Name: Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo padronizado de estresse com glutamato e hipóxia em retina bovina isolada para testar agentes neuroprotetores. Este método utiliza eletroretinograma para avaliar função retiniana em condições controladas.

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Este artigo é dedicado à minha amada esposa Maren e ao nosso pequeno Karl.

1. Preparação de Bovinos Olhos <ol><li> Obter bovina olhos imediatamente após o abate do animal. </li><li> Transportar os olhos protegidos em &quot;Sickel-solução&quot; uma forma especial, contendo NaCl 120 mM, KCl a 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 0,15 mM de CaCl2, 1,5 mM de NaH 2 PO 4, 13,5 mM de Na 2 HPO 4 e 5 mM de glucose no RT. </li><li> Realizar a preparação da retina em condições adaptadas escuro com uma luz vermelha ofuscante. </li><li> Retire a parte anterior do olho. Executar uma ca. incisão equatorial 4 milímetros posterior ao limbo. Posteriormente remover córnea, íris, corpo ciliar e lente em uma única peça. Mantenha as retinas em Sickel-solução. </li><li> Mecanicamente soltar os anexos vítreas para a superfície da retina e do vítreo remover da taça olho aberto. </li><li> Depois divida o olho em quatro quadrantes e perfurar rodada áreas de ca. 7 milímetros de diâmetro usando uma trefina. </li><li> Suavemente separar da retinado epitélio pigmentar e colocá-lo em um dispositivo de gravação dentro de uma caixa protegida da luz. O dispositivo de gravação é composto por uma manutenção de plástico com uma malha no meio; colocar a retina na malha e, em seguida, fixar com um anel de plástico directamente sobre os eléctrodos. NOTA: O mantenedor de plástico tem dois canais para permitir um fluxo constante do meio. </li></ol> 2. A gravação do eletrorretinograma (ERG) <ol><li> A fim de gravar o electrorretinograma, usar dois eléctrodos de prata / prata-cloreto de cada lado da retina e perfundir a retina a uma velocidade de perfusão constante de ca. 1 ml / min e temperatura constante de 37 ° C. Use a &quot;Sickel-solução&quot; saturada com oxigênio. </li><li> Antes de iniciar a medição, adaptar escuro da retina (proteger da luz durante todas as medições) e usar intervalos de estímulo de cinco min. Use um único flash xenon branco 1 Hz para a estimulação com uma intensidade definido para 6,3 mlx na superfície da retina. </li&gt; <li> Uso calibrado filtros de densidade neutra e um estímulo de luz de 10 ms controlado por um temporizador, de modo a apresentar respostas óptimas. </li><li> Para medir e processar os dados, filtrar o ERG e amplificá-lo (100 Hz filtro de alta freqüência, de 50 Hz filtro notch, 100.000 x amplificação), utilizando um RPS312RM Amplifier Grass. Tente filtrar frequências possíveis perturbadores que possam perturbar o sinal. A fim de processar os dados, use uma placa de aquisição analógico-digitais de dados em um computador desktop (PC compatível). </li><li> Após o período de adaptação ao escuro sob perfusão constante, medir a amplitude do sinal elétrico até estáveis ​​amplitudes b-ondas são gravadas. NOTA: As amplitudes são consideradas estáveis ​​se cinco medições individuais chegar a um valor médio e desviar-se menos de 10%. Um bom exemplo de medições individuais é dada na Figura 1. </li><li> Para iniciar o teste, substituir o oxigénio puro por qualquer azoto puro (número de experiências individuais, n = 5) para testar a hipóxiaou 250 um glutamato (n = 5). </li><li> Grave as respostas elétricas a cada 5 min para 45 min. </li><li> Após o período de testes, aspergir as retinas com padrão médio saturada com oxigênio por 75 min e olhar para as mudanças da amplitude da onda-b. Esta é a fase de lavagem. Medir a amplitude da onda-b da calha do uma onda para o pico da onda b. </li><li> Para investigar o efeito de hipóxia ou glutamato no potencial de fotorreceptores em condições escotópicas, suprimir a onda b pela adição de 1 mM para a solução nutriente. </li><li> Após a gravação de um potencial estável de fotorreceptores durante 30 min, realizar o procedimento como antes, expondo as retinas de 45 min para as diferentes soluções de irrigação com aspartato 1 mM. Use o mesmo período de washout (passo 2.8), como mencionado anteriormente. </li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> A fim de avaliar estatisticamente os dados, garantir uma distribuição normal para todos os dados, por exemplo, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnovteste 15. </li><li> Calcula-se a redução dos a- e b-amplitudes de onda em percentagens após a fase de exposição, em comparação com a última medição antes da exposição. Comparar a redução das amplitudes-ERG após 45 min - no final do período de exposição - a ERG medido antes da aplicação. </li><li> Comparar a onda a- e b- no final da fase de lavagem para a amplitude correspondente antes de exposição a estudar a possibilidade de recuperação. </li><li> Para a análise estatística, use o software estatístico JMP software ou software SPSS. Calcular dados ao longo como a média ± desvio padrão. Estime significado pelo teste estatístico adequado. NOTA: Estes testes podem ser diferentes dependendo do escopo experimental. Neste cenário, use t-pareado de Student. </li></ol>

