Name: Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a reconstituir o canal iônico KvAP em vesículas unilamelares gigantes usando métodos de desidratação-reidratação. Esta técnica permite caracterizar a atividade funcional por meio de gravações patch-clamp em biologia de membranas.

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Agradecemos a Susanne Fenz por discutir a possibilidade de reconstituir proteínas por inchaço de agarose, Feng Ching Tsai pelas medições atuais e membros atuais e antigos do grupo Bassereau pelo apoio e assistência. O projeto foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (subvenção BLAN-0057-01), pela Comissão Europeia (NoE SoftComp), pela Université Pierre et Marie Curie (subvenção da FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. foi apoiado por uma bolsa de doutorado internacional do Institut Curie, SA por uma bolsa da Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. por uma bolsa Marie Curie Incoming International Fellowship da Comissão Europeia e uma bolsa da Université Pierre et Marie Curie. As taxas de publicação foram cobertas pelo Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038).

1. Preparação de Solução <ol><li> Prepare 5 ml de &quot;tampão de SUV contendo 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5), e 2 mM de trealose. Filtra-se o tampão com um filtro de seringa de 0,2 um e dividir em alíquotas de 1 ml, que podem ser armazenadas a -20 ° C. NOTA: Detalhes adicionais para reagentes e instrumentos são indicados na lista de materiais. </li><li> Prepare 40 ml de GUV &#39;Crescimento Buffer&#39; que vai encher o interior GUV durante a reidratação filme. Para um crescimento &quot;baixo teor de sal&quot;, combinar KCl 5 mM, HEPES 1 mM (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), e ~ 400 mM de sacarose. Para um crescimento &#39;de sal fisiológico, combinar KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de sacarose. </li><li> Preparar 40 ml de &quot;Tampão de Observação &#39;para a solução externa na câmara experimental através da combinação de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de glucose. NOTA: Estes buffers são apenas examples. Veja a discussão para adaptar os buffers para outras experiências. </li><li> Meça as osmolaridades do crescimento e da observação buffers com um osmômetro. Adicionar grânulos de sacarose ou glicose para combiná-los para dentro de 1%, de modo que não irá lisar GUVs ou entrar em colapso quando transferido a partir da câmara de crescimento para a câmara de observação. NOTA: Nesta gama de concentração, a adição de 1 mM de sacarose (13,7 mg por 40 ml) ou glucose (7,2 mg por 40 ml) aumenta a osmolaridade por ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrar os tampões de crescimento e observação com um filtro de 0,2 um e armazená-las a 4 ° C para inibir o crescimento bacteriano. </li><li> Dissolve-se 50 mg de beta-caseína em 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampão para formar uma solução de beta-caseína de 5 mg / ml necessária para passivar as superfícies de câmaras experimentais de modo que não aderem GUVs, espalhou-e-rajada. Uma vez que a beta-caseína está completamente dissolvido (até várias horas a 4 ° C), filtra-se (0,2 um) em que alíquotas de 0,5 ml, que pode ser rapidamente congelados e armazenadosa -20 ° C para uso posterior (descongeladas aliquotas armazenadas a 4 ° C pode ser usada tipicamente para até 1 semana). </li></ol> 2. Preparação SUV <ol><li> Prepare e congelar alíquotas de PROTEO-SUVs seguindo o protocolo detalhado previamente publicado 28. Use KvAP marcado por fluorescência com Alexa-488 maleimida, reconstituída em DPhPC SUVs (10 mg / ml) a uma relação de proteína para lípido de 1:10 (em massa). NOTA: Tipo selvagem KvAP contém uma cisteína por monómero localizado perto do terminal C intra-celular (aminoácido 247). </li><li> Fluorescentes, só em lípides SUVs: NOTA: Manusear clorofórmio sob uma coifa vestindo luvas de borracha nitrílica e óculos de segurança. Evitar a utilização de qualquer plástico como o clorofórmio pode dissolvê-los. Soluções de clorofórmio pode ser armazenada em frascos de vidro âmbar com tampas de Teflon e transferido utilizando seringas de vidro. Tome cuidado para lavar todos os vidros pelo menos 5 a 10 vezes com clorofórmio, antes e após a pipetagem lipídios. <ol><li> Preparar 100 ul de10 SUVs mg / ml DPhPC contendo 0,5% molar do lípido fluorescente vermelho, vermelho do Texas DHPE, por mistura de 100 ul de solução DPhPC (10 mg / ml em clorofórmio) com 8,2 ml de solução de vermelho de Texas-DHPE (1 mg / ml em metanol) num frasco de vidro âmbar de 1,5 mL. </li><li> Secam-se os lípidos para baixo sob uma corrente de