Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

O objetivo geral deste procedimento é construir uma via injetável acessível para microinjeção de neurotransmissores no colículo superior de ratos enquanto se monitora a atividade neuronal multissinal. Isso é realizado primeiramente criando uma pipeta de vidro utilizando um capilar de vidro e um puxador de micropipetas vertical. O segundo passo é inserir um fio de prata no capilar, com uma seção do fio protrudindo pela extremidade não afunilada.

Em seguida, usa-se cola para criar um selo hermético entre a pipeta de vidro e uma agulha hipodérmica. Os passos finais consistem em preencher a pipeta com uma solução de GABA corada com azul Chicago sky blue, conectada a uma microsiringa cheia de óleo mineral e fixada a um microinjetor. Em última análise, essa construção de um injetor com peças acessíveis e de baixo custo pode ser utilizada para inativar estruturas cerebrais profundas enquanto se registra a atividade neuronal da área inativada antes, durante e após a injeção de uma droga.

Existem algumas vantagens desta técnica em comparação com outros métodos existentes, como pulsos de pressão baseados em gás e sistemas de injeção fotônica. Uma delas é que se trata de um método economicamente eficiente, que permite o controle baseado na função da liberação do fármaco, limitando os danos teciduais causados pela superinjeção. Outra vantagem oferecida por este sistema é a capacidade combinada de gravação, que permite um controle eficiente sobre o componente temporal da desativação neural.

Para preparar as pipetas de injeção para gravação, puxe primeiro um capilar de sete centímetros com diâmetro externo de um milímetro para um modelo cop vertical 720 ou similar. Ajuste o aquecedor para 18 e o solenoide para 1. Em seguida, usando luvas, quebre manualmente a ponta para formar uma abertura e verifique ao microscópio se o diâmetro interno está entre 30 e 40 micrômetros.

Meça isso com a régua do visor. Isso produzirá uma impedância relativamente baixa de 0,3 a 0,6 mega ohms. Em seguida, a partir da extremidade não cônica, insira um fio de prata no interior da pipeta, com cerca de sete centímetros de comprimento, deixando um a dois centímetros projetando-se para fora da pipeta.

Dobre este excesso de fio ortogonalmente ao capilar. Em seguida, pegue uma agulha hipodérmica de calibre 30 e aplique adesivo plástico flexível sobre o eixo. Então, insira lentamente a agulha no interior da pipeta.

Na medida do possível, adicione mais adesivo para criar uma vedação na junção entre a pipeta e a agulha. Com a ponta da pipeta voltada para cima, deixe o conjunto secar por cerca de 12 horas.

Após anestesiar e posicionar a rata em um estereotáxico, aplique pomada oftálmica e retire completamente os pelos da cabeça. Após aplicar um anestésico local e confirmar o plano cirúrgico de anestesia, prossiga com a incisão do couro cabeludo ao longo da linha mediana usando uma lâmina de bisturi número 10. Isso exporá as suturas coronal e sagital.

Em seguida, utilizando uma espátula cirúrgica, identifique as referências anatômicas Lambda e bgma. Ajuste a posição da cabeça para que essas referências estejam niveladas no mesmo plano horizontal. Em seguida, posicione no zero um ponteiro fino e rígido, como um tubo de vidro, sobre o bgma.

Em seguida, ajuste a posição do tubo para uma região de interesse utilizando as coordenadas do bgma. Use o marcador para desenhar um quadrado ao redor da área-alvo para a craniotomia. Agora, com a broca esterilizada cirurgicamente, remova lentamente o osso ao longo das marcações.

Comece usando a menor pressão possível e mantenha a broca em movimento para evitar danos teciduais induzidos pelo calor devido à fricção quando o osso estiver fino, remova cuidadosamente a seção quadrada com pinça. A Dora MA não precisa ser removida, pois a injeção irá penetrá-la adiante. Mantenha o córtex exposto irrigado com fluido espinhal cerebral.

Prepare a injeção preenchendo primeiro uma seringa de cinco a 10 microlitros com óleo mineral. Em seguida, prepare a droga de interesse com um corante em solução salina fisiológica. Aqui, 0,5% de azul céu de Chicago é misturado com 300 micromolar de GABA.

Agora, encha a pipeta de injeção carregando primeiro uma seringa de um mililitro com uma solução preparada e, em seguida, usando a seringa para carregar a pipeta. Ao remover a seringa, mantenha uma leve pressão no êmbolo, para que um vácuo não remova a solução do canal de injeção. Verifique a presença de vazamento de fluido em possíveis pontos de vazamento.

Enxugue qualquer fluido em excesso e verifique novamente se há vazamento. Agora, acople a micros seringa com óleo mineral à via de injeção. Em seguida, remova com cuidado qualquer solução excedente.

Com gaze. Verifique a ponta da injeção. Deve ser possível fazer escorrer pequenas gotas de solução através dela; caso contrário, está obstruída ou agora fixe firmemente o injetor a um sistema de bomba micro.

Em seguida, mova a posição da via de injeção para as coordenadas-alvo e abaixe o eletrodo até o colículo superior, que pode ser identificado por meio da gravação de potenciais evocados visuais. Enquanto o eletrodo é abaixado, aplique uma pequena pressão positiva aplicando uma taxa baixa de injeção para evitar entupimentos. Interrompa a injeção quando a estrutura for atingida.

Após inserir a injeção, cubra o córtex exposto com agar quente para prevenir a dessecação. Após a colocação final do eletrodo, aguarde 30 minutos para permitir a estabilização do tecido ao redor do eletrodo. Em seguida, injete de 400 a 800 nanolitros de solução a uma taxa de 40 nanolitros por minuto até uma ativação da atividade neuronal no colículo superior; o eletrodo deve mostrar uma redução nos potenciais de ação durante a injeção da solução inibitória.

Os potenciais evocados visualmente foram obtidos no colículo superior. Após um estímulo luminoso de 300 milissegundos ao olho contralateral mediante a injeção de gaba, a atividade de disparos em resposta ao estímulo luminoso foi suprimida por 45 a 60 minutos. Durante este procedimento, é importante verificar vazamentos durante o carregamento e confirmar que a solução do fármaco está fluindo livremente pela ponta de injeção.