<ol><li>Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+central+retinal+artery+occlusion%3A+clinical+presentation+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management.</a> Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).</li>
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<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision research. 39, 2165-2177 (1999).</li>
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<li>Dutescu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+ERG+recordings+under+visual+control+of+the+stimulated+fundus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+retinal+toxicity+of+drugs+in+animal+models+using+electrophysiological+and+morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques.</a> Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Did+myocilin+evolve+from+two+different+primordial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Did myocilin evolve from two different primordial proteins.</a> Mol Vis. 8, 271-279 (2002).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+retinal+toxicity+of+a+new+heavy+intraocular+dye%2C+using+a+model+of+perfused+and+isolated+retinal+cultures+of+bovine+and+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste estudo, um impacto significativo na amplitude da onda b após 45 minutos de hipoxia foi encontrado. Esta redução foi ainda significativo após a fase de washout. Um efeito semelhante sobre o potencial de fotorreceptores pode ser observada. Os resultados são compatíveis com outros dados publicados 16 e nos dão a oportunidade de estudar possíveis efeitos neuroprotetores após hipóxia. Depois de 45 minutos de exposição de 250 uM de glutamato, conseguim...

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas. A retina é uma rede neuronal altamente sensível que depende significativamente a oxigenação e é fortemente influenciado pelo metabolismo das suas células vizinhas. As principais patologias oculares relacionadas com a lesão das células nervosas são oclusões vasculares retinianas, glaucoma e descolamento da retina. A oclusão da artéria retinal, como um exemplo para a oclusão vascular da retina, leva a uma perda súbita de visão devido a hipoxia da retina interna 1. Ela é freqüentemente associada com patologias vasculares gerais 2 e leva a uma perda visual persistente 1, com apenas 8% dos pacientes em recuperação da acuidade visual significativamente 1. Apesar de a fibrinólise arterial tem sido sugerida como uma opção de tratamento, o benefício não poderia ser mostrado em um ensaio clínico randomizado 3. Glaucoma e descolamento de retinaambos têm um aumento na concentração de glutamato 4-6. O glutamato sob condições fisiológicas é encontrado como um transmissor excitatório ao longo de todo o sistema nervoso central e retina interna a 7,8. Elevados níveis de glutamato foram encontradas não só em glaucoma e descolamento de retina 5,6, mas também na retinopatia diabética proliferativa 9. Um aumento em glutamato conduz possivelmente a excitotoxicidade e, portanto, danos das células nervosas 10. Na maioria dos casos de descolamento da retina e em alguns casos de cirurgia de retinopatia diabética proliferativa na retina (vitrectomia via pars plana) são necessários. Durante a manipulação mecânica vitrectomia, luz brilhante da fibra óptica ou tensão de cisalhamento exercida por altas taxas de fluxo de soluções de irrigação durante as operações longas exercer uma pressão adicional sobre a retina 11,12. Todas as doenças mencionadas têm em comum que a patologia está localizada ao retinuma só e representam a comunidade oftalmológica com o desafio de encontrar formas de proteger a retina como um sistema neurossensorial. O electrorretinograma (ERG) é o método padrão para a avaliação in vivo da função de fotorreceptores (uma onda) e a função da retina interna (b-ondas). O ERG é medido por eléctrodos de prata-introduzidos na córnea e os olhos estão a ser estimulado por um aumento do nível de luz para detectar defeitos em bastonetes ou cones ou na retina interna. Diferentes defeitos na retina pode ser detectada por alterações na amplitude (a força da resposta) ou a latência (o intervalo de tempo de resposta-para) do ERG. Diferentes protocolos e métodos de medição ERG (padrão-ERG, multifocal ERG-campo ou brilhante ERG) permitem uma maior diferenciação de defeitos. A técnica da retina isolado foi introduzida recentemente, tornando-se possível avaliar os efeitos sobre a retina, sem interferências de um animal, por exemplo o estudo dereações gerais 13,14. Foi o propósito deste estudo para avaliar e introduzir um modelo de estresse definido e padronizado para hipóxia e estresse glutamato na retina superfused isolado. Assim, nós estamos esperando para lançar as bases para futuros estudos sobre efeitos neuroprotetores de determinados agentes ou soluções de irrigação intra-oculares.