azoto numa campânula química durante a rotação do frasco. Quando o filme parece ser seco, colocar os lípidos em vácuo durante 3 horas para remover qualquer solvente residual. </li><li> Adicionar 100 mL de tampão de SUV para os lipídios, e vortex vigorosamente até não lipídica permanece preso às paredes do frasco e a solução é uniformemente leitoso. </li><li> Sonicar a solução de lípido para formar SUVs. Ajuste a posição frasco até o ultra-som faz com que a maior parte do movimento e fluxo dentro do frasco, e tomar cuidado para não aquecer a solução desnecessariamente. Continue a sonicação até que a solução se tornar translúcido, ou, quando possível, transparente (2-5 min para a ponta ultra-sons, ~ 20 min para o banho de ultra-sons). </li><li> AliquoSUVs t (por exemplo, 10 jul ou 20 l) e congelamento (-20 ° C) para uso posterior. NOTA: Os lipídios, principalmente lipídios insaturados, pode facilmente avaria. Soluções lipídicas loja a 20 ° C (ou 80 ° C), sob árgon e utilizar no prazo de 6 meses. Produtos de degradação de lipidos pode ser detectada com a cromatografia em camada delgada. </li></ol></li></ol> 3. GUV Crescimento por eletroformação <ol><li> Prepare a câmara eletroformação. <ol><li> Se a câmara não tenha sido limpo, retire as janelas, limpar tudo selante e graxa, extrair os fios, e lavar e esfregar a câmara com um lenço de papel, utilizando água e etanol (≥70%), alternadamente. </li><li> Esfregar os fios bem, submergir os fios e câmara em acetona, e sonicar durante 5 minutos. Limpe tudo com um tecido novamente usando acetona. Coloque a câmara em etanol e sonicado durante 5 minutos. </li><li> Monte a câmera, inserindo os fios através dos furos, e gire e limpe os fios para se certificar de que eles are limpo. Coloque a câmara em água destilada, sonicar durante 5 minutos e secar a câmara com uma corrente de azoto ou de ar. </li></ol></li><li> Preparar 30 ul de 3 mg / ml de suspensão de SUVs em tampão de SUV. Para formar GUVs contendo proteínas, combinar 8 ul de SUVs (Proteo-DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ul de SUV tampão num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para um final de proteína lipídica (massa) proporção de 1 para: 12,5 e de 0,1% molar TexasRed-DHPE. Misture a solução vigorosamente. <ol><li> Alternativamente, para a prática do protocolo com apenas SUVs lípidos, simplesmente combinar 10 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) com tampão de SUV 20 ul. </li></ol></li><li> Depositar o Solution SUV. <ol><li> Usar uma pipeta 2 mL ou 5 mL de seringa de vidro para depositar pequenos (&lt;0,2 ul) gotículas da solução SUV nos fios. Cerca de 1 ml de solução é necessário para formar uma série de gotas ao longo1 cm de fio. Certifique-se de que as gotas são pequenos o suficiente e separados o suficiente que eles não se tocam ou fusível. </li><li> Deixe os SUVs depositados secar por ~ 30 min, ao ar livre. Quando todas as gotas se instalaram, girar o fio de modo que os depósitos lipídicos são mais fáceis de observar ao microscópio. NOTA: Se os SUVs não secar o suficiente, eles podem simplesmente lavar os fios quando o buffer de crescimento é adicionado, durante a secagem em excesso pode danificar a proteína. Por causa da humidade do ar influencia a taxa de secagem, o tempo de secagem e / ou humidade do ar pode ser ajustado para obter resultados óptimos 30. A película lipídica sobre os fios devem ser visíveis ao microscópio. </li></ol></li><li> Monte a câmara. <ol><li> Fecha-se o fundo da câmara: Use uma seringa para aplicar graxa de vácuo para o fundo da câmara em torno dos três poços e prima de 40 mm x 22 milímetros lamela suavemente contra ele para selar o fundo da câmara de modo que ela adere, sem uma lacuna. Selar os lados da câmara (onde a saída fios) comvedação colar. Aplicar graxa de vácuo na parte superior da câmara que define os três poços. </li><li> Lentamente adicionar tampão de crescimento, até que cada poço é enchido até ao topo. Evitar qualquer movimento rápido da solução nos poços como este pode remover a película de lípido fora dos eléctrodos. </li><li> Feche a câmara pressionando o cursor superior tampa com cuidado sobre a graxa, tendo o cuidado para não deslocar a lamela inferior. Use um tecido para remover quaisquer gotas de tampão nas bordas de topo da tampa deslizante. NOTA: Este é um bom momento para examinar a câmara sob o microscópio para confirmar que o filme lipídico manteve-se nos fios. </li></ol></li><li> Ligue o gerador de sinais para os fios usando duas garras jacaré. Defina a frequência (onda senoidal de 10 Hz / 500 Hz para o buffer de sal baixo / alto) e usar um multímetro para medir e ajustar a tensão sobre os fios para 0,7 / 0,35 V