Name: TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprenda a investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma SH-SY5Y usando sondas sensíveis ao pH e microscopia de fluorescência por reflexão interna total. Este método permite visualizar eventos de fusão vesicular com alta resolução.

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Os autores gostariam de agradecer a Università degli Studi di Milano para apoio a Eliana Di Cairano (bolsa de pós-doutoramento) e Stefania Moretti (Ph.D. comunhão). Este trabalho foi apoiado pela Research University Programa PUR a CP Gostaríamos de agradecer ao Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Reino Unido, para o pHluorin construir e Dr. Francesco Dotti para assistência na análise de dados, e Silvia Marsicano para assistência técnica.

1. Cultura de Células e Transfection <ol><li> Cultura de células SH-SY5Y NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando o neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. As células SH-SY5Y crescem como uma mistura de agregados flutuantes e as células aderentes. Siga as instruções relatadas no protocolo (densidade celular, a relação de divisão, etc.) Para ter células que crescem firmemente ligados a tampa de vidro, que é crucial para TIRFM. <ol><li> Antes de começar, sob a cabine de segurança biológica de fluxo laminar, perfazer o volume de solução de fosfato oportuno estéril salina de tampão (PBS) e meio de cultura. <ol><li> Adicione 50 ml de PBS com concentrações de 150 mM de NaCl, 24 mM de tampão fosfato, pH 7,4. Filtrar a solução. </li><li> Adicione 50 ml de meio de células a partir de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 10% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml), L-glutamina ( 2 mM), epiruvato de sódio (1 mM). Filtrar a solução. </li></ol></li><li> Remover o meio de crescimento completo e lava-se as células com 3 ml de PBS. </li><li> Incubar as células com 2 ml de 0,05% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (por placa de Petri de 6 centímetros) por 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e separar as células utilizando uma pipeta. </li><li> Inactivar a tripsina por adição de 2 ml de DMEM, e recolher as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de DMEM para a pastilha e a solução pipetar para cima e para baixo o suficiente para dispersar as células numa suspensão de células única. </li><li> Dividi-los 1: 4 em um novo diâmetro de prato 6 centímetros de Petri contendo 3 ml de meio completo. Manter as células em cultura em placas de Petri de diâmetro 6 cm, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Sub-cultura, uma vez por semana ou quando eles cobriram 80 - 90% da área da superfície. </li></ol></li><li> Chapeamento de células SH-SY5Y para geração de imagens <ol><li> Para experiências TIRFM, placacélulas nas tampas de vidro. Empregar tampas de vidro com 0,17 ± 0,005 milímetros de espessura e um índice de refração 1,5255 ± 0,00015. Antes de começar, prepare as lamelas de vidro como segue: <ol><li> Limpe o vidro cobre com 90% de etanol, O / N. </li><li> Lave-os bem em água destilada (três mudanças de água destilada). Vidro cobre a seco num forno de secagem. </li><li> Local cobre em placas de Petri e esterilizar em um forno pré-aquecido a 200 ° C durante 3 h. </li></ol></li><li> O dia antes da transfecção, colocar cada lamela numa caixa de Petri de 3,5 cm adicionar 1 ml de meio de cultura e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> Tripsinizar as células como descrito nos passos 1.1.3 - 1.1.5, suspender o sedimento de células em 1 ml de meio completo e contar. Calcula-se o volume correcto de suspensão de células a adicionar para cada placa de Petri para proporcionar 3 x 10 5 células / poço. Esta densidade é necessária para o crescimento celular óptimo e transfecção eficiente. Incubar a 37 ° C5% em uma incubadora de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection por polietilenimina (PEI) NOTA: Para visualizar vesículas sinápticas dinâmica, vetor pCB6 contendo synapto-pHluorin foi usado. O synapto-pHluorin foi gerada por fusão em quadro de uma variante da proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína 16 de membrana vesicular sinaptobrevina 2. A construção tem sido extensivamente utilizada para investigar as propriedades dentro das vesículas sinápticas 9 neurónios sensíveis ao pH. <ol><li> Antes de iniciar a transfecção, fazer 10 ml das seguintes soluções. Mantenha as soluções máxima de 1 