Name: Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprenda a construir uma micropipeta de vidro para microinjeção de neurotransmissores e gravação eletrofisiológica simultânea no cérebro de roedores. Este método acessível permite inativar estruturas cerebrais profundas enquanto monitora a atividade neuronal em tempo real.

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Apoiado por doações do CIHR (MOP231122) e NSERC (RGPIN-2014-06503). Gostaríamos de agradecer a Geneviève Cyr por sua ajuda na preparação de experimentos e na supervisão do trabalho de laboratório. O MAL recebeu uma bolsa de estudos do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).

Nota: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense para a Proteção dos Animais e do conselho de revisão Ética da Université de Montréal. 1. Assembleia da pipeta de gravação de injecção <ol><li> Puxar um capilar de vidro a cerca de 7 cm de comprimento (diâmetro exterior 1 mm), utilizando um puxador de pipeta. </li><li> Quebrar a ponta do capilar e verificar a abertura sob um microscópio de luz. Confirmar que o diâmetro interno é entre 30 um e 40 um. </li><li> Inserir um longo fio de prata 7 centímetros para o capilar de vidro com cerca de 1 cm protuberantes a partir da extremidade não-cónica da pipeta de vidro. </li><li> Dobre o excesso de filamentos perpendicularmente ao capilar de vidro. </li><li> Aplicar uma gota de adesivo plástico flexível sobre o eixo de uma agulha hipodérmica 30 G. </li><li> Inserir uma agulha hipodérmica 30 G na pipeta de vidro de acordo com os esquemas apresentados na Figura 1 </strong&gt;. </li><li> Adicionar uma segunda camada de cola para assegurar uma vedação adequada a partir da junção entre a pipeta de vidro e a agulha hipodérmica. </li><li> Deixar secar a pipeta com a ponta virada para cima, durante cerca de 12 h para assegurar uma cura adequada da cola. O resultado final é mostrado na Figura 2. </li></ol> NOTA: Este procedimento é feito em experiências agudas e esterilização da ponta da pipeta não é necessária. 2. Preparação de animais <ol><li> Coloque o rato em uma caixa de anestesia. </li><li> Induzir anestesia, utilizando 4% de isoflurano durante 5 a 10 min. </li><li> Colocar o animal sobre uma mesa estereotáxico com almofada de aquecimento e uma sonda rectal para manter uma temperatura corporal de 37 ° C. Use um cone do nariz para manter a anestesia com isoflurano a 2%. Fixe a cabeça do rato, utilizando barras de ouvido e suporte de dentes. </li><li> Aplicar pomada ou colírio oftalmológicas, que incluem 1% Atropina cai para ajudar na dilatação da pupila. Para evitar o ressecamento, aplicar lubrificante quedas aproximadamente a cada 30 min. </li><li> Raspar a cabeça e limpe-o com 10% de iodopovidona. </li><li> Para a anestesia local, injectar 0,5 ml de lidocaína a 2% no âmbito do couro cabeludo em 2-3 locais, levantando-se a pele e inserir a ponta da agulha. </li><li> Confirmar nível adequado da anestesia através da realização de um aperto do dedo do pé e observando-se a falta de movimento. Além disso, controlar o ritmo cardíaco para garantir que ele é dentro dos valores normais (de 300 a 400 batimentos / min). </li><li> Inciso o couro cabeludo em uma linha reta ao longo da mediana, com uma lâmina de bisturi nº 10 para expor ambas as suturas coronal e sagital. </li><li> Revelar o lambda e Bregma pontos, empurrando de lado o tecido que está cobrindo o crânio com uma espátula cirúrgica. </li><li> Nível do crânio para que posições bregma e lambda são no mesmo plano. </li><li> Para definir o ponto de referência, use um dispositivo estereotáxico com um tubo de vidro montada para defini-la bem acima Bregma. Este será o &quot;zero&quot; para o antero-posterior e medcoordena medições ial-laterais. </li><li> Defina o ponto de interesse, movendo o