Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

O objetivo geral do experimento a seguir é incorporar canais iônicos dependentes de voltagem em vesículas unilamelares gigantes e caracterizar sua atividade com medições de patch clamp. Isso é conseguido primeiro desidratando parcialmente, uma solução de pequenas vesículas contendo o canal iônico KVAP para criar um filme de proteína lipídica. Em seguida, o filme lipídico é reidratado, o que causa a formação e o crescimento de vesículas ALR gigantes do tamanho de células ou gvs contendo o canal.

Em seguida, os gvs são transferidos para nossa câmara de registro e um pedaço de membrana GUV é excisado com uma pipeta para medir as correntes de íons. Os resultados mostram que os canais iônicos na membrana GUV são ativados em resposta a mudanças na voltagem da membrana com base na análise dos registros de corrente. Físicos unilaterais gigantes podem ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica relacionadas às interações de proteínas de membrana.

Por exemplo, a interação de proteínas transmembranares com as propriedades físicas da membrana lipídica. Embora esse método possa fornecer informações sobre a função do canal de ferro dependente de voltagem KVAP, ele também pode ser aplicado a outros canais, transportadores e bombas de ferro e proteínas transmembranares em geral. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas que envolvem a manipulação de vesículas gigantes são.

Como pegar apenas lendo artigos Depois de preparar soluções e pequenas vesículas unais contendo KVAP. De acordo com o protocolo de texto, prepare a câmara de eletroformação inserindo primeiro os fios através dos orifícios e girando e limpando os fios para garantir que estejam limpos, solados e secando sob uma corrente de nitrogênio ou ar. Prepare 30 microlitros de suspensão SUV de três miligramas por mililitro no buffer SUV conforme descrito no protocolo de texto, misture a solução vigorosamente para depositar a solução SUV.

Use uma pipeta de dois microlitros ou uma seringa de vidro de cinco microlitros para colocar pequenas gotículas da solução SUV nos fios. Certifique-se de que as gotas sejam pequenas o suficiente e espaçadas o suficiente para que não se toquem ou se fundam. Deixe os SUVs depositados secarem por cerca de 30 minutos ao ar livre.

Quando as gotículas se assentarem, gire o fio para que os depósitos lipídicos sejam mais fáceis de observar com o microscópio. Em seguida, use uma seringa para aplicar graxa a vácuo no fundo da câmara ao redor dos três poços e pressione suavemente uma lamínula de 40 milímetros por 22 milímetros contra ela para selar o fundo da câmara para que ela adira sem folgas. Em seguida, use pasta de teto para selar as laterais da câmara e aplique graxa a vácuo na parte superior da câmara, delineando os três poços.

Adicione lentamente o buffer de crescimento até que cada poço esteja cheio até o topo. Evite qualquer movimento rápido da solução nos poços, pois isso pode. Retire o filme lipídico dos eletrodos.

Feche a câmara pressionando suavemente a corrediça da tampa superior sobre a graxa. Tomando cuidado para não desalojar a lamínula inferior. Use duas garras jacaré para conectar o gerador de sinal aos fios.

Defina a frequência de acordo com a concentração de sal do buffer que está sendo usado e com um multímetro meça e ajuste a tensão nos fios. Também de acordo com o seu buffer, use papel alumínio para cobrir a câmara para proteger a flora fours da luz. Deixe os G UUVs crescerem por duas a três horas no tampão com baixo teor de sal e 12 horas ou durante a noite para o tampão com alto teor de sal.

Após a incubação, desconecte a câmara do gerador e coloque-a cuidadosamente em um microscópio invertido. Para avaliar o plasma de crescimento GUV, limpe uma lâmina de cobertura por um minuto para que a solução ARO se espalhe bem sobre ela. Dentro de 15 minutos após a limpeza da lâmina de cobertura, aplique 200 microlitros de solução aro quente preparada de acordo com o protocolo de texto para que molhe toda a superfície.

Incline a lâmina verticalmente e toque a borda inferior de um lenço de papel para remover o excesso de líquido, deixando uma camada fina e lisa de aros na lâmina. Coloque a lâmina em uma chapa quente ou forno a 60 graus Celsius e deixe secar por pelo menos 30 minutos. Em seguida, coloque uma lamínula revestida com AROS em uma placa de Petri padrão de 3,5 centímetros.

Depois de preparar a solução SUV, aplique suavemente cerca de 15 microlitros em cerca de 30 gotas muito pequenas na superfície aros. Tome cuidado para não distorcer muito a camada de aros. Colocar a lâmina sob uma corrente suave de azoto durante cerca de 10 a 15 minutos e acompanhar a evaporação do tampão a olho nu.

À medida que as gotículas secam assim que os SUVs secam, adicione cerca de um mililitro de tampão de crescimento para cobrir a superfície do slide. Deixe o inchaço prosseguir por cerca de 30 minutos e, em seguida, use um microscópio invertido com contraste de fase ou DIC Para examinar o crescimento dos GU UUVs na câmara de crescimento para remendar o grampo gu UUVs comeu a câmara adicionando uma solução de cinco miligramas por mililitro de beta Caine, o que impede que o Gus adira, espalhando-se e rompendo-se. Incubar durante cinco minutos e enxaguar, inserir o eléctrodo de terra e utilizar tampão de observação para encher a câmara.

Em seguida, transfira os G UUVs para a câmara de observação para GU UUVs eletroformados. Abra a câmara de crescimento removendo suavemente a lamínula superior. Coloque a ponta da pipeta diretamente acima de cada fio e, para desconectar os UUVs GU, aspire lentamente cerca de 10 microlitros enquanto move a ponta da pipeta ao longo do fio para UUVs GU de inchaço assistido por gel.

Primeiro, bata na lateral da placa de Petri algumas vezes para separar os GU UUVs da superfície da lamínula. Posicione a ponta da pipeta logo acima da lamínula e aspire 10 microlitros enquanto puxa a ponta de volta sobre a superfície e transfira diretamente o GVS colhido para a câmara de observação. Aguarde alguns minutos para que o Gus se acomode no fundo para prender o GVS.

Use o tampão de observação para encher uma pipeta de remendo nova e monte-a no patch clamp cabeçote. Procure na câmara para localizar um GUV sem defeitos e verifique se ele contém proteína fluorescente. Aplique uma pressão positiva constante de mais de 100 pascais para manter o interior da pipeta de remendo limpo e insira a pipeta de remendo na câmara.

Traga a pipeta de conexão para o campo de view e aplique pulsos de teste para medir ou compensar o deslocamento e a resistência da tensão da pipeta. Em seguida, examine a pipeta sob iluminação fluorescente para confirmar se a ponta está limpa. Traga a pipeta de conexão em direção ao GUV e, se necessário, reduza simultaneamente a pressão positiva para que o fluxo externo da pipeta de conexão não faça o GUV fugir.

Quando a pipeta de adesivo estiver perto do GUV, aplique pressão negativa para puxar o GUV contra a pipeta de contato. Monitore a resistência à medida que a lingueta da membrana GUV entra na pipeta de remendo e a giga vedação se forma. Quando o remendo de membrana de dentro para fora tiver sido excisado do GUV e o selo giga estiver estável, desligue os pulsos de teste e aplique um protocolo de tensão conforme descrito no texto.

Esta figura mostra imagens de fluorescência DIC e epi de um GUV livre de defeitos. A fluorescência uniforme da proteína na membrana GUV confirma que o KVAP é incorporado ao GUV em vez de permanecer no filme lipídico e não formou agregados que Gus produziu usando os três métodos são vistos aqui. Os sinais fluorescentes de lipídios e proteínas foram dimensionados para a mesma densidade média, de modo que g UUVs com baixa ou alta densidade de proteína tenham um tom magenta ou verde nas imagens de sobreposição, enquanto GVS com densidade média de proteína são brancos.

Foram identificados G UUVs isolados e sem defeitos e a distribuição do tamanho do GUV é mostrada aqui. Normalmente, a eletroformação produz mais G UUVs sem defeitos do que o inchaço assistido por gel, mas os GUS produzidos pela eletroformação são menores. Aqui é mostrada a distribuição da densidade da proteína inferida da fluorescência GUV.

A eletroformação com alto tampão de sal produz GU UUVs com densidades proteicas variáveis. A densidade varia muito menos para a eletroformação com baixo tampão de sal e a densidade proteica dos UUVs GU produzidos pelo gel O inchaço assistido é notavelmente uniforme, dependendo da concentração de proteína no adesivo excisado. Os rastreamentos atuais mostram canais únicos ou um conjunto de canais.

KVAP mostra a abertura dependente da tensão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar as vesículas gigantes de objetos frágeis não resistentes ao estresse puro e osmótico. Seguindo este procedimento, métodos como puxar nanotubos lipídicos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como detecção de curvatura de proteínas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir GVS contendo proteínas funcionalmente reconstituídas.