mês. <ol><li> Adicione uma solução de 150 mM de NaCl. Ajustar a pH 5,5 com 0,01 N de HCl. </li><li> Adicione uma solução de PEI a 10% de polietilenimina (PEI; linear de 25 kDa) em solução de NaCl 150 mM. O pH da solução sobe para 8,8. Ajustar o pH para 7,8 com 0,01 N de HCl. </li></ol></li><li> 24 h após o plaqueamento, o meio de remover e actualizar com 1,5 ml demeio completo. Manter as células a 37 ° C, numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> De acordo com a cabine de segurança biológica de fluxo laminar, num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 3 ug de ADN plasmídeo de 25 ul de solução de NaCl 150 mM e 100 ul de uma solução de PEI 3,5 centímetros por placa de Petri. </li><li> Vortex durante 10 segundos, depois incubar a mistura de ADN / PEI durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione cuidadosamente a mistura de ADN / PEI para a placa de Petri contendo lamelas com células e agitar suavemente para distribuir igualmente o reagente na placa de Petri. </li><li> Após 4 h alterar a forma e incubar as células S / N a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Realizar experimentos com imagens 24-48 horas após a transfecção. </li></ol></li></ol> Imagem 2. celular por reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) <ol><li> Imagem set-up <ol><li> Realizar imagem TIRF com o set-up descrito na Figura 1. É composto por uma motorizada invertidamicroscópio (Figura 1, inserir A), a fonte de laser (Figura 1, inserir B) e o TIRF-deslizante (Figura 1, inserir C). Alcance iluminação TIRFM através de uma alta abertura numérica (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) óleo 100X, objetiva de imersão. </li><li> Para iluminação TIRFM, empregar um multi-line (458/488/514 nm) 100 mW laser de argônio-ion. Usando um modo de fibra mono, introduzir a luz do laser polarizada linearmente para o caminho do feixe, através do controle deslizante TIRF. Insira o controle deslizante TIRF para o plano diafragma de campo luminoso do caminho do feixe de luz refletida. <ol><li> Para iluminação de campo grande, ligue o microscópio para uma lâmpada de mercúrio de curto-arco convencional HBO luz branca. Um duplo prisma-mantendo polarização no controle deslizante garante a combinação simultânea de iluminação TIRF e luz branca. </li></ol></li><li> Filtra-se a luz laser com um filtro de excitação (largura de banda 488/10 nm) montado sobre uma roda de filtro, introduzido no caminho do laser. Empregaruma alta velocidade, do obturador, controlado por software para permitir o controlo rápido da iluminação do laser. Para a análise pHluorin, montar uma banda passar 525/50 nm filtro de emissão. Capturar imagens digitais (512 x 512 pixels) em uma câmera CCD refrigeração rápida com o software ProPlus Imagem. </li></ol></li><li> Atingir iluminação TIRF (Figura 2) <ol><li> Ligue os lasers, o computador, a câmera, a roda de filtros, e os controladores do obturador; em seguida, aguarde 20 minutos antes do início do experimento, como os lasers precisa para se aquecer e estabilizar. </li><li> Antes de imagem, faça o volume oportuno das seguintes soluções. <ol><li> Adicione 50 ml de solução de Krebs (KRH) em NaCl 125 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1,2 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM de CaCl 2, e 6 mM de glucose. </li><li> Adicione 10 ml de solução de KCl-KRH (pH 7,4) com NaCl 80 mM, KCl 50 mM, MgSO4 1,2 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, HEPES 25 mM (tamponado a pH 7,4), 2 mM de CaCl 2, e 6 mM de glucose. </li></ol></li><li> Remova a tampa de vidro com células transfectadas e inseri-lo na câmara de imagem adequada. Montar a câmara e adicionar 500 ul de solução de KRH no centro do copo. </li><li> Adicione o óleo sobre o objetivo. Coloque a câmara de imagem na fase do microscópio e posicionar o objectivo sob a lamela de vidro. Posicione a tampa segura sobre a amostra. </li><li> No modo de epifluorescência, concentrar-se na lamela (superfície superior) e escolha células transfectadas colocados no centro da câmara. Selecione as células cujo sinal fluorescente pode ser claramente gravada usando um tempo de exposição abaixo de 80 ms. </li><li> Sob o controle do software, mude para iluminação TIRF no modo ao vivo. </li><li> Para definir a configuração TIRF, verifique a posição da viga que emerge da objetiva, na capa da amostra (Figura 2B). Quando o feixe é posicionado no centro de tele lente objectiva (Figura 2A, esquerda), uma mancha é visível no centro da tampa