Name: Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a realizar pneumonectomia em ratos para estudar crescimento compensatório pulmonar. Este método cirúrgico permite investigar mecanismos de regeneração alveolar e crescimento do tecido pulmonar remanescente.

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Os autores gostariam de agradecer à Divisão de Serviços Veterinários do Hospital Infantil de Cincinnati por sua assistência. Este manuscrito foi apoiado pelo National Institutes of Health K12 HD028827. Anna Perl, PhD, ensinou aos autores esse procedimento cirúrgico.

Declaração uso Animal:: NOTA Todos os procedimentos deste estudo foram realizados com a aprovação e seguir as orientações da Institutional Uso de Animais e do Comitê Care (IACUC) no Hospital Infantil de Cincinnati. Oito semanas de idade C57BL / 6J machos foram obtidos a partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) e deixados a aclimatar durante uma semana antes da utilização. Até a cirurgia, os animais foram alojados em uma instalação de barreira livre de patógenos e desde ração autoclavada e filtrada libdium ad água. Cada gaiola do rato foi fornecido com um ar dedicado e água, e quartos foram mantidos em um ciclo de dia-noite de 12 h. Após a recuperação da cirurgia, os ratos foram mantidos em gaiolas com tops filtrados, desde autoclavado libidum anúncio de comida, e desde que a água filtrada a partir de uma garrafa de água. 1. Preparação de Instrumentos <ol><li> Faça 6 afastadores pele usando clipes de papel e pinos. Torção endireitou clipes de papel nas hastes de papel pinos, lbeiral de um fio de aço resistente cinco centímetros em uma extremidade e fazer uma única 0,5 centímetro &quot;L&quot; em forma de gancho na extremidade do fio. </li><li> Faça cerca de 15 x 15 centímetros campos cirúrgicos quadrados usando filme plástico. Prepare um molho por mouse. Coloque uma torre de papel entre cada envoltório. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, juntamente com uma pilha de telhas de 12 x 12 polegadas de cortiça, gazes, e cotonetes. </li></ol> 2. Preparação do rato <ol><li> Induzir a anestesia com isoflurano a 2%. Pesar animal. </li><li> Em uma área dedicada preparação cirúrgica raspar tórax esquerdo e pescoço com barbeador elétrico. </li><li> Aplicar uma gota de lágrima artificial do unguento para os olhos do rato. </li><li> Descontaminar pescoço e tórax esquerdo com clorexidina e álcool isopropílico. Repita mais duas vezes. </li></ol> Intubation 3. Rato Oro-traqueal e ventilação mecânica <ol><li> Ter um lugar não-estéril técnico cirúrgico o supino do mouse na área cirúrgica pré-aquecido.</li><li> Confirme profundidade da anestesia, documentando a falta de uma resposta a pata pitada. </li><li> Depois de lavar as mãos e vestindo traje cirúrgico, máscara e chapéu, don luvas cirúrgicas estéreis. </li><li> Depois de drapeados e utilizando uma técnica asséptica, fazer uma incisão vertical um centímetro sobre o mid-neck anterior para expor a laringe. Levemente retrair os músculos da cinta com curvas, serrilhadas 10 centímetros forceps e expor a laringe e traquéia, espalhando os músculos da cinta com a ponta de uma tesoura reta. </li><li> Oralmente inserir um 22 G de ponta romba angiocateter em meados da década de traquéia (Figura 1A) e visualmente confirmar a colocação (Figura 1B). Manter a anestesia e ventilar usando 1-3% de isoflurano através roedor ventilador (225 mL por acidente vascular cerebral; 200 AVC por min). Empregar um limite de pressão de 15 cm H 2 O. </li></ol> 4. Rato Pneumonectomia <ol><li> Coloque o mouse em decúbito lateral direito, com frente para as costas do ratoo operador (lateral-se à esquerda). Usar um filme plástico auto-selante como um campo estéril. Corte através da cortina, usar tesoura curva sem corte para fazer um 2 cm de comprimento corte paralelo às costelas no 4º e 5º espaço intercostal. Insira a ponta curvada tesoura sem corte e dissecar a pele longe das costelas subjacentes e músculos intercostais. </li><li> Retirar a pele com quatro afastadores para expor um quadrado de 1,5 x 1,5 centímetros janela cirúrgica (Figura 2A). Prenda os retratores à placa de cortiça. </li><li> Dissecar até costelas usando uma pinça curva, e usar uma ponta da pinça curvas para entrar na cavidade torácica. </li><li> Usando as micro-tesoura com ponta romba, utilizar a lâmina inferior para entrar na cavidade torácica. Faça um 0,5 centímetros incisão entre as costelas e repita na direção oposta. </li><li> Usando os dois afastadores restantes, abrir o tórax no eixo ântero-posterior e o seguro dos retratores para a placa de cortiça (Figura 2B). </li> &lt;li&gt; Usando pinças curvas de ponta romba na mão esquerda, o pulmão esquerdo agarrar e deslocar a parte superior do pulmão esquerdo lateralmente e inferiormente através da toracotomia até a artéria pulmonar esquerda e brônquios são exposto (Figura 3A, B). </li><li> Segurando o titânio microclipe vascular aplicador carregado na mão direita com o corpo do aplicador na palma e ponta curvada apontando para fora a partir da palma (Figura 3C), deslize a ponta do aplicador para o tórax ao longo da curvatura da face posterior da esquerda pulmão e prender o brônquio esquerdo e artéria pulmonar (