raiz quadrada (Vrms) para o buffer de sal de baixa / média alta. Cubra a câmara com folha de alumínio para proteger os fluorophores da luz. Deixar tele GUVs a crescer durante 2 a 3 horas para o tampão de baixa salinidade, e 12 hr ou O / N para o tampão de alto teor salino. </li><li> Desligue a câmara do gerador e coloque-o cuidadosamente em um microscópio invertido para avaliar o crescimento GUV. Use, movimentos lentos ou estacionários fluxo de fluido nas cavidades prematuramente pode separar GUVs dos fios. NOTA: GUVs nas extremidades dos fios são normalmente visíveis no contraste de fase (objectiva 40X longa distância de trabalho), enquanto GUVs em qualquer lugar sobre a metade inferior dos fios pode ser visto com epifluorescência. Se não há GUVs são visíveis, tente rodar os fios de olhar para a superfície superior. GUVs pode ser armazenado a 4 ° C numa câmara de crescimento durante vários dias. </li></ol> 4. GUV Crescimento por inchaço Gel-assistida <ol><li> Preparar 10 ml de uma solução de agarose a 1% através da mistura de 100 mg de agarose com 10 ml de água pura. Aqueça até ferver, colocando-o no microondas a 480 W para ~ 20 seg. Mexa para certificar-se da agarose esteja completamente dissolvido. NOTA: A soluçãopode ser armazenada a 4 ° C e reaquecido quando necessário. </li><li> Plasma-clean (plasma de ar) uma tampa-slide durante 1 minuto para que a solução de agarose vai se espalhar muito bem nele. Usar a tampa-slides no próximo 15 min como o efeito de limpeza plasma desaparece rapidamente. </li><li> Aplicar 200 ul de solução de agarose quente para cada um de 22 x 22 mm 2 de modo deslizante a solução molha toda a superfície. Incline a deslizar verticalmente e tocar a borda inferior a um tecido para remover o excesso de líquido e deixar apenas uma camada lisa fina de agarose no slide. </li><li> Coloque o slide em uma chapa quente ou um forno a 60 ° C e deixe-o secar por pelo menos 30 min. O filme agarose é pouco visível a olho nu. Após as lâminas de arrefecer até à TA, utilizá-los imediatamente, ou armazenar para até uma semana num recipiente fechado a 4 ° C. </li><li> Coloque a lamela revestida de agarose em um padrão de 3,5 centímetros de Petri. </li><li> Preparar a solução de SUV tal como na Secção 3.2 e aplica ~ 15 ul da solução de SUV (3 mg / ml de lípido) em~ 30 muito pequenas gotas suavemente sobre a superfície de agarose. Tome cuidado para não distorcer a camada de agarose demais. </li><li> Colocar a lâmina sob uma ligeira corrente de azoto durante cerca de 10-15 min e a seguir a evaporação do tampão por olho como as gotículas de secar. </li><li> Assim que os SUVs terem secado, adicionar tampão de crescimento para cobrir a superfície da lâmina. Para uma pequena 3,5 centímetros prato Petri uso ~ 1 ml de tampão. </li><li> Permitir que o inchaço prosseguir durante ~ 30 min, e então analisar o crescimento de GUVs na câmara utilizando um microscópio invertido com contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial (DIC). NOTA: observação epifluorescência é difícil devido à forte fundo de fluoróforos em gel e a auto-fluorescência da agarose. </li></ol> 5. Colheita e Observing GUVs <ol><li> Passivate a câmara de observação (por exemplo, pequena placa de Petri ou lamela de vidro) para que GUVs não furar, espalhar e explodiu na parte inferior da câmara. Cubra a chamber inferior com uma solução de beta-caseína, incubar durante 5 min, lavar-se a solução de caseína com água pura e seca com uma corrente de ar ou de azoto, e, finalmente, adicionar tampão de observação (por exemplo, ~ 5 mm de profundidade por uma pequena placa de Petri). </li><li> Colher as GUVs. Cortar a extremidade de uma pipeta de 100 uL dicas de modo que a abertura é maior (~ 2 mm de diâmetro), aspira-se lentamente e como a tensão de corte de pipetagem pode facilmente destruir GUVs. <ol><li> Para GUVs formado eletrointensivas, abra a câmara de crescimento, removendo suavemente a parte superior lamela. Coloque a ponta da pipeta diretamente acima de cada fio e aspirado ~ 50 ul enquanto se move a ponta da pipeta ao longo do fio de separar os GUVs. NOTA: Pode ajudar a girar a fio para coletar GUVs sobre o &quot;outro lado&quot; do fio. </li><li> Para GUVs &quot;inchaço&quot; assistida-gel, primeiro toque no lado do prato de petri algumas vezes para ajudar os GUVs desprendimento da superfície da lamela. Posicione a ponta da pipeta logo acima da lamela e aspirado de 50 ul enquanto pulling a ponta para trás sobre a superfície. Transferir directamente GUVs colhidas para uma câmara de observação, ou armazenar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a 4 ° C durante até 1 semana. </li></ol></li><li> Coloque a câmara de observação em um