TIRF amostra (Figura 2B, à esquerda) e a célula é criada uma imagem em modo de epifluorescência (vários planos focais, alta fluorescência de fundo; Figura 2C, esquerda) . </li><li> Para atingir o ângulo crítico, mover o ponto focado na direcção Y (para a frente ou para trás; Figura 2B, ao centro) com o parafuso de ajustamento de ângulo sobre o cursor TIRF (Figura 1C). Quando o feixe converge sobre o plano da amostra com um ângulo maior que o ângulo crítico (Figura 2A, à direita), o local desaparece e uma fina linha recta, é evidente centrada no meio da tampa da amostra (Figura 2B, para a direita). </li><li> Para ajustar o ângulo TIRF usar a amostra de células (Figura 2C). Assista a imagem de fluorescência no vídeo, nesta fase, uma imagem de epifluorescência-like é ainda visível. Delicadamente, mova o parafuso até TIRF concondição é alcançada: apenas um plano óptico da célula está em foco (ou seja, a membrana de plasma em contacto com a tampa-derrapante), isto resulta em uma imagem plana com alto contraste (Figura 2C, à direita). </li></ol></li><li> Imaging Amostra <ol><li> Defina o canal único experimento time-lapse. Para minimizar a fotodegradação, capturar a imagem usando baixo tempo de exposição e de alto ganho. Tempos de exposição apropriados são entre 40 - 80 ms. Adquirir imagens em 1 - frequência de amostragem de 2 Hz. Cinética de vesículas podem ser amostragem melhor apreciado com maior freqüência (10 Hz). O tempo normal de observação é geralmente 2 min. </li><li> Adicionar 500 ul de células de solução e ficha KRH no modo TIRFM. Esta é a condição de repouso. Salve as imagens seqüenciais de tempo. </li><li> Concentre-se na mesma célula e registro sob as mesmas condições de descanso (potência laser, tempo de exposição, número de quadro). Depois de cinco frames, adicionar 500 ml de solução de KCl-KRH e manter KCl na câmara.Esta é a condição estimulada; guardar as imagens seqüenciais de tempo. </li></ol></li></ol> Análise 3. Imagem e Processamento de Dados NOTA: Para analisar imagens, macros têm sido desenvolvidos no laboratório, com base em funções existentes de software de análise de imagem; macros similares estão disponíveis on-line (URL fornecida na Tabela de Materiais e Equipamentos). <ol><li> A intensidade de fluorescência quantificação <ol><li> Usar uma macro &quot;Sequência intensidade de fluorescência&quot; para a quantificação da intensidade de fluorescência numa região de interesse (ROI) da imagem, ao longo do filme. </li><li> Abra as imagens em tempo-seqüencial. Vá para o menu macro e selecione &#39;Sequence intensidade de fluorescência&#39;. Na janela de &quot;análise&quot; aparece &quot;, selecione o ROI&quot;. </li><li> Escolha uma das ferramentas de seleção no menu para criar o ROI. Colocar 3 ROIs nas regiões da membrana celular, sem manchas (ROI fundo). Empregar this &quot;ROI fundo&quot; para avaliar a fotodegradação e para definir o limiar para a análise de eventos de fusão (Figura 3A). </li></ol></li><li> Fotodegradação correção e determinação do limiar (Figura 3B) <ol><li> Para avaliar a fotodegradação, abrir as linhas de fluorescência de intensidade &quot;ROI de fundo&quot;, (Figura 3ba). Normalizar os valores da intensidade de fluorescência em cada quadro para o valor de intensidade inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). Calcular a média dos valores. </li><li> Realce os dados médios e criar um gráfico de linha usando as opções do menu gráfico. </li><li> A partir do menu de análise de dados, selecione &quot;linha de tendência&quot; para abrir a caixa de diálogo análise trama. Selecione o tipo de regressão. Defina regressão &quot;exponencial&quot;. Em seguida, selecione &quot;equação de exibição no chart&quot;. Na janela de gráfico, a equação exponencial aparece e os valores dos parâmetros são atribuídos automaticamente, (Figura 3BC </strong&gt;). </li><li> Aplicar a correcção exponencial para os valores de intensidade de cada quadro a seguir: Fn (corrigida) = Fn / exp (-n * a) Fn = intensidade de fluorescência experimental medido no quadro n; n = número de quadros; a = factor de branqueamento (constante que expressa a taxa de perda de intensidade devido à fotodegradação; &#160; Figura 3BD). </li><li> Para definir o limite, abrir um &quot;ROI background&quot; normalizada e corrigidos, calcular o sinal de fluorescência média e seu desvio padrão (SD). O valor médio mais 3 SD representa o limiar (Figura 3BE). Utilize este limiar para a análise de dados. </li></ol></li><li> Selecção de casos