estereotáxico para montar as coordenadas necessárias, observe as coordenadas estereotáxica e desenhar um quadrado ao redor da área-alvo que marca onde a craniotomia será realizada. </li><li> Use uma furadeira com uma broca cirúrgica esterilizada ao longo da praça marcada lentamente, sem pressão para remover lentamente o material ósseo. Tenha cuidado para não perfurar muito tempo na mesma área, uma vez que irá produzir calor e causar lesões no córtex. </li><li> Quando o osso que delimita a craniotomia tornou-se suficientemente fina, retire cuidadosamente a seção cranial com pinça para expor o córtex. </li><li> Irrigar freqüentemente o córtex exposto com fluido cerebrospinal artificial para evitar a dessecação dos tecidos. NOTA: a remoção dura-máter é desnecessário no rato como a ponta do injectrode é robusto o suficiente para penetrar. </li></ol> 3. Preenchimento e Montagem do Sistema de Injeção <ol><li> Encha o5-10 ul micro por aspiração com óleo mineral. </li><li> Encher a agulha hipodérmica com a pipeta de vidro fixado com uma solução de 0,5% de Chicago Sky Blue (CSB) e 300 uM de ácido γ-aminobutírico (GABA) ou uma solução de lidocaína a 2% com 0,5% de CSB 9. Dilui-se todas as soluções com solução salina. <ol><li> No caso de uma substância abundante, preencher usando uma seringa regular e utilizar as técnicas usuais de precaução para evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> No caso de substâncias mais caros, usar óleo mineral para preencher o injectrode e o agente químico pode então ser introduzido por aspiração. À medida que a diferença de densidade entre o óleo mineral e água é relativamente elevada, esta substância é um bom candidato para a injecção de soluções aquosas. NOTA: Um corante pode ser adicionado para confirmar a separação entre os dois líquidos. </li></ol></li><li> Para encher a pipeta de injecção, encher uma seringa de 1 ml com a solução por aspiração e depois injectar a solução lentamentepara a pipeta de injecção. </li><li> Preste muita atenção para vazamentos em regiões indicadas na figura 1 limpando essas áreas limpas e observando as fugas pela injeção ainda mais a solução lentamente com a seringa. </li><li> Remover a seringa de 1 ml. Ao fazê-lo, certifique-se de manter uma leve pressão sobre o êmbolo de modo que o vácuo não remover a solução da pipeta de injeção. </li><li> Preencha a micro com óleo mineral por aspiração e anexá-lo firmemente à pipeta de injeção preenchido, em seguida, limpe cuidadosamente qualquer excesso de solução na injectrode montado com gaze. </li><li> Verificar que a ponta não é bloqueado pela injecção de um volume muito reduzido, o suficiente para ver uma pequena gota formando na ponta da pipeta de vidro. </li><li> Monte o injectrode no sistema micropump e garantir que ele está bem fixo. </li><li> Posicionar cuidadosamente a ponta injectrode nas coordenadas alvo e diminuir a ponta para a superfície do córtex. </li><li> Lentamente, abaixe o injectrode utilizar o aparelho estereotáxico para a estrutura de alvo (colículo superior, neste caso), utilizando as coordenadas anatómicas apropriadas. </li><li> Cubra o córtex exposto com agar quente para evitar a dessecação dos tecidos. </li></ol> 4. Injeção e inativação reversível <ol><li> Defina a bomba de microinjeção para injetar 400 a 800 nl em 40 nl / min e pressione Executar para iniciar a injeção. Note-se que taxa de pico vai mostrar redução durante a injecção. NOTA: Na configuração experimental, a atividade neural recuperado dentro de uma hora após o fim da entrega GABA. Qualquer dispositivo mecânico calibrado pode ser utilizado para aplicar pressão sobre a seringa de micro-injecção, a fim de realizar a injecção. </li><li> Após a aquisição dos dados eletrofisiológicos, eutanásia usando um método aprovado pela comunidade local animal Ética. </li></ol>