microscópio invertido, adicione as GUVs à câmara de observação, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para se depositam no fundo da câmara. </li><li> Levantamento da câmara com contraste de fase ou DIC para localizar rapidamente lisas, esféricas (&#39;defeito livres) &quot;candidatos guv&quot;. Examine cada &quot;candidato GUV&quot; em epifluorescência para excluir quaisquer que contêm lipossomas menores aninhados dentro. Finalmente, verificar que a intensidade de fluorescência de lípidos é uniforme e compatível com uma única membrana (ou seja, unilamelar). NOTA: Em alguns bilamellar (ou multi-lamelares) vesículas, as membranas são muito próximos de ser resolvidas para que eles apareçam unilamelar em contraste de fase ou imagens DIC. No entanto, estes objectos podem ser distinguidos dos unilame realGUVs Llar por sua fluorescência de lípidos, que é duas vezes (ou mais) brilhantes. </li></ol> 6. GUVs de fixação de Patch <ol><li> Faça pipetas de patch com um diâmetro de ponta 1-2 mm de vidro de borosilicato capilar padrão usando o programa recomendado para o extrator pipeta. NOTA: tratamentos especiais, tais como polimento fogo não são necessários, e pipetas pode ser utilizado para vários dias depois de terem sido puxados se forem mantidos dentro de uma caixa fechada. </li><li> Passivar a câmara de incubação com uma solução de beta-caseína (5 mg / ml) para assegurar que não aderem GUVs, e espalhar sobre as superfícies da câmara de ruptura. Lavar a caseína fora após 5 min. </li><li> Insira o eletrodo de aterramento, encher a câmara com tampão de observação, transferir 10 mL da suspensão de GUV como descrito no passo 5.2 e 5.3, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para assentar no fundo. </li><li> Encha uma pipeta remendo fresco com a solução (buffer de observação ou outra solução iso-osmótica) emontá-lo no amplificador headstage patch-clamp. </li><li> Pesquisa através da câmara para localizar um GUV &quot;sem defeitos&quot;, como descrito na seção 5.4, e verifique se ele contém proteína fluorescente. </li><li> Aplicar uma pressão positiva constante (&gt; 100 Pa, ou H 2 O em um manômetro de cerca de 1 cm) para manter a pipeta remendo interior limpo, e inserir a pipeta de patch para a câmara. Traga a pipeta de patch para o campo de visão, aplicar pulsos de teste para medir / compensar o deslocamento e resistência à tensão pipeta, e examinar a pipeta sob iluminação fluorescente para confirmar que a dica é limpo. </li><li> Traga a pipeta de patch para o GUV e, se necessário, simultaneamente, reduzir a pressão positiva para que o fluxo de saída da pipeta patch não fazer a GUV &quot;fugir&quot;. Quando a pipeta patch está perto do GUV, aplicam uma pressão negativa (até 5 cm de H 2 O) para puxar o GUV contra a pipeta patch. Monitorar a resistência como o &quot;; Língua &quot;de membrana GUV entra na pipeta patch e as formas gigaseal. </li><li> Se um gigaseal não formaram, remova a pipeta patch da câmara e volte para o passo 6.4. Se o patch membrana formada uma gigaseal, mas a GUV permanecer ligado à pipeta, extirpar o patch puxando para longe do GUV, estourando a GUV contra o fundo da câmara, ou brevemente movendo a pipeta da solução. </li><li> Quando o remendo de membrana de dentro para fora foi excisada do GUV e o gigaseal é estável, desligar os pulsos de teste e aplicar um protocolo de tensão tal como o mostrado na Figura 13. NOTA: Figura 13 segue a convenção eletrofisiológico padrão para um patch de dentro para fora na qual a corrente que flui para o patch-eletrodo é &quot;positivo&quot;, e V = V banho - V pipeta. Segurando o remendo a um potencial negativo (por exemplo, V = -100 mV) para ~ 30 segundos lugares KvAP em estado de repouso, enquanto etapas (100 ms a 5 segundos) para potenciais mais positivos (por exemplo, V = 100 mV) pode, então, dirigir-la em Regência (ie, abertos) estados ativos. </li><li> Após as medições em um patch membrana terminar, quebrar o patch com um pulso zap ou pressão e verifique se o deslocamento do eletrodo remendo tensão não se afastou. Retirar a pipeta patch da câmara, e volte para o passo 6.4. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Sistemas de modelos biomiméticos são uma ferramenta importante para o estudo das propriedades e interações de proteínas e membranas. Em comparação com outros sistemas reconstituídos como MBL ou membranas lipídicas suportados, GUV sistemas baseados apresentam várias possibilidades incluindo controlo considerável de composição da membrana, a tensão e a geometria, bem como sendo verdadeiramente livre de óleo. No entanto, a incorporação de proteínas transmembrana, como KvAP, em GUVs requer adaptações significativas de proto...