de fusão utilizando um procedimento semi-automático <ol><li> Abra as imagens em tempo-seqüencial com software de análise de imagem. Aplicar um filtro Gaussian para a seqüência de imagens ativa. </li><li> Analisar as imagens usando a função &quot;contar objetos&quot; ou uma macro que permite a seleçãode um objeto cuja pixels têm intensidade média de fluorescência dentro de um intervalo definido. Definir a intensidade intervalo manualmente, usando a função de limiar (vá para o menu bar, definir um limiar medida → para destacar a área de interesse). Um limiar adequado é de 30% em relação ao sinal de fundo fluorescente local. </li><li> Aplique uma macro &quot;Filtros de objetos&quot; para selecionar apenas os objetos que satisfaçam os seguintes critérios: <ol><li> Aplicar opção faixas (min e max inclusive) para o aspecto. Aspecto relata a relação entre o eixo maior e o eixo menor da elipse equivalente ao objecto. Aspect é sempre ≥1. Valores adequados são min = 1, max = 3. </li><li> Aplicar gamas de diâmetro. Diâmetro relata o comprimento médio dos diâmetros medidos com intervalos de dois graus unir dois pontos de contorno e que passa através do centro de gravidade do objecto. Defina o intervalo em pixels (ou em um, se estiver usando um sistema calibrado). </li><li> Defina o intervalo ideal em preliminexperimentos ary: selecionar manualmente os pontos de interesse e, em seguida medir o seu diâmetro usando a função de perfil trama. </li></ol></li><li> Selecione &quot;objetos de exibição&quot;: objetos selecionados vão aparecer sobreposto à imagem TIRFM (Figura 4B). </li><li> Inclua na análise apenas aqueles pontos que mostram uma curta (um a três quadros) aumento transitório na intensidade de fluorescência, imediatamente seguido por uma acentuada perda de sinal (manchas transientes). Empregar a seleção circular para criar um ROI diâmetro de aproximadamente um local radialmente em torno da vesícula / pontos selecionados (ROIs experimental). Execute esta etapa manualmente. </li><li> Com os ROIs seleccionado, calcular a intensidade de fluorescência média de cada ROI ao longo do filme. </li></ol></li><li> A análise dos dados (Figura 3C-D) <ol><li> Exportar o curso a tempo das mudanças de fluorescência medidos em cada &quot;ROI experimental&quot; para uma folha de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar o valor de intensidade em cada quadro com a intensidade de fluorescência inicial (F / F0), (Figura 3Db). </li><li> Aplicar a correcção exponencial para os valores de intensidade de cada quadro como relatado no passo 3.2.4 (Figura 3Dc). </li><li> Para calcular o número total de eventos de fusão (número máximo), o tempo de cada fusão ocorre (largura de pico) e a amplitude do pico fluorescente (altura do pico e AUC) aplicar funções lógicas usando pacotes de planilhas ou de matemática. Um exemplo de análise de eventos de fusão usando fórmulas lógicas é relatado na Figura 3DD e 3DE. </li><li> Assuma que o aumento da intensidade de fluorescência que excede o limiar (intensidade média de fluorescência de fundo de 3 DP ±) como a fusão das vesículas com a membrana plasmática e o pico resultante como um evento de fusão. </li><li> Calcule a largura do pico como diferença entre o último eo primeiro valor x de cada pico. Multiplique este valor para 1 / (frequência de amostragem). Considere isso um valoré o momento de fusão das vesículas e adesão na membrana plasmática antes vesícula re-acidificação e reciclagem (Figura 3DD). </li><li> Calcule o AUC de células inteiras como uma soma de valores ao longo do limite. Considere esse valor como variação líquida fluorescente durante o tempo de gravação devido ao espontânea (repouso) ou evocado (estimulada) atividade sináptica. </li><li> Calcula-se a altura do pico como a diferença entre o valor de y máxima de cada pico e o limiar. Considere esse valor como indicativo do tipo de fusão (fusão única vs. simultânea / sequencial ou transitória vs. fusão completa). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este trabalho apresenta um protocolo para a imagem e analisar vesículas dinâmica em células secretoras, usando vetores codificados em cDNA fluorescentes e TIRFM. Os principais elementos de uma imagem com qualidade por TIRFM são a seleção do modelo de celular e transfecção de células com indicadores ópticos geneticamente codificados de liberação da vesícula e reciclagem. TIRFM é idealmente adequado para as células em crescimento aderente a uma cobertura de vidro planas e suficientemente estáv...