<table><tbody><tr><td>120 mM NaCl&nbsp;</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>2 mM KCl,&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>1.050.010.250</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mM MgCl2,&nbsp;</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>58.330.250</td><td></td></tr><tr><td>0,15 mM CaCl2</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>111 TA106282</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mM NaH2PO4/13,5 mM Na2HPO4&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>1.065.860.500</td><td></td></tr><tr><td>5 mM de glicose</td><td>Merck Pharma, Alemanha</td><td>40.741.000</td><td></td></tr></tbody></table>

glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido vertebrate retina

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas e afeta doenças como glaucoma, oclusão vascular da retina, descolamento de retina, e retinopatia diabética. Era o objeto deste estudo a introdução de um modelo de estresse padronizado para futuro teste pré-clínico terapêutico. Retina bovina foram preparadas e perfundido com uma solução saturada de oxigénio padrão, e o ERG foi gravado. Depois de gravar b-ondas estáveis, hipoxia (N 2) puro ou estresse glutamato (250 um glutamato) foi exercida por 45 min. Para investigar os efeitos sobre sozinho função de fotorreceptores, 1 mM aspartato foi adicionada para obter a-ondas. ERG-recuperação foi monitorada por 75 min. Para hipoxia, uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada (p &lt;0,01) após um tempo de exposição de 45 min (36,5% de redução após o final da lavagem p = 0,03). Além disso, um decr inicialfacilidade de amplitudes de ondas de b-87.23% foi registada, que atingiu significado estatístico (p &lt;0,01, diminuição de 25,5% no final da lavagem, p = 0,03). Para 250 um glutamato, uma redução inicial de 7,8% de um amplitudes de ondas (p&gt; 0,05), seguidas por uma redução de 1,9% (p&gt; 0,05). Uma redução de 83,7% da amplitude da onda b (p &lt;0,01) foi observado; após uma lavagem de 75 min, a redução foi de 2,3% (p = 0,62). Neste estudo, um modelo de tensão é apresentada normalizada que pode ser útil para identificar possíveis efeitos neuroprotectores no futuro.

Após 1 hora de perfusão dos preparativos da retina com solução padrão saturado de oxigênio (Figura 1A e B) ERG-amplitudes mostrou estabilização e menor variação de amplitudes entre as medidas individuais. pH, pressão osmótica, temperatura, e pO 2 (excepto para o teste de hipóxia) foram mantidas constantes em todos os testes. Para isolar o sinal a partir do sinal de fotorreceptores da retina interna, aspartato 1 mM foi adicionado para a solução padrão para suprimir a ...

Com este estudo, apresentamos um modelo de estresse padronizado para a retina bovina superfundido isolado para o futuro teste pré-clínico terapêutico. O efeito de qualquer hipóxia (puro N 2) ou estresse glutamato (250 mM glutamato) em função da retina representado por a- e amplitudes da onda-b foi avaliado.

Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

O objetivo geral do seguinte experimento é introduzir o estresse por glutamato ou hipóxia como um modelo potencial para testar a eficácia de agentes neuroprotetores. Isso é alcançado primeiramente obtendo olhos bovinos frescos com núcleos e realizando uma rápida, mas ainda assim traumática, remoção da retina. Em seguida, após fundir as retinas com uma solução nutriente especial, eletrodos são usados para registrar uma série de eletroretinogramas estáveis, ou ERGs.Em seguida, glutamato é adicionado à solução nutritiva, ou a hipóxia é induzida pela adição de nitrogênio a 100% em vez de oxigênio. Por fim, um ERG é registrado para observar o efeito do estresse por glutamato ou da hipóxia nas amplitudes das ondas A e B. Os resultados mostram uma alteração na função retiniana quando exposta à hipóxia ou ao estresse por glutamato por meio dos registros de ERG.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como culturas celulares ou gravações de ERG in vivo, é que testes funcionais podem ser realizados, diferentemente das culturas celulares, sem a variabilidade provocada pelo posicionamento do eletrodo ou pela anestesia geral, comparado a experimentos in vivo. Este mét

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Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Este protocolo modela a lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um olho de camundongo, induzindo isquemia retiniana por meio de canulação da câmara anterior e elevação da pressão intraocular, seguida de normalização da pressão intraocular para iniciar a reperfusão.

Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Aprenda a desenvolver um modelo padronizado de estresse com glutamato e hipóxia em retina bovina isolada para testar agentes neuroprotetores. Este método utiliza eletroretinograma para avaliar função retiniana em condições controladas.

Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

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