Ao estudar os princípios físicos que regem os sistemas vivos, as abordagens bottom-up permitem um experimentalista para controlar composição do sistema e outros parâmetros que não são facilmente manipulados em sistemas baseados em células 1. Para os processos baseados em membrana, gigante Vesículas Unilamelares (GUVs, diâmetro ~ 1-100 mm) têm provado ser um sistema muito útil biomiméticos 2-7 como eles são adequados para estudos de microscopia e micromanipulação de 8 - 10. Embora existam muitos protocolos diferentes para produzir GUVs, a maioria se dividem em duas categorias - emulsão base aproxima 11,12 e técnicas baseadas em reidratação um filme lipídico 13-16. Em métodos baseados em emulsão, os folhetos interiores e exteriores das membranas de GUV são montados sequencialmente a partir de monocamadas de lípido nas interfaces água / óleo. Esta abordagem é ideal para a encapsulação de proteínas solúveis comnas GUVs, e para a formação de GUVs com composição lipídica folheto assimétrica. No entanto, GUVs formados a partir de emulsões podem reter vestígios de solvente que alterem as propriedades mecânicas da membrana 17, e a abordagem não é especialmente bem adequado para a reconstituição da proteína trans-membrana. Métodos de reidratação Filme contar com o facto de secagem (desidratação) faz com que muitas misturas de lipidos para formar uma pilha multi-lamelar de membranas. Se esta pilha é então colocado em contacto com um tampão aquoso, membranas na pilha vai mover fluxos separados como solvente e entre eles na superfície da pilha, as membranas individuais podem separar para formar GUVs 13,18 (bem como um verdadeiro zoológico de outros objetos lipídicas). No entanto, mesmo para composições de tampão e ótimos de lipídios, este método clássico &quot;inchaço espontânea&quot; tem um rendimento relativamente baixo de GUVs livres de defeitos. Um método amplamente utilizado para aumentar o rendimento de GUVs sem defeitos é &quot;eletroformação221 ;, em que um campo de corrente alternada (CA) é aplicada durante a re-hidratação do filme. Embora o mecanismo ainda pouco compreendida, &quot;eletroformação&quot; pode dar espetaculares rendimentos guv (&gt; 90%, em circunstâncias favoráveis) para buffers de baixa concentração de sal (&lt;5 mm) 14,19, e pode até mesmo trabalhar em tampões fisiológicos (~ 100 mM), utilizando uma freqüência mais alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e eletrodos de platina 15. Uma abordagem alternativa para aumentar o rendimento de GUVs livres de defeitos é &quot;assistida-gel inchaço&quot;, em que a solução de lípidos é depositada sobre um substrato de gel polimérico, em vez de o passivo (por exemplo, vidro, PTFE) substratos utilizados em clássica &quot;inchaço espontâneo &quot;. Quando o filme lipídico / gel resultante é reidratado, GUVs pode formar rapidamente, mesmo para tampões fisiológicos 16,20. Todos estes métodos podem produzir GUVs apenas em lípidos que podem ser utilizados para estudar os fenómenos de membrana associada, tais como ointeracção entre proteínas e membranas solúveis. No entanto, a incorporação de uma proteína trans-membrana em GUVs, são necessárias modificações significativas para assegurar que a proteína permanece num estado funcional durante todo o processo de reconstituição. Embora as soluções de lípidos em solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio, ciclo-hexano) são ideais para a produção de filmes de lípidos, proteínas trans-membranares são tipicamente estáveis ​​apenas quando o seu domínio transmembranar hidrófobo é incorporado numa bicamada lipídica, ou rodeado por uma micela de detergente ( por exemplo, durante a purificação de proteínas). Assim, o material de partida para uma reconstituição é tipicamente membranas nativas, a proteína purificada em uma solução de detergente, ou de pequenas vesículas unilamelares contendo proteínas (Proteo-SUVs) e / ou vesículas multi-lamelares (MLVs-proteo) formados por remoção de detergente na presença de lipídios. A maioria dos métodos para incorporar estas proteínas de membrana em GUVs se dividem em três categorias. Insertio Direton: proteína Trans-membrana suspensa em detergente é misturado com pré-formadas, lipídeos-somente, GUVs solubilizados levemente detergentes, e o detergente em seguida, removido usando BIOBEADS 21. Embora conceptualmente simples, este método requer um controlo preciso da concentração de detergente, como uma concentração demasiado elevada de detergente possa dissolver os GUVs enquanto uma concentração demasiado baixa pode causar a proteína se desdobrar ou agregado. GUV / Proteo-SUV Fusão: Proteína em PROTEO-SUVs é combinado com pré-formadas, lipídico-somente GUVs e fusão é facilitada com peptídeos fusogénicos especiais 22 ou detergente 21. Normalmente a extensão da fusão é limitado levando a GUVs com baixa densidade de proteína. Desidratação / A re-hidratação: Um filme de lípido contendo a proteína é formada por desidratação parcial de um proteo-SUV (ou proteo-MLV) e solução GUVs são então crescidas como para uma película de lípido puro. O desafio é óbvio para proteger a proteína durante o dehydrati parcialna etapa 23, mas o método tem sido utilizado com sucesso para reconstituir as proteínas trans-membranas, tais como a bacteriorodopsina, Cálcio-ATPase, integrina e VDAC em GUVs 7,23 - 25. Este artigo descreve protocolos de desidratação / re-hidratação para fazer GUVs contendo o canal de potássio dependentes da voltagem, KvAP, de Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termofílica. KvAP tem um elevado grau de homologia com os canais de potássio dependentes da voltagem eucariótica 26 e uma estrutura de cristal conhecida 27 , tornando-se um bom modelo para estudar o mecanismo de gating tensão. Produção dos Proteo-SUVs foi descrito em pormenor anteriormente e não faz parte deste tutorial 26,28,29. Importante, KvAP Proteo-SUVs não tem que ser produzido para cada preparação GUV, como elas podem ser armazenadas em pequenas (por exemplo, 10 ul) alíquotas a -80 ° C durante períodos de tempo prolongados (&gt; 1 ano). Eletroformaçãoou inchaço assistida-gel pode então ser usado para cultivar as GUVs de Proteo-SUVs KvAP (ou proteo-MLV). Os passos chave para o protocolo eletroformação estão ilustrados na Figura 1. As gotas de uma solução de SUVs que contêm a proteína é depositada em fios de platina (mostrado na Figura 2). Desidratação parcial da suspensão de SUV leva à formação de uma película de lípido, através da proteína de fusão de SUVs. Durante a hidratação, um campo de CA é aplicada aos eléctrodos, para auxiliar as camadas lipídicas para delaminar e formar GUVs. Um campo de 10 Hz funciona bem quando se usa &quot;baixo teor de sal&quot; (&lt;5 mm) tampão de reidratação 28 e GUVs levar várias horas para crescer. Em contraste, tampões fisiológicos (contendo ~ 100 mm sal) funcionam bem com uma tensão mais baixa, de 500 Hz campo AC, mas exigem uma prolongada (~ 12 horas) período de 15 inchaço. Este método é baseado em um protocolo anterior usando ITO desliza 24, mas usa uma câmara cont customaining dois fios