A transmissão sináptica química entre neurónios é um dos principais mecanismos de comunicação no sistema nervoso. Baseia-se na liberação de neurotransmissores através de um ciclo dinâmico de fusão das vesículas e recuperação no local da pré-sináptico. Muitas das proteínas envolvidas na dinâmica das vesículas foram identificados; no entanto, sua contribuição específica para o fenômeno ainda precisa ser esclarecido 1. A nossa compreensão é parcialmente limitada pelo facto de que os ensaios mais amplamente utilizados para a exo / endocitose nem sempre são as mais adequadas. Vários estudos relacionados com a fusão das vesículas e dinâmicas dependem de técnicas eletrofisiológicas. Esta técnica fornece uma melhor resolução temporal e é excelente para investigar a fusão inicial de vesículas para a membrana do plasma, mas é incapaz de detectar muitos dos eventos moleculares subjacentes que suportem a função de pré-sináptico. A microscopia electrónica, por outro lado, proporciona os melhores morphological descrição de cada passo singular, mas o aspecto dinâmico do acontecimento não pode ser capturado, como as amostras devem ser fixados a fim de ser analisado. O advento de novas técnicas de gravação óptica 2,3, em combinação com os avanços na fluorescente sondas moleculares desenvolvimento 4-6, permite a visualização de processos exocíticas em células vivas, proporcionando novos níveis de informações sobre a estrutura e função sináptica. Estudos iniciais exploradas corantes dependentes de atividade estirilo (FM1-43 e corantes orgânicos relacionados) 7,8. State-of-the-art técnicas de imagem empregar variantes da proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) amarrado a vesículas proteínas luminais 9 sensíveis ao pH. Estas sondas são normalmente desligado quando presente nas vesículas devido ao baixo pH luminal. Após a fusão com a membrana plasmática, o interior das vesículas está exposta ao espaço extracelular neutro, o pH<html> abruptamente aumenta, alivia a extinção dependente de protões de pHluorin e o sinal fluorescente rapidamente aparece. Como a mudança de pHluorin é mais rápido do que o evento de fusão, através da monitorização da fluorescência aumenta, a fusão das vesículas com a membrana podem ser medidos e analisados. Como as moléculas da superfície marcadas com pHluorin sofrem endocitose, o sinal de fluorescência, subsequentemente, regressa ao nível basal, por conseguinte, a mesma construção pode também ser utilizada para monitorar vesícula reciclagem 9. Enquanto o sensor de pH com etiquetas de vesículas assegura a visualização de somente aquelas vesículas que realmente fundem com a membrana plasmática, a imagem em alta resolução espacial e temporal, é necessário para descrever detalhadamente os passos envolvidos nos processos de endocitose exo /. A técnica óptica que proporciona a resolução espacial e temporal, é necessário microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), um pedido de microscopia de fluorescência 10. &quot;&gt; A reflexão interna total ocorre na interface entre a lamela de vidro e a amostra. Quando o percurso da luz atinge a lamela de vidro com um ângulo de incidência maior do que o ângulo crítico, a luz de excitação não é transmitido para a amostra, mas é completamente reflectido de volta. Nestas condições, forma-se uma na interface onda evanescente de luz e se propaga no meio com menor densidade óptica (a amostra). À medida que a intensidade do campo evanescente decai exponencialmente com a distância a partir da interface (com uma profundidade de penetração cerca de 100 nm) apenas os fluoróforos mais próximo em proximidade com a tampa-derrapante pode ser animado, enquanto os mais longe do limite não são. Em células transfectadas com construções de GFP, esta profundidade corresponde a proteínas expressas na membrana plasmática ou em estruturas vesiculares aproximando-se. Tal como fluoróforos no interior da célula não pode ser excitado, a fluorescência de fundo é minimizado, e uma imagem com um sinal muito alta / rato fundoio é formada 11. Várias características tornam TIRFM a técnica de escolha para o monitoramento vesículas dinâmica. O perfeito contraste e o sinal-para-ruído elevado rácio de permitir a detecção de sinais de muito baixo a partir das vesículas resultantes individuais. Aquisição de imagem baseada em chip em cada quadro fornece a resolução temporal necessário para detectar processos altamente dinâmicos. Por fim, a exposição mínima de células à luz a qualquer outro avião na amostra reduz fortemente fototoxicidade e permite a gravação de longo lapso de tempo com duração de 12. A análise dos dados continua a ser o aspecto mais desafiador e crucial desta técnica. A maneira mais simples para controlar a fusão das vesículas é medir a acumulação de proteínas repórter fluorescente à superfície da célula, ao longo do tempo 13. À medida que aumenta de fusão, líquidos aumenta de sinal de fluorescência bem. No entanto, este método pode subestimar o processo, particularmente em células grandes e em condições de repouso,porque os processos de endocitose e fotodegradação compensar o aumento na intensidade de fluorescência devido à vesícula exocitose. Um método alternativo é seguir cada evento único fusão 14. Este último método é muito sensível e pode revelar detalhes importantes sobre os mecanismos de fusão. No entanto, ele requer a seleção manual de eventos únicos, porque os procedimentos completamente automatizados para seguir vesículas e registrar a flutuação de seus sinais fluorescentes nem sempre estão disponíveis. Observação da dinâmica das vesículas requer células de amostragem em alta freqüência. Isto gera uma grande quantidade