<ol><li>Martin, J. H., Ghez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inactivation+in+the+analysis+of+the+central+control+of+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).</li>
<li>Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+indirect+pathways+to+visual+response+properties+in+macaque+middle+temporal+area+MT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT.</a> The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).</li>
<li>Lomber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+limitations+of+permanent+or+reversible+deactivation+techniques+in+the+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).</li>
<li>Malpeli, J., Schiller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).</li>
<li>Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoloop%3A+an+adaptable+reversible+cooling+deactivation+method+for+behavioral+or+electrophysiological+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).</li>
<li>Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+parameters+of+cortical+inactivation+by+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).</li>
<li>Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+Reorganized+Primary+Somatosensory+%28SI%29+Cortex+after+Local+Inactivation+of+Normal+SI+Cortex+in+Chronic+Spinal+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats.</a> Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).</li>
<li>Malpeli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Minville, K., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+frequency+processing+in+posteromedial+lateral+suprasylvian+cortex+does+not+depend+on+the+projections+from+the+striate-recipient+zone+of+the+cat%E2%80%99s+lateral+posterior-pulvinar+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex.</a> Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).</li>
<li>Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+the+binocular+visual+field+in+the+superior+colliculus+of+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat.</a> Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O protocolo proposto foi projetado para resolver os desafios decorrentes de métodos atuais de inativação reversíveis. Especificamente, este projeto visa aperfeiçoar os métodos utilizados para microinjeções químicas das substâncias que modulam a atividade neural, particularmente em estruturas cerebrais profundas. Um desafio técnico que emerge a partir deste tipo de instalação é a necessidade de ambas as sondas para ser co-localizada no mesmo espaço restrito in vivo a fim de obter gravações precisas no local da i...

A inactivação de áreas corticais e núcleos sub-corticais é importante no estudo das relações funcionais entre diversas estruturas cerebrais 2-4. A literatura recente empregue química perda de função ou técnicas criogénicas para estudar o papel das estruturas cerebrais 2,5. No que diz respeito a micro-injecções farmacológicas, pequenos volumes de medicamentos podem ser administrados em uma região do cérebro, a uma taxa controlada ao mesmo tempo minimizando os danos colaterais ao tecido circundante 6,7. Esta técnica pode ser usada para fornecer agonistas específicos, agonistas inversos ou antagonistas para estudar o efeito de diferentes alvos farmacológicos na actividade neuronal. Tais efeitos também pode ser estudado através da medição alterações nas respostas neuronais a partir de locais distantes, permitindo que os investigadores a estudar as relações entre as diferentes estruturas corticais e sub-corticais. Aqui, nós demonstramos a montagem de um dispositivo, o injectrode, capaz de both gravar sinais eletrofisiológicos e entrega de pequenas quantidades de drogas no local de destino. Nós demonstramos as capacidades deste sistema através da injecção de GABA, um inibidor comum de actividade neuronal, no colículo superior do rato. Esta região é sensível à estimulação visual, o que nos permitiu usar a atividade multiunit visualmente evocados para confirmar injectrode localização. A reversibilidade da inativação foi avaliada pela recuperação da atividade neuronal normal após o final da injeção GABA. A capacidade para monitorizar a actividade de multi-unidade a partir do local de injecção permite o ajuste fino das taxas de injecção e dos volumes necessários para se conseguir a resposta farmacodinâmica desejada. Portanto, uma vantagem desta técnica é a de limitar o potencial dano tecidual causado pela microperfusão, uma vez que os menores volumes eficazes são injectados. O protocolo proposto fornece um método eficiente de custos para gerar o necessar hardware descartávely para a realização de experiências onde a entrega de drogas e gravação atividade neuronal local está desejados.

<table><tbody><tr><td>Bomba de injeção (UltraMicroPump III)</td><td>WPI</td><td>#UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Console de injeção (Micro4 Controller)</td><td>WPI</td><td>#SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamliton</td><td>(80301) 701LT 10 &micro; L Seringas SYR</td><td>entre 5 e 10 &mu; l</td></tr><tr><td>usado Adesivo plástico flexível</td><td>Lepage</td><td>393915</td><td>A forma de gel é mais fácil de aplicar ao eixo do 30&nbsp; G agulha hipodérmica formando uma vedação à prova d'água quando seca.</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro</td><td>WPI</td><td>#TW100F-4</td><td>Parede fina, 1&nbsp; mm OD, 0,75&nbsp; mm ID com pipetas de filamento usadas</td></tr><tr><td>720 Extrator de pipetas de agulha</td><td>Kopf</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>782500</td><td>0,010 " desencapados</td></tr></tbody></table>

gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Aqui nós descrevemos um método para a construção de um uso único &quot;injectrode&quot; usando peças comercialmente acessíveis e económicas. Um sistema de sondagem foi desenvolvido que permite a injecção de um fármaco durante a gravação de sinais electrofisiológicos da população de neurónios afectados. Este método fornece uma alternativa simples e económica para soluções comerciais. Uma pipeta de vidro foi modificado combinando-o com uma agulha hipodérmica e um filamento de prata. O injectrode está ligado a bomba de micro comercial para entrega da droga. Isso resulta em uma técnica que fornece feedback em tempo real através de sinais extracelulares farmacodinâmica de múltiplas unidades provenientes do local de entrega de drogas. Como prova de conceito, registramos a atividade neuronal do colículo superior provocada por flashes de luz em ratos, concomitantemente com a entrega de drogas através da injectrode. A capacidade de gravação injectrode permite a caracterização funcional do injsite de exão favorecendo o controle preciso sobre a localização de entrega da droga. A aplicação deste método também se estende muito além do que é demonstrado aqui, como a escolha de substância química carregada no injectrode é vasto, incluindo o rastreamento de marcadores para experimentos anatômicos.

A construção do injectrode é ilustrada na Figura 1. Um fio de prata (C) é alimentado para dentro de uma pipeta de vidro de (D) com uma porção do arame dobrado e projectando-se para fora a partir da abertura. Uma agulha 30 G (B) está ligado e selado para a abertura da pipeta de vidro com cola. Após a pipeta foi cheia com a substância de injecção, uma micro seringa de vidro (A) está ligado à agulha. É importante que exista uma boa vedação onde o micro liga seringa com a agulha (E) e em que o fio de prata ...

Aqui, criamos uma pipeta de vidro com funções duplas: inibição de estruturas cerebrais profundas por microinjeções de drogas e monitoramento em tempo real de seus efeitos por meio de registros eletrofisiológicos simultâneos.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

O objetivo geral deste procedimento é construir uma via injetável acessível para microinjeção de neurotransmissores no colículo superior de ratos enquanto se monitora a atividade neuronal multissinal. Isso é realizado primeiramente criando uma pipeta de vidro utilizando um capilar de vidro e um puxador de micropipetas vertical. O segundo passo é inserir um fio de prata no capilar, com uma seção do fio protrudindo pela extremidade não afunilada.Em seguida, usa-se cola para criar um selo hermético entre a pipeta de vidro e uma agulha hipodérmica. Os passos finais consistem em preencher a pipeta com uma solução de GABA corada com azul Chicago sky blue, conectada a uma microsiringa cheia de óleo mineral e fixada a um microinjetor. Em última análise, essa construção de um injetor com peças acessíveis e de baixo custo pode ser utilizada para inativar estruturas cerebrais profundas enquanto se registra a atividade neuronal da área inativada antes, durante e após a injeção de uma droga.Existem algumas vantagens desta técnica em comparação com outros métodos existentes, como pulsos de pressão baseados em gás e sistemas de injeção fotônica. Uma delas é que se trata de um método economicamente eficiente, que permite o controle baseado na função da liberação do fármaco, limitando os danos teciduais causados pela superinjeção. Outra vantagem oferecida por este sistema é a capacidade combinada de gravação, que permite um controle eficiente sobre o componente temporal da desativação neural.Para preparar as pipetas de injeção para gravação, puxe primeiro um capilar de sete centímetros com diâmetro externo de um milímetro para um modelo cop vertical 720 ou similar. Ajuste o aquecedor para 18 e o solenoide para 1. Em seguida, usando luvas, quebre manualmente a ponta para formar uma abertura e verifique ao microscópio se o diâmetro interno está entre 30 e 40 micrômetros.Meça isso com a régua do visor. Isso produzirá uma impedância relativamente baixa de 0,3 a 0,6 mega ohms. Em seguida, a partir da extremidade não cônica, insira um fio de prata no interior da pipeta, com cerca de sete centímetros de comprimento, deixando um a dois centímetros projetando-se para fora da pipeta.Dobre este excesso de fio ortogonalmente ao capilar. Em seguida, pegue uma agulha hipodérmica de calibre 30 e aplique adesivo plástico flexível sobre o eixo. Então, insira lentamente a agulha no interior da pipeta.Na medida do possível, adicione mais adesivo para criar uma vedação na junção entre a pipeta e a agulha. Com a ponta da pipeta voltada para cima, deixe o conjunto secar por cerca de 12 horas.Após anestesiar e posicionar a rata em um estereotáxico, aplique pomada oftálmica e retire completamente os pelos da cabeça. Após aplicar um anestésico local e confirmar o plano cirúrgico de anestesia, prossiga com a incisão do couro cabeludo ao longo da linha mediana usando uma lâmina de bisturi número 10. Isso exporá as suturas coronal e sagital.Em seguida, utilizando uma espátula cirúrgica, identifique as referências anatômicas Lambda e bgma. Ajuste a posição da cabeça para que essas referências estejam niveladas no mesmo plano horizontal. Em seguida, posicione no zero um ponteiro fino e rígido, como um tubo de vidro, sobre o bgma.Em seguida, ajuste a posição do tubo para uma região de interesse utilizando as coordenadas do bgma. Use o marcador para desenhar um quadrado ao redor da área-alvo para a craniotomia. Agora, com a broca esterilizada cirurgicamente, remova lentamente o osso ao longo das marcações.Comece usando a menor pressão possível e mantenha a broca em movimento para evitar danos teciduais induzidos pelo calor devido à fricção quando o osso estiver fino, remova cuidadosamente a seção quadrada com pinça. A Dora MA não precisa ser removida, pois a injeção irá penetrá-la adiante. Mantenha o córtex exposto irrigado com fluido espinhal cerebral.Prepare a injeção preenchendo primeiro uma seringa de cinco a 10 microlitros com óleo mineral. Em seguida, prepare a droga de interesse com um corante em solução salina fisiológica. Aqui, 0,5% de azul céu de Chicago é misturado com 300 micromolar de GABA.Agora, encha a pipeta de injeção carregando primeiro uma seringa de um mililitro com uma solução preparada e, em seguida, usando a seringa para carregar a pipeta. Ao remover a seringa, mantenha uma leve pressão no êmbolo, para que um vácuo não remova a solução do canal de injeção. Verifique a presença de vazamento de fluido em possíveis pontos de vazamento.Enxugue qualquer fluido em excesso e verifique novamente se há vazamento. Agora, acople a micros seringa com óleo mineral à via de injeção. Em seguida, remova com cuidado qualquer solução excedente.Com gaze. Verifique a ponta da injeção. Deve ser possível fazer escorrer pequenas gotas de solução através dela; caso contrário, está obstruída ou agora fixe firmemente o injetor a um sistema de bomba micro. Em seguida, mova a posição da via de injeção para as coordenadas-alvo e abaixe o eletrodo até o colículo superior, que pode ser identificado por meio da gravação de potenciais evocados visuais. Enquanto o eletrodo é abaixado, aplique uma pequena pressão positiva aplicando uma taxa baixa de injeção para evitar entupimentos. Interrompa a injeção quando a estrutura for atingida.Após inserir a injeção, cubra o córtex exposto com agar quente para prevenir a dessecação. Após a colocação final do eletrodo, aguarde 30 minutos para permitir a estabilização do tecido ao redor do eletrodo. Em seguida, injete de 400 a 800 nanolitros de solução a uma taxa de 40 nanolitros por minuto até uma ativação da atividade neuronal no colículo superior; o eletrodo deve mostrar uma redução nos potenciais de ação durante a injeção da solução inibitória.Os potenciais evocados visualmente foram obtidos no colículo superior. Após um estímulo luminoso de 300 milissegundos ao olho contralateral mediante a injeção de gaba, a atividade de disparos em resposta ao estímulo luminoso foi suprimida por 45 a 60 minutos. Durante este procedimento, é importante verificar vazamentos durante o carregamento e confirmar que a solução do fármaco está fluindo livremente pela ponta de injeção.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos um método para ressonância magnética funcional simultânea e gravação eletrofisiológicas no cérebro de roedores, proporcionando uma plataforma para a investigação da relação entre a atividade neural e sinalizar o nível de oxigenação do sangue (BOLD) dependente de ressonância magnética.

FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Este protocolo descreve a montagem e o uso de um injetor para administração precisa de medicamentos em regiões cerebrais específicas de um rato anestesiado, seguido pelo monitoramento da atividade neuronal por meio de sinais elétricos registrados.

Microinjeção de Drogas com Registro Eletrofisiológico em Cérebro de Rato

Este vídeo demonstra o procedimento detalhado para preparar um rato anestesiado para registros eletrofisiológicos da atividade cerebral de vários locais. O couro cabeludo é dissecado para acessar o crânio e os orifícios são feitos em locais precisos para instalar e prender os eletrodos. Os eletrodos de microfios de tungstênio são então inseridos no local de destino para registrar os dados.

Registros eletrofisiológicos in vivo de atividades cerebrais de vários locais em ratos

O vídeo demonstra a gravação eletrofisiológica simultânea de várias regiões do cérebro em um rato usando uma matriz integrativa de micro-drives. Os eletrodos de registro são colocados no bulbo olfatório, os eletrodos de referência no córtex frontal e os eletrodos de matriz de micro-drive no hipocampo. O rato pode forragear livremente e a gravação simultânea de todos os eletrodos implantados é registrada usando a matriz.

Um método de matriz de micro-drive para registro eletrofisiológico de várias regiões do cérebro

Este vídeo demonstra o procedimento para gravações simultâneas de eletroencefalografia co-localizada (EEG) e potenciais de campo local (LFPs) em um rato anestesiado. O processo envolve preparar o rato e anexar eletrodos estimulantes às almofadas do bigode. Um eletrodo de aranha EEG é colocado no crânio do rato para medições de EEG de superfície. Ao mesmo tempo, um microeletrodo multicanal é inserido em uma região específica do cérebro através de um orifício no crânio para registrar a atividade...

Registros Eletroencefalográficos Simultâneos e Potenciais de Campo Local em um Rato Anestesiado

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais...

Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Este protocolo descreve um método simples para gravação simultânea de co localizada Eletroencefalografia (EEG) e multi-laminar local campo potencial em um rato anestesiado. Um orifício de trépano, perfurado o crânio para a inserção de um microeléctrodo é mostrado para produzir distorção negligenciável do sinal EEG.

Gravação simultânea de eletroencefalografia co localizada e potencial do campo Local em roedores

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Apresentamos um sistema de microinvacinação projetado para eletrofisiologia e entrega assistida de sondas experimentais (ou seja, nanossensores, microeletrodos), com infusão opcional de medicamentos. Componentes microfluídicos amplamente disponíveis são acoplados a uma cânula contendo a sonda. Um protocolo passo a passo para a construção de microinjectrodes está incluído, com resultados durante a infusão de muscimol no córtex de macaco.

Sistema de microininjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

Aprenda a construir uma micropipeta de vidro para microinjeção de neurotransmissores e gravação eletrofisiológica simultânea no cérebro de roedores. Este método acessível permite inativar estruturas cerebrais profundas enquanto monitora a atividade neuronal em tempo real.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

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