de platina, como mostrado na Figura 2 (veja a discussão de detalhes do projeto e sugestões para o mais simples, câmaras improvisado). A Figura 3 ilustra o método de inchaço assistida-gel. O protocolo funciona bem com tampões com concentrações fisiológicas de sal, é rápido, e produz GUVs com uma distribuição mais homogênea da proteína. No entanto, o rendimento de, GUVs aparentemente livres de defeitos isolados (ou seja, a membrana GUV é uniforme no comprimento escalas ópticos e não coloque nenhum objeto) é menor, embora ele fornece um número suficiente para patch-clamp e experimentos de manipulação de micro- . Este método foi baseado num protocolo utilizando gel de agarose para produzir GUVs apenas em lipidos 16 e requer menos equipamento especializado do que o método da eletroformação. A caracterização de GUVs com microscopia de fluorescência é descrito, bem como procedimentos que utilizam um padrão de patch-clamp set-up paramedir a atividade KvAP no &quot;inside-out&quot; extirpado pedaços de membrana. Cultivo GUVs contendo proteína pode ser mais difícil do que GUVs apenas em lípidos. Em particular, o rendimento final GUV pode dependem sensivelmente exactamente como a solução SUV é depositado e desidratada para formar a pilha de membrana. Para alguém sem experiência anterior com GUVs, pode ser útil para a primeira GUVs crescer apenas em lípidos, segundo um protocolo convencional de 15,16 em que a folha de membrana é formada pela deposição de lípidos a partir de um solvente orgânico. Uma vez que o protocolo convencional funciona bem, deposição SUV e desidratação parcial pode, então, ser dominado usando SUVs apenas em lípidos, que são também muito útil quando se ajusta o protocolo para uma nova composição de lípido. Quando GUVs crescer de forma confiável a partir de SUVs apenas em lipídios, então é apenas um pequeno passo para produzir GUVs contendo proteínas de PROTEO-SUVs.

<table><tbody><tr><td>DPhPC (1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>Ovo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina (Ovo, Frango)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>PA Ovo L-&alfa;-ácido fosfatídico (Ovo, Frango)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&delta; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (lã ovina, >98%)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>lipídio marcado</td></tr><tr><td>BPTR-Ceramida</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&nbsp;</td><td>lipídio marcado</td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton Bonaduz AG</td><td></td><td>diversos</td></tr><tr><td>frascos de âmbar e copos de teflon</td><td>Sigma</td><td>SU860083 e SU860076</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>diverso</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromex</td><td>LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Glicose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Euromex</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Wescor</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Schott instrumentos</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.2 &micro; m</td><td>Sartorius steim</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de funções</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>Fios de platina</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>99,99+%, d = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Politetrafluoretileno</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 'graxa de alto vácuo'VWR</td><td></td> <td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>pasta de vedação</td><td>Vitrex medical A/S, Dinamarca</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum</td></tr><tr><td>Wax Cover slides 22 x 40 mm No1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>Cover slides 22 x 22 mm No1.5</td><td>VWR&nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>airplasma, configuração 'high'Placas de</td></tr> <tr><td>Petri</td><td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td><td>3,5 cm x 1 cm</td></tr><tr><td>patch clamp amplificador</td><td>Axon instruments</td><td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td>DAQ Card</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>Versão National Instruments</td><td> 8.6</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro boro silicato OD 1&nbsp; mm ID 0.58&nbsp; mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Eletrodo</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Sutter&nbsp;</td><td>P-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>ProSilica&nbsp;</td><td>Microscópio Zeiss GC1380</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td></td><td>Axiovert 135</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X longa distância de trabalho, Contraste de fase</td></tr><tr><td>Objetiva&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>100X Plan-Apochromat NA 1.3</td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros GFP (para Alexa-488)</td><td>Horiba</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros Cy3 (para TexasRed)</td><td>Horiba</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseína</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 cabeça confocal</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>para processamento de imagem e análise dos traços de corrente</td></tr></tbody></table>

reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-ion channel, kvap, em gigante unilamelares vesicles para microscopia e de patch estudos grampo

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Gigante Unilamelares vesículas (GUVs) são um sistema biomimético popular para estudar membrana fenômenos associados. No entanto, vulgarmente utilizados protocolos para crescer GUVs deve ser modificado de modo a formar GUVs contendo proteínas transmembranares funcionais. Este artigo descreve dois métodos de desidratação-reidratação - eletroformação e inchaço assistida-gel - para formar GUVs contendo o canal de potássio voltagem-dependentes, KvAP. Em ambos os métodos, a solução de pequenas vesículas unilamelares contendo proteína é parcialmente desidratado para formar uma pilha de membranas, o qual é, em seguida, deixadas inchar em um tampão de reidratação. Para o método da eletroformação, o filme é depositado sobre eléctrodos de platina, de modo que um campo CA pode ser aplicada durante a re-hidratação do filme. Em contraste, o método inchaço assistida-gel usa um substrato de gel de agarose para melhorar a hidratação do filme. Ambos os métodos podem produzir GUVs em (por exemplo, 100 mM), as concentrações baixas (por exemplo, 5 mM) e salinas fisiológicas. Os GUVs resultantes são caracterizados através de microscopia de fluorescência, e a função dos canais reconstituídos medida usando a configuração de patch-clamp de dentro para fora. Enquanto inchaço na presença de um campo eléctrico alternado (eletroformação) dá um rendimento elevado da GUVs livres de defeitos, o método inchaço assistida-gel produz uma distribuição de proteína mais homogénea e não requer nenhum equipamento especial.