de dados que não podem ser analisados ​​manualmente. A proposta deste artigo é o de otimizar a técnica de imagem TIRFM para monitorar o basal e liberação de neurotransmissores estimulada na linha de células de neuroblastoma SH-5YSY, e descrever, passo-a-passo, um procedimento desenvolvido no laboratório de análise de dados, tanto em níveis de célula inteira e única de vesículas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>microscópio invertido</td></tr><tr><td>Laser de Argônio Multilinhas Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lasos</a></td><td>00000-1312-752</td><td>multilinha (458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;laser de íon-argônio de mW</td></tr><tr><td>Lâmina para TIRF a laser</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 100X</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>Óleo, NA 1,45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>Câmera CCD RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 10-3, trocador de filtros ópticos com SmartShutter</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Software Image ProPlus 6.3</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td></td><td>seleção de pontos, seleção de região de interesse, determinação da intensidade de fluorescência</td></tr><tr><td>Excel</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>correção de fotobranqueamento, análises de célula inteira e de vesícula única</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>análise estatística</td></tr></tbody></table>

tirfm e gfp-sondas sensíveis ao ph para avaliar neurotransmitter vesicle dynamics em sh-sy5y neuroblastoma cells: imagens de células e análise de dados

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Vesículas sinápticas liberar neurotransmissores nas sinapses químicas através de um ciclo dinâmico de fusão e recuperação. Monitorando a atividade sináptica em tempo real e dissecando as diferentes etapas da exo-endocitose no nível single-vesícula são cruciais para entender as funções sinápticas na saúde e na doença. Geneticamente codificado sondas sensíveis ao pH diretamente direcionados para vesículas sinápticas e Total Internal Reflection microscopia de fluorescência (TIRFM) fornecem resolução espaço-temporal necessário para acompanhar a dinâmica das vesículas. O campo evanescente gerado pela reflexão interna total só pode excitar fluorophores colocados em uma camada fina (&lt;150 nm) acima da tampa de vidro no qual as células aderir, exatamente onde os processos de exo-endocitose ter lugar. As imagens de alto contraste resultantes são ideais para vesículas rastreamento e análise quantitativa de eventos de fusão. Neste protocolo, SH-SY5Y n humanoeuroblastoma células são propostos como um modelo válido para estudar a libertação de neurotransmissores no nível único de vesículas por TIRFM, devido à sua superfície plana e a presença de vesículas dispersas. Os métodos para o crescimento SH-SY5Y como células aderentes e para transfectar-los com synapto-pHluorin são fornecidos, bem como a técnica para executar TIRFM e imagiologia. Finalmente, uma estratégia com o objetivo de selecionar, contar e analisar eventos de fusão a nível de célula inteira e única de vesículas é apresentado. Para validar a abordagem de análise de procedimento de imagem e dados, a dinâmica das vesículas pHluorin-marcados são analisados ​​sob repouso e estimulada (despolarização concentrações de potássio) condições. Despolarização da membrana aumenta a freqüência de eventos de fusão e provoca um aumento paralelo do sinal de fluorescência líquida registrada em células inteiras. Análise Single-vesícula revela modificações de comportamento fusion-evento (altura aumentou pico e largura). Estes dados sugerem tha despolarização de potássio não só induz uma liberação maciça neurotransmissor, mas também modifica o mecanismo de fusão das vesículas e reciclagem. Com a sonda fluorescente adequada, esta técnica pode ser utilizada em diferentes sistemas celulares para dissecar os mecanismos de secreção constitutiva e estimulada.

Os procedimentos de imagem TIRF e análise de dados descritos foram concebidos para estudar vesículas dinâmica em sistemas celulares. Esta técnica pode ser usada para determinar os efeitos das moléculas de sinalização e as drogas em eventos de fusão e dinâmica das vesículas de neurotransmissores 17. Usando as proteínas da membrana de plasma marcadas com GFP, a análise TIRFM foi empregue para caracterizar o tráfico constitutiva de transportadores de glutamato GFP em células gliais e células epiteliais 18,1...

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma usando sondas sensíveis ao pH e microscopia de fluorescência de reflexão interna total ou terra de grama. Isso é feito primeiro colocando células em lamínulas de vidro e seccionando-as com sondas fluorescentes sensíveis ao pH geneticamente codificadas de fusão e reciclagem de vesículas, que são direcionadas seletivamente para vesículas sinápticas. A expressão da proteína é esperada dentro de 24 a 48 horas.O segundo passo é registrar a dinâmica das vesículas por microscopia de reflexão interna total. Esta etapa é particularmente crítica para o sucesso do experimento e uma descrição passo a passo sobre como obter a configuração do gramado é fornecida. Próximo. Uma vez que a configuração correta do gramado é alcançada, as imagens sequenciais podem ser gravadas automaticamente pelo software em condições basais ou estimuladas.A etapa final é processar imagens e extrair dados dos vídeos usando software comercial ou algoritmos caseiros. Em última análise, usando microscopia de turfa para registrar as mudanças no sinal fluorescente decorrente da fusão da vesícula para a membrana plasmática. É possível obter informações sobre a frequência dos eventos de fusão e o modo de fusão das vesículas.