Name: Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a detectar células B produtoras de IgE verdadeiras em camundongos usando tripsina, fixação e citometria de fluxo. Este método remove IgE ligada à superfície para análise intracelular precisa da troca de classe de imunoglobulinas.

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NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> 1.000 vezes anti-CD40: obter do fabricante a 1,0 mg / ml, armazenar a 4 ° C. </li><li> Meios estimulação das células B: Para 425 ml de meio RPMI-1640, adicionar 75 ml de descongelado de fresco de soro fetal de vitelo (FCS), 10 ml de tampão HEPES 1,0 M, 5 ml de caldo de L-glutamina, 5 mL de Penicilina: stock de Estreptomicina, 5 ml essenciais Médio não-essenciais Aminoácidos jul (MAM-NEAA), e 3,5 mínimo de 2-mercaptoetanol. Mantenha o material a 4 ° C por até uma semana. Adicionar IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) imediatamente antes da utilizaçãoapenas com o volume de material necessário. </li><li> 2% de FCS em FACS Buffer: Adicionam-se 10 ml de FCS e 490 mL de PBS 1x. Mantenha a 4 ° C. </li><li> 2x solução de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solução estoque de tripsina-EDTA (tripsina 5,0 g, 2,0 g de EDTA por litro) em 20 ml de PBS 1x. Loja de tripsina-EDTA em 2x alíquotas trabalhando a 4 ° C. Deixa-se aquecer até à temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Soro fetal bovino: Manter FCS descongeladas a 4 ° C por até duas semanas. Colocar em gelo 15 min antes do processo de coloração citoplasmática. </li><li> Neutro-tamponada de formalina: Prepare uma solução de formol a 10% (3,7% de paraformaldeído). Formalin é tóxico e, portanto, lidar com ele sob uma fume hood laboratório enquanto usava EPI adequado. Formalina loja à temperatura ambiente em um armário de armazenamento de produtos químicos. </li><li> Metanol: loja metanol absoluto (100%) a -20 ° C até as células estão prontas para ser permeabilizadas. Note-se que o metanol é inflamável e deve ser armazenado em freezer apropriado. </li></ol> 2.Purificação e activação de células B <ol><li> A partir de um baço recém-colhida rato, preparar uma suspensão de células individuais, pressionando suavemente o órgão através de um filtro de células 70 um com o êmbolo de uma seringa de 3 ml. Num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, recolher as células em 10 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de células vermelhas do sangue tampão de lise durante 5 min. Neutraliza-se com 13,5 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> (Opcional) magneticamente separar as células B, utilizando anti-CD45R (B220) marcado com grânulos, seguindo o protocolo de purificação MACS acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Estimular as células B purificadas a 1,0 x 10 6 células / ml em meios aquecida a estimulação das células B contendo IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) durante 5 dias a 37 ° C. Comece com 8 ml de cultura divididos em dois poços de uma placa de cultura de 6 poços (4 ml cada). </li><li> Verifique culture diária para manter a 1,0 x 10 6 células / ml. Ajustar a concentração através da divisão em outras cavidades e a diluição da cultura com meio de estimulação das células B fresco contendo IL-4 e anti-CD40. </li></ol> 3. A tripsinização, Fixação e permeabilização <ol><li> Tripsinizaï¿½o <ol><li> Recolhe-se a 1,0 x 10 7 de células de cultura num tubo de 15 ml, centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, e decanta-se o sobrenadante. </li><li> Lava-se com 10 ml de PBS para remover a proteína residual a partir do suporte de recolha de células. Repetir o passo de centrifugação e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células no volume residual após decantação (cerca de 100 uL). </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 800 ul de 0,1% temperatura ambiente (2x) de tripsina-EDTA para as células. Dispensar lentamente num ângulo de 45 ° para o lado do tubo cónico. </li><li> Fechar o tubo e misturar suavemente pela inclinação do tubo de modo que o líquido corre ao longo do comprimento do tubo de tempo 5-6s. Um precipitado pegajoso, branco pode formar-se na solução. Limite o tempo de tripsinização para menos de um min. </li><li> Extingue-se a reacção tripsinização com 1 ml de FCS a frio. Dilui-se o FCS imediatamente por adição de 10 ml de PBS frio. </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, depois decanta-se o sobrenadante e devolver os tubos em gelo. </li></ol></li><li> Fixação <ol><li> Ressuspender as células do volume residual, após decantação. Se necessário, levar o volume até 100 ml com PBS frio. </li><li> Numa hotte, adicionar 800 ul de solução de formalina tamponada neutra a 10% para as células e pipetar para cima e para baixo. O tubo vai aquecer após a adição de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilização <ol><li> Configurar um misturador de bancada vortex a uma velocidade agitação suave. </li><li> Desenhar 9 ml de frio (-20 ° C) de metanol em 10 ml de uma pipeta serológica. </li><li> Segurar o tubo contendo as células ao longo do misturador de vórtice e suavemente começar tremendog das células. </li><li> Adicionar metanol frio para o tubo assim que cai gota a gota sobre as células, enquanto o tubo está ainda agitação, de modo que o metanol é se mistura continuamente. Depois dos primeiros 2 ml de metanol a velocidade de distribuição pode ser aumentada para um caudal lento. </li><li> Deixe o tubo de sentar em gelo durante 30 min para completar a permeabilização. Alternativamente, as células podem ser armazenadas a -20 ° C durante até um mês. </li></ol></li></ol> 4. A fluorescência de coloração para IgG1 e IgE Classe Switching <ol><li> Amostra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos e decantar a solução de metanol. Um precipitado branco podem sedimentar com as células. </li><li> Adicionar 10 ml de 1x PBS temperatura ambiente e centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para lavar as células. Repetir uma vez. Nota: A lavagem do pellet com temperatura ambiente PBS dissolve precipitado extra que podem formar após o passo 4.1. </li><li> Realizar uma lavagem adicional com 10 ml de 2% FCS-tampão de FACS. </li><li> Distribuir amostras de 96 poços rodada placa de fundoe centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante e colocar a placa no gelo. </li><li> Mancha em 60 ul de tampão de 2% de FCS em FACS por poço com as seguintes diluições de anticorpos: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 de PE, 1: 600, FITC anti-IgE, 1: 100, Anti CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Após 5 min de coloração, lavar a placa com 150 ul de 2% de FCS-tampão de FACS e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Ressuspender em 400 ul de tampão de 2% de FCS em FACS e por meio de uma pipeta de 40 um coador de células de nylon para um tubo de 5 ml de FACS. </li></ol> 5. Use a Estratégia Gating seguir: <ol><li> Isolar CD45R (B220) células positivas da população de linfócitos jateamento localizado no / parcela SSC FSC (Figura 1). </li><li> A partir das células positivas B220, utilizar o lote de IgE e IgG1 para revelar as populações correspondentes. </li></ol>

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<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm divulgações.

A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE 5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos 12 ou células B do baço como purificados 11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnética positiva de célu...

Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 &#39;em cada conjunto de C H 1 s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação. IgE é um mediador chave da doença alérgica 2 e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH 3, mas pode ser muito elevado em estados de doença 4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE 5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE 7 endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE. Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos 9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.

<table><tbody><tr><td>Anti-Mouse IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rato Anti-Mouse IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Mantenha em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Rato / Rato CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Médio 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td> <td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microesferas&nbsp;</td>Coluna de purificação <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstituir em água ou solução de formalina BSA a 0,1%,</td></tr><tr><td>tamponado neutro, solução de</td> tripsina-EDTA 10% <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>(10x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g de tripsina, 2,0 g de EDTA&#8226; 4 Na por litro de 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penicilina; 10 mg/ml Estreptomicina (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200</td><td>mM Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-Rato IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Calf Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B cell Estimulação media</td><td></td><td></td><td>B cell media consiste em RPMI com soro fetal de bezerro (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamina,&nbsp; 1x Penicilina-Estreptomicina (Penicilina: 100 U/ml, Estreptomicina: 100 &micro; g/ml), Beta-mercaptoetanol (7 &micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 &micro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

detecção de true ige-expressando rato b células da linhagem

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.

Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente 11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura 1),...

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B. Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

O objetivo geral do experimento a seguir é distinguir células B que expressam IgE verdadeira de células B, expressando outros isotipos de IgE secretados por IgE. Durante os ensaios de mudança de classe in vitro, liga-se às proteínas da superfície das células B, o que obscurece a capacidade de medir a mudança de classe para IgE. O objetivo é alcançado removendo primeiro as moléculas de IgE ligadas ao receptor antes da análise pelo uso de tripsina, que não cliva especificamente as proteínas da superfície celular, deixando intactas as moléculas de imunoglobulina intracelular produzidas endogenamente.Em segundo lugar, as proteínas intracelulares são expostas fixando as células B com formina e permeando as células com metanol. Em seguida, as células são coradas com anticorpos marcados com fluorescência para revelar imunoglobulinas intracelulares. Os resultados mostram uma população distinta de células B positivas para IgE.Se a tripsina for usada com base na análise de citometria de fluxo, os estudos sobre a biologia da IgE têm sido limitados devido à dificuldade de detectar células produtoras de IgE. Este método fornece uma solução acessível que os laboratórios podem adotar facilmente p

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

Após a exposição de antígenos, subpopulações de células ativadas B passam por um processo conhecido como recombinação mudança de classe (CSR) para produzir isotipos de anticorpos com diferentes funções efetoras. O protocolo apresentado neste relatório explica como a RSE pode ser induzido e...

Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Dermatite herpetiforme (DH) é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação auto-imune entre IgA e transglutaminase epidérmica (ETG). DH se desenvolve em uma parcela muito pequena dos pacientes glúten-sensíveis e / ou doença celíaca. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em um hospedeiro macaco rhesus com sintomas da dermatite idiopática.

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

Este vídeo demonstra um método de imagem para visualizar a secreção in situ de interferon-gama (IFN-γ) no baço de camundongo. Após a infecção bacteriana e a indução do acúmulo de IFN-γ dentro das células T e células assassinas naturais, o baço é colhido do camundongo. Após a obtenção de cortes de tecido, a imunocoloração é realizada para visualizar o IFN-γ dentro das células.

Ensaio para a identificação da secreção de interferon-gama em órgãos linfóides murinos

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Aprenda a detectar células B produtoras de IgE verdadeiras em camundongos usando tripsina, fixação e citometria de fluxo. Este método remove IgE ligada à superfície para análise intracelular precisa da troca de classe de imunoglobulinas.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

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