O crescimento de GUVs pode ser rapidamente avaliada examinando a câmara de crescimento sob o microscópio. Para eletroformação, os GUVs tendem a crescer em grupos ao longo dos fios de platina, tal como mostrado na Figura 4. Durante inchaço assistida-gel, GUVs aparecem como estruturas esféricas que crescem rapidamente e fundem em conjunto (Figura 5). GUVs sem defeitos são mais facilmente identificados e avaliados após a transferência para uma câmara de observa...

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

O objetivo geral do experimento a seguir é incorporar canais iônicos ativados por voltagem em vesículas unilamelares gigantes e caracterizar sua atividade por meio de medidas de patch clamp. Isso é alcançado primeiramente pela desidratação parcial de uma solução de vesículas pequenas contendo o canal iônico KVAP, para criar um filme lipoproteico. Em seguida, o filme lipídico é reidratado, o que provoca a formação e o crescimento de vesículas gigantes de tamanho celular, chamadas ALR vesicles ou GVs, contendo o canal.Em seguida, os GVS são transferidos para nossa câmara de registro e um pedaço da membrana de GUV é destacado com uma pipeta de patch para medir as correntes iônicas. Os resultados mostram que os canais iônicos na membrana de GUV são ativados em resposta a alterações no potencial da membrana, com base na análise dos registros de corrente. Os físicos gigantes unilaterais podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biofísica relacionadas às interações de proteínas de membrana.Por exemplo, a interação de proteínas transmembranares com as propriedades físicas da membrana lipídica. Embora este método possa fornecer informações sobre a função do canal de ferro sensível à voltagem KVAP, ele também pode ser aplicado a outros canais de ferro, transportadores e bombas, bem como a proteínas transmembranares em geral. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas que envolvem a manipulação de vesículas gigantes o são.Como começar a leitura apenas dos artigos Após preparar as soluções e as vesículas unilamelares pequenas contendo KVAP. De acordo com o protocolo descrito no texto, prepare a câmara de eletroformação inserindo primeiro os fios através dos orifícios e girando e limpando os fios para garantir que estejam limpos, seguido de secagem sob fluxo de nitrogênio ou ar. Prepare 30 microlitros de suspensão de SUV a 3 miligramas por mililitro no tampão SUV conforme descrito no protocolo do texto, misturando vigorosamente a solução para depositar a suspensão de SUV.Utilize uma pipeta de dois microlitros ou uma seringa de vidro de cinco microlitros para colocar pequenas gotas da solução de SUV nos fios. Certifique-se de que as gotas sejam pequenas o suficiente e estejam espaçadas o suficiente para que não entrem em contato nem se fundam. Deixe os SUV depositados secar por cerca de 30 minutos ao ar livre.Quando as gotículas se assentarem, gire o fio para que os depósitos de lipídios fiquem mais fáceis de observar com o microscópio. Em seguida, use uma seringa para aplicar graxa de vácuo na parte inferior da câmara ao redor dos três poços e pressione suavemente uma lamínula de 40 milímetros por 22 milímetros contra ela para selar a base da câmara, de modo que adira sem deixar frestas. Depois, use cola de teto para selar as laterais da câmara e aplique graxa de vácuo na parte superior da câmara, contornando os três poços.Adicione lentamente o meio de crescimento até que cada poço esteja completamente cheio. Evite qualquer movimento rápido da solução nos poços, pois isso pode. Remova a película lipídica dos eletrodos.Feche a câmara pressionando suavemente a lamínula superior sobre a graxa, tomando cuidado para não deslocar a lamínula inferior. Use dois grampos de jacaré para conectar o gerador de sinal aos fios.Defina a frequência de acordo com a concentração de sal do tampão utilizado e, com um multímetro, meça e ajuste a tensão entre os fios. Também de acordo com o seu tampão, use folha de alumínio para cobrir a câmara e proteger a flora fours da luz. Deixe os G UUVs crescerem por duas a três horas no tampão de baixa salinidade e por 12 horas ou durante a noite no tampão de alta salinidade.Após a incubação, desconecte a câmara do gerador e coloque-a cuidadosamente sobre um microscópio invertido. Para avaliar o plasma de crescimento de GUV, limpe uma lamínula por um minuto para que a solução ARO se espalhe adequadamente sobre ela. Dentro de 15 minutos após a limpeza da lamínula, aplique 200 microlitros de solução ARO aquecida, preparada de acordo com o protocolo descrito no texto, de modo que ela umedça toda a superfície.Incline o lâmina verticalmente e toque a borda inferior em um lenço descartável para remover o excesso de líquido, deixando uma camada fina e uniforme de aros na lâmina. Coloque a lâmina em uma placa aquecedora ou estufa a 60 graus Celsius e deixe secar por pelo menos 30 minutos. Em seguida, coloque um lamínula revestido com AROS em uma placa de Petri padrão de 3,5 centímetros.Em