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como por exemplo, eletromicroscopia e eletrofisiologia, é que ela fornece uma solução especial e temporária necessária para detectar a dinâmica da vesícula. De fato, imagens altamente contrastadas obtidas por esta técnica permitem detectar sinais de vesículas únicas. A análise de aquisição de imagem de base barata fornece a solução temporária necessária para detectar a dinâmica.Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da ciência nervosa, como entender o papel de uma proteína sináptica específica na dinâmica da bicicleta ou o mecanismo de ação de drogas que atuam nas transmissões sinápticas. Geralmente, indivíduos novos neste assunto, lutamos com essa análise porque procedimentos completamente automáticos para seguir a vesícula e registrar a flutuação do sinal PROEs nem sempre estão disponíveis. Primeiro, a ideia deste método quando decidimos investigar o impacto da proteína mutante patogênica ou sináptica na liberação da vesícula transmissora Nevo.Os métodos existentes não eram suficientemente abrangentes, então decidimos configurar essa técnica na linha celular de neuroblastoma SH SY five one para chegar à solução adequada. A demonstração visual desse método é crítica, pois algumas etapas importantes, como alcançar a configuração de nível quatro e como extrair os dados quantitativos dos vídeos, são essenciais para explicar o uso do word, embora possa ser mais compreensível e persuasivo. Se visualizado.Para realizar imagens de grama, configure um microscópio invertido motorizado, fonte de laser e o controle deslizante de grama conforme descrito no protocolo de texto. Para obter a iluminação do gramado. Remova a tampa de vidro com células transfectadas e insira-a na câmara de imagem apropriada.Monte a câmara e adicione 500 microlitros de solução de campainha Krebs no centro do vidro. Em seguida, adicione óleo sobre a objetiva. Coloque a câmara de imagem no palco do microscópio e posicione a objetiva sob a lamínula de vidro.Posicione a tampa segura sobre a amostra no modo de epifluorescência. Concentre-se na lamínula e escolha as células transfectadas colocadas no centro da câmara sob controle de software. Mude para a iluminação do relvado no modo ao vivo.Para definir a configuração do gramado, verifique a posição da viga que emerge da objetiva na cobertura da amostra. Quando o feixe é posicionado no centro da lente objetiva, um ponto é visível no centro da cobertura da amostra de grama e a célula é visualizada no modo de epifluorescência. Para alcançar o ângulo crítico, mova o ponto focado na direção Y usando o parafuso de ajuste de ângulo no controle deslizante de grama.Quando o feixe converge no plano da amostra em um ângulo maior que o ângulo crítico, o ponto desaparece e uma linha reta e fina focada é evidente no meio da tampa da amostra. Para ajustar o ângulo do gramado, use uma amostra de célula. Assista à imagem de fluorescência no vídeo.Nesta fase, uma imagem semelhante a uma epifluorescência ainda é visível. Mova suavemente o parafuso até que a condição do gramado seja alcançada. Aqui, apenas um plano óptico da célula está em foco, resultando em uma imagem plana com alto contraste.Para realizar imagens de amostra, defina o experimento de lapso de tempo de canal único com tempos de exposição apropriados entre 40 e 80 milissegundos. Adquira imagens em uma ou duas frequências de amostragem de hertz. Adicione 500 microlitros de solução de campainha Krebs e registre as células no modo de microscopia de grama.Economize tempo imagens sequenciais da condição de repouso. Concentre-se na mesma célula e registre nas mesmas condições de repouso. Após cinco quadros, adicione cinco microlitros de solução de Krebs ringer de cloreto de potássio e mantenha o cloreto de potássio na câmara.Economize tempo. Imagens sequenciais da condição estimulada. Use uma macro de intensidade de fluorescência de sequência para intensidade de fluorescência, quantificação em uma região de interesse ou ROI da imagem ao longo do filme.Para fazer isso, primeiro abra as imagens sequenciais de tempo. Vá para o menu macro e selecione a intensidade de fluorescência da sequência. Na janela de análise, navegue.Para selecionar o ROI, selecionar uma das ferramentas de seleção no menu. Para criar o ROI, coloque três ROIs em regiões da membrana celular sem manchas. Para o RO de fundo, emprego esse ROI de fundo para avaliar o branqueamento de fotos e definir o limite para a análise de eventos de fusão.Com os ROIs selecionados, clique em OK. Calcule automaticamente a intensidade média de fluorescência de cada ROI ao longo do filme, exporte os dados para um programa de planilha para análise posterior. Para avaliar o fotobranqueamento abra a intensidade de fluorescência rosa.As ROIs de fundo normalizam os valores de intensidade de fluorescência em cada quadro para o valor de intensidade inicial e calculam a média dos valores. Realce os dados médios e crie um gráfico de linhas usando as opções do menu do gráfico. No menu de análise de dados, selecione linha de tendência para abrir a caixa de diálogo de análise de plotagem.Defina o tipo de regressão como regressão exponencial. Em seguida, selecione a equação de exibição no gráfico. Na janela do gráfico, a equação exponencial aparece e os valores dos parâmetros são atribuídos automaticamente.Depois de aplicar a correção exponencial aos valores de intensidade conforme descrito no protocolo de texto, defina o limite abrindo um plano de fundo normalizado e corrigido. O ROI então calcula o sinal fluorescente médio e seu desvio padrão. O valor médio mais três unidades de desvio padrão representa o limite.Para selecionar os eventos de fusão. Primeiro, abra as imagens sequenciais de tempo com o software de análise de imagem, aplique um filtro gaussiano à sequência de imagens ativa. Analise imagens usando a ferramenta contar objetos ou uma macro, que permite a seleção de um objeto cujos pixels têm intensidade média de fluorescência dentro de um intervalo definido.Defina a faixa de intensidade manualmente usando a função de limite aplicar uma macro filtra objetos para selecionar apenas objetos que atendem a critérios específicos. Primeiro aplique a opção de intervalos para o aspecto. Aspecto relata a razão entre o eixo principal e o eixo menor da elipse equivalente ao objeto.Os valores adequados para o aspecto são no mínimo um e no máximo 2,3. Em seguida, aplique intervalos para o critério de diâmetro Em pixels de diâmetro relata o comprimento médio dos diâmetros medidos em intervalos de dois graus, unindo dois pontos contornados e passando pelo OID do objeto. Em seguida, selecione objetos de exibição.Os objetos selecionados aparecerão sobrepostos à pista de imagem de microscopia de relva na análise apenas os pontos que mostram um curto aumento transitório na intensidade da fluorescência imediatamente seguido por uma perda acentuada de sinal. Empregue manualmente a seleção circular para criar uma ROI de aproximadamente um diâmetro de ponto radialmente ao redor da vesícula selecionada. Com o ROI selecionado, calcule a intensidade média de fluorescência de cada ROI ao longo do filme.Exporte o curso de tempo das alterações de fluorescência medidas em cada ROI experimental para uma planilha e prossiga para normalizar o valor da intensidade em cada quadro para a intensidade de fluorescência inicial. Depois de aplicar a correção exponencial aos valores de intensidade em cada quadro, como antes, aplique funções lógicas usando planilhas ou pacotes matemáticos para calcular o número total de eventos de fusão, o tempo em que cada fusão ocorre e a amplitude do pico fluorescente. Suponha o aumento da intensidade de fluorescência excedendo o limiar como fusão da vesícula para a membrana plasmática e o pico resultante como um evento de fusão.Calcule a largura do pico como a diferença entre o último e o primeiro valor X de cada pico. Em seguida, multiplique esse valor por um sobre a frequência de amostragem. Considere este valor como o tempo de fusão e adesão da vesícula na membrana plasmática antes da vesícula, reacidificação e reciclagem.Em seguida, calcule toda a área da célula sob a curva como uma soma dos valores acima do limite. Considere este valor como mudança fluorescente líquida Durante o tempo de registro devido à atividade sináptica espontânea ou evocada, calcule a altura do pico como a diferença entre o valor y máximo de cada pico e o limiar e considere este valor como indicativo do tipo de fusão. Na análise de células inteiras, o número total e a frequência de eventos de fusão que ocorrem na célula são analisados em condições de repouso.As vesículas ocasionalmente se aproximam da membrana plasmática e se fundem com ela no gráfico de intensidade fluorescente. Isso se reflete em uma mudança abrupta da intensidade fluorescente acima do limiar após a aplicação do estímulo secreto. Diferentes picos de intensidade de fluorescência variável aparecem repentinamente no gráfico de perfil de intensidade de fluorescência.Observe o aumento no número de pico e na altura após a estimulação com potássio. Na análise de pico único, todos os eventos de fusão são analisados. Dois parâmetros são medidos.A largura do pico, que corresponde ao tempo de vesícula, adesão e fusão à membrana plasmática, bem como a altura do pico, que reflete o mecanismo de pico de fusão. Sob despolarização de potássio, a altura e a largura do pico aumentam, refletindo uma mudança na fusão da vesícula motora para a membrana plasmática. Ao participar deste procedimento, é importante lembrar que esta técnica pode permitir apenas a visualização do evento que ocorre na membrana plasmática ou imediatamente após este procedimento.Outro método, como uma microscopia rica, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como o destino das bicicletas internalizadas, proteínas dentro das células após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que trabalham no campo da biologia e fisiologia celular estudarem eventos dinâmicos que ocorrem na membrana pessoal, como exocitose vesical, edição de matriz celular e fluxos de íons. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter uma configuração de camada quatro, registrar a dinâmica vertical e analisar dados.

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Fonte: Lacin, E., et al. Construção de Repórteres de Engenharia Fluorescente de Neurotransmissores Baseados em Células (CNiFERs) para Detecção Óptica de Neurotransmissores In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica para obter imagens da liberação de neurotransmissores in vivo usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células (CNiFERs), células repórter especializadas pré-injetadas no córtex de camundongo. Posicionado sob um microscópio de...

Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma SH-SY5Y usando sondas sensíveis ao pH e microscopia de fluorescência por reflexão interna total. Este método permite visualizar eventos de fusão vesicular com alta resolução.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados (Vídeo) | JoVE Journal

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

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