Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

O objetivo geral deste procedimento é construir uma estrada de injeção acessível para microinjetar neurotransmissores no colículo superior do rato enquanto monitora a atividade neuronal de várias unidades. Isso é feito criando primeiro uma pipeta de vidro usando um capilar de vidro e um extrator de micropipeta vertical. O segundo passo é inserir um fio de prata no capilar com uma seção de fio saindo da extremidade não cônica.

Em seguida, a cola é usada para criar uma vedação firme entre a pipeta de vidro e uma agulha hipodérmica. As etapas finais são encher a pipeta com uma solução de GABA de cor azul celeste de Chicago conectada a uma microseringa cheia de óleo mineral e fixada a um microinjetor. Em última análise, essa construção de uma injeção com peças acessíveis e acessíveis pode ser usada para inativar estruturas cerebrais profundas enquanto registra a atividade neuronal da área inativada antes, durante e após a injeção de uma droga.

Existem algumas vantagens dessa técnica em relação a outros métodos existentes, como pulsos de pressão à base de gás e sistemas de injeção fótica. Uma delas é que é um método econômico que permite o controle baseado na função sobre a administração do medicamento, o que limita o dano tecidual causado pela injeção excessiva. Outra vantagem que este sistema oferece é uma capacidade de gravação combinada, que permite um controle eficiente sobre o componente temporal da desativação neural.

Para preparar as pipetas de injeção de gravação, primeiro puxe um capilar de sete centímetros com um diâmetro externo de um milímetro para um modelo vertical de policial. Sete 20 ou unidade similar. Ajuste o aquecedor para 18 e o solenóide para um próximo, usando luvas, quebre manualmente a ponta para fazer uma abertura e verifique ao microscópio se o diâmetro interno está entre 30 e 40 micrômetros.

Meça isso com a régua do visor. Ele produzirá uma impedância relativamente baixa de 0,3 a 0,6 mega ohms. Em seguida, a partir da extremidade não cônica, insira um fio de prata na pipeta com cerca de sete centímetros de comprimento e deixe de um a dois centímetros pendurado para fora da pipeta.

Dobre esse excesso de fio ortogonalmente ao capilar. Em seguida, pegue uma agulha hipodérmica de calibre 30 e aplique adesivo plástico flexível no eixo. Em seguida, insira lentamente a agulha na pipeta.

Na medida do possível. Adicione mais adesivo para criar uma vedação na junção entre a pipeta e a agulha. Com a ponta da pipeta para cima, deixe o conjunto secar por cerca de 12 horas.

Depois de anestesiar e colocar o rato em uma estrutura estereotáxica, aplique pomada oftálmica raspe a cabeça. Depois de aplicar um anestésico local e confirmar um plano cirúrgico de anestesia, prossiga com a incisão do couro cabeludo ao longo da mediana usando uma lâmina de bisturi número 10. Isso irá expor as suturas coronal e sagital.

Em seguida, usando uma espátula cirúrgica, identifique as referências anatômicas Lambda e BGMA. Ajuste a posição da cabeça para que esses pontos de referência fiquem nivelados no mesmo plano horizontal. Então zero, um ponteiro rígido fino como um tubo de vidro no bgma.

Em seguida, ajuste a posição do tubo para um local de interesse usando as coordenadas do bgma. Use o sharpie para desenhar um quadrado ao redor da área-alvo para a craniotomia. Agora, com a broca cirúrgica esterilizada, remova lentamente o osso ao longo das marcas.

Comece usando o mínimo de pressão possível e mantenha a broca em movimento para evitar danos ao tecido induzidos pela cabeça devido ao atrito quando o osso se tornar fino, remova cuidadosamente a seção quadrada com uma pinça. O Dora MA não precisa ser removido, pois a injeção irá penetrá-lo daqui para frente. Mantenha o córtex exposto irrigado com líquido cefalorraquidiano.

Prepare a injeção enchendo primeiro a seringa de cinco a 10 microlitros com óleo mineral. Em seguida, prepare o medicamento de interesse com um corante em soro fisiológico. Aqui 0,5% de azul celeste de Chicago é misturado com 300 micromolares de gaba.

Agora encha a pipeta de injeção carregando primeiro uma seringa de um mililitro com uma solução preparada e, em seguida, usando a seringa para carregar a pipeta. Ao remover a seringa, mantenha uma leve pressão no êmbolo, para que o vácuo não remova a solução da estrada de injeção. Verifique se há fluido escapando em possíveis pontos de vazamento.

Limpe o excesso de líquido e verifique novamente se há vazamentos. Agora, conecte a seringa micros com óleo mineral na estrada de injeção. Em seguida, limpe qualquer excesso de solução.

Com gaze. Verifique a ponta de injeção. Deve ser possível fluir pequenas gotas de solução através dele, caso contrário, ele será bloqueado ou agora montará com segurança o injetor em um sistema de microbomba.

Em seguida, mova a posição da estrada de injeção para as coordenadas alvo e abaixe o eletrodo até o cólus superior, que pode ser identificado através do registro dos potenciais evocados visuais. Enquanto o eletrodo estiver abaixado, aplique uma pequena pressão positiva aplicando uma baixa taxa de injeção para evitar entupimento. Interrompa a injeção quando a estrutura for atingida.

Depois de inserir a injeção, cubra o córtex exposto com ágar quente para evitar a dessecação. Após a colocação final do eletrodo, aguarde 30 minutos para permitir a estabilização do tecido ao redor do eletrodo. Em seguida, injete 400 a 800 nanolitros de solução a uma taxa de 40 nanolitros por minuto até uma ativação da atividade neuronal no cólus superior, o eletrodo deve mostrar uma redução nos picos durante a injeção da solução inibitória.

Os potenciais evocados visualmente foram obtidos no colo superior. Após um flash de 300 milissegundos no olho contralateral após a injeção de gaba, a atividade de pico em resposta a um estímulo flash foi suprimida por 45 a 60 minutos. Ao realizar este procedimento, é importante verificar se há vazamentos durante o carregamento e verificar se a solução do medicamento está fluindo livremente pela ponta da injeção.