seguida, após preparar a solução de SUV, aplique suavemente cerca de 15 microlitros em aproximadamente 30 gotas muito pequenas sobre a superfície de aros. Tenha cuidado para não deformar excessivamente a camada de aros. Coloque a lâmina sob um fluxo suave de nitrogênio por cerca de 10 a 15 minutos e acompanhe a evaporação do tampão a olho nu.Como as gotículas secam assim que os SUVs secam, adicione cerca de um mililitro de tampão de crescimento para cobrir a superfície da lâmina. Deixe o inchamento prosseguir por cerca de 30 minutos e, em seguida, use um microscópio invertido com contraste de fase ou DIC para examinar o crescimento dos GU UUVs na câmara de crescimento. Realize o patch clamp dos GU UUVs na câmara adicionando uma solução de beta Caine a cinco miligramas por mililitro, que impede que os Gus adiram, espalhem e rompam. Incube por cinco minutos, lave, insira o eletrodo de terra e use tampão de observação para preencher a câmara.Em seguida, transfira os GUUVs para a câmara de observação destinada aos GUUVs eletroformados. Abra a câmara de crescimento removendo suavemente a lamínula superior. Posicione a ponteira da pipeta diretamente acima de cada fio e, para destacar os GUUVs, aspire lentamente cerca de 10 microlitros enquanto move a ponteira da pipeta ao longo do fio, no caso dos GUUVs com inchaço assistido por gel.Primeiro, toque levemente na lateral da placa de Petri algumas vezes para desprender os GVS UUVs da superfície do lamínula. Posicione a ponta da pipeta logo acima do lamínula e aspire 10 microlitros enquanto retira a ponta sobre a superfície, transferindo diretamente os GVS colhidos para a câmara de observação. Aguarde alguns minutos para que os GVS se depositem no fundo, antes de realizar o patch clamp nos GVS.Use o tamp&atilde;o de observa&ccedil;&atilde;o para encher uma pipeta de patch nova e monte-a no est&aacute;gio da cabe&ccedil;a do patch clamp. Procure no compartimento para localizar uma GUV sem defeitos e verifique se ela cont&eacute;m prote&iacute;na fluorescente. Aplique uma press&atilde;o positiva constante superior a 100 pascals para manter o interior da pipeta de patch limpo e insira a pipeta de patch no compartimento.Traga a pipeta de selamento para o campo de visão e aplique pulsos de teste para medir ou compensar o desvio de tensão e a resistência da pipeta. Em seguida, examine a pipeta sob iluminação fluorescente para confirmar que a ponta está limpa. Aproxime a pipeta de selamento em direção à GUV e, se necessário, reduza simultaneamente a pressão positiva para que o fluxo para fora da pipeta de selamento não faça a GUV se afastar.Quando a pipeta de grampo estiver próxima à VUG, aplique pressão negativa para puxar a VUG contra a pipeta de grampo. Monitore a resistência conforme a língua da membrana da VUG entra na pipeta de grampo e o selo gigôhmico se forma. Quando o remendo da membrana de dentro para fora tiver sido excisado da VUG e o selo gigôhmico estiver estável, desligue os pulsos de teste e aplique um protocolo de tensão conforme descrito no texto.Esta figura mostra imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e de fluorescência em epifluorescência de uma GUV sem defeitos. A fluorescência proteica uniforme na membrana da GUV confirma que KVAP foi incorporado na GUV em vez de permanecer no filme lipídico, e que não formou agregados. GUVs produzidas usando os três métodos são mostradas aqui. Os sinais lipídicos e proteicos fluorescentes foram ajustados para a mesma densidade média, de modo que GUVs com baixa ou alta densidade proteica apresentam tonalidade magenta ou verde nas imagens sobrepostas, enquanto GUVs com densidade proteica média aparecem brancas.GUVs isoladas sem defeitos foram identificadas e a distribuição do tamanho das GUVs é mostrada aqui. Tipicamente, a eletroformação produz mais GUVs sem defeitos do que o inchamento assistido por gel, mas as GUVs produzidas por eletroformação são menores. É mostrada aqui a distribuição de densidade proteica inferida a partir da fluorescência das GUVs.A eletroformação com tampão de alta salinidade produz VUVs GU com densidades proteicas variáveis. A variação é muito menor na eletroformação com tampão de baixa salinidade, e a densidade proteica das VUVs GU produzidas por inchamento assistido por gel é notavelmente uniforme, dependendo da concentração proteica no remendo excisado. Os traçados de corrente mostram ou canais individuais ou um conjunto de canais.KVAP apresenta abertura dependente de voltagem. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as vesículas gigantes são objetos frágeis, não resistentes a tensões cisalhantes e osmóticas. Após este procedimento, métodos como o alongamento de nanotubos lipídicos podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a detecção de curvatura por proteínas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir GVS contendo proteínas funcionalmente reconstituídas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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