência da diferenciação em diferentes tamanhos de EBs monitorados por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de marcadores de RPE. Essas técnicas facilitarão a diferenciação de células iPS em RPE para aplicações futuras.

Neste experimento, as células iPS foram cultivadas e diferenciadas na linhagem RPE da EBS. EB de tamanhos controladas foram formados utilizando placas de micropoços. Como visto na Figura 1 formação EB foi homogénea nas placas de microcavidades. Estes EB foram então recolhidas e colocadas em placas de 6 poços (Figura 2). EPR podem ser identificados pela sua morfologia hexagonal clássica, pigmentação, e a expressão de marcadores EPR. Após 12 semanas de cultura...

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a influência do tamanho do corpo do embrião na diferenciação do EPR das células IPS para direcionar a diferenciação do corpo embrionário para a linhagem do EPR. Isso é feito usando primeiro a técnica de micropoços para gerar corpos embrionários homogêneos de tamanhos definidos. Na segunda etapa, a diferenciação direcionada das células IPS é iniciada em direção à linhagem retiniana e, em seguida, as células I-P-S-R-P-E são identificadas e isoladas.Na etapa final, as células I-P-S-R-P-E são enriquecidas e expandidas. Em última análise, as células I-P-S-R-P-E podem ser analisadas quanto à expressão de marcadores específicos de I-P-S-R-P-E. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a diferenciação espontânea, é que nossa técnica resulta em maior RP. Este assunto pode ajudar a otimizar a diferenciação direcionada de células IPS para a linhagem RP.As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças degenerativas da retina, como degeneração macular, retinite ou doença de Stargardt. Uma vez que a substituição de EPR doente por EPR saudável derivado de células IPS pode ser a melhor opção para prevenir a perda de visão, geralmente o indivíduo novo neste método terá dificuldades porque as células-tronco são muito delicadas e mudanças sutis em seu cabo podem afetar o processo de diferenciação. A demonstração visual deste método é crítica, pois a etapa de colheita do corpo do embrião do local de micro-ondas é difícil.Antes da semeadura, aqueça o meio de cultura de células-tronco livre de alimentador a 37 graus Celsius e, em seguida, aqueça rapidamente as células IPS IMR 90 em um banho-maria de 37 graus Celsius. Quando as células estiverem descongeladas, adicione cinco mililitros de cultura de células-tronco livres de alimentador quente, médio às células, gota a gota e misture suavemente. Em seguida, gire as células e, em seguida, ressuspenda cuidadosamente os aglomerados de células em dois mililitros de cultura de células-tronco livres de alimentador.Semeie os aglomerados em poços individuais de uma placa revestida com matriz e, em seguida, coloque as células em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade e mudanças diárias de meio. Cinco a sete dias depois, observe as colônias indiferenciadas com um centro denso que estão prontas para passar sob um microscópio óptico. Quando as células estiverem prontas, adicione um miligrama por mililitro de espaço quente de 37 graus Celsius a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por sete minutos.Em seguida, aspire o espaço DYS e enxágue suavemente as colônias celulares com dois mililitros de DM MF 12 pré-aquecido. Duas vezes. Após o enxágue, adicione dois mililitros de meio de cultura de células-tronco sem alimentador a cada poço e use uma pipeta de cinco mililitros para raspar suavemente as colônias, liberando os aglomerados de células.Em seguida, transfira os aglomerados destacados para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione meio de cultura de células-tronco livre de alimentador suficiente para semear a próxima passagem de células para gerar os corpos embrionários. Primeiro, enxágue as células IPS com dois mililitros de DMMF 12 e, em seguida, adicione 750 microlitros de Accutane a cada poço da placa de seis poços por cinco a 10 minutos. Em uma incubadora de cultura de células, quando as células começarem a se desprender, use uma pipeta para dissociar suavemente as células em uma única suspensão celular e, em seguida, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.Enxágue a placa com cinco mililitros de DM MF 12, agrupando a lavagem com as células do tubo cônico. Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 micrômetros para remover quaisquer aglomerados de células residuais. Agora gire as células para remover o Accutane e resus.Suspenda o pellet no meio de formação do corpo embrionário a uma concentração de 0,5 a um vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro. Depois de determinar o número de células viáveis por exclusão de trian blue, adicione o número apropriado de células a cada poço de uma placa de micro poço para gerar o embrião desejado. Tamanhos corporais.Pipetar suavemente as culturas para facilitar uma distribuição uniforme das células e, em seguida, ajustar o meio de formação do corpo embrionário suplementado com inibidor de rocha para um volume final de 2,0 mililitros. Após uma pipetagem mais suave, gire as culturas de células de micro poços e incube a placa em uma incubadora de cultura de células por 24 horas. No dia seguinte, pipete o meio para cima e para baixo em cada micro poço com um micropipetador de um mililitro para colher a maioria dos corpos embrionários e, em seguida, passar a suspensão do corpo embrionário por um filtro de células invertido de 40 micrômetros para remover quaisquer células individuais.Em seguida, enxágue a placa de micro poço cinco vezes com um mililitro de DMMF 12 para remover o restante dos corpos embrionários que passam as lavagens pelo filtro. Em seguida, vire o filtro de células de cabeça para baixo em uma placa de Petri e filtre os corpos embrionários coletados com mais meio de formação do corpo embrionário. Após a contagem das células coletadas, incubar os corpos embrionários em matriz proteica revestida com seis placas de poços a menos de 1000 corpos embrionários por poço em meio de formação do corpo embrionário, suplementado com inibidor de rocha 10 micromolares em uma incubadora de cultura de células por 24 horas.Finalmente, substitua o meio de formação do corpo embrionário por um meio de diferenciação para iniciar a diferenciação. Coleta de amostras nos dias 6, 17, 29 e 60 para realizar a análise apropriada a jusante. Após 12 semanas de cultivo, 200 corpos embrionários de células desenvolvem morfologia de astrócitos e fibroblastos sem pigmentação visível, enquanto os corpos embrionários maiores desenvolvem uma monocamada de morfologia e pigmentação clássicas de EPR, como demonstrado nessas imagens imunoquímica para detectar os marcadores de RPE, MITF e ZO revelam a co-expressão dessas proteínas derivadas de 500 células e 3000 corpos embrionários celulares.Neste gráfico, o marcador neuroectodérmico PAC seis foi medido em corpos embrionários de tamanhos diferentes em diferentes momentos por citometria de fluxo. Por exemplo, nos corpos embrionários de 3000 células, aproximadamente 50% das células analisadas foram positivas para PAC seis no sexto dia de cultura. Além disso, a análise por fax do marcador RPE MITF em corpos embrionários de vários tamanhos revelou que 20% das células expressaram MITF no dia 60 de diferenciação.Os RPE cultivados também são caracterizados por sua capacidade de perder seu pigmento e morfologia poligonal e obter um fenótipo de fibroblastos na embalagem. Por exemplo, aqui, são mostradas células recém-passadas que perderam seu pigmento e ganharam uma morfologia de fibroblastos. Essas células então proliferam, recuperando sua morfologia poligonal clássica após a confluência e, em poucas semanas, recuperam sua pigmentação.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de identificar e isolar adequadamente as colônias IPS RP após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de células-tronco explorarem a diferenciação direcionada para muitos tipos de células adultas, imitando o desenvolvimento embriológico normal. Não se esqueça de que trabalhar no tecido, laboratórios virtuais pode ser extremamente perigoso e que repercussões, como usar casacos de perna, luvas e óculos, devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar corpos embrionários homogêneos do tamanho desejado para direcionar o desmatamento para I-P-S-R-P-E e isolar e enriquecer as células RPE.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

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Aqui nós apresentamos um protocolo para diferenciar as células do epitélio (RPE) pigmento da retina de células-tronco pluripotentes humanas mutações paciente-derivado de rolamento. As linhas de célula mutante podem ser utilizadas para análises funcionais, incluindo immunoblotting, imunofluorescência e braçadeira do remendo. Esta abordagem da doença-em-um-prato contorna a dificuldade de obtenção de células RPE humanas nativas.

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Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.

Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aprenda a derivar epitélio pigmentar da retina (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) utilizando diferentes tamanhos de corpos embrióides. Este método otimiza a diferenciação celular para pesquisas em biologia de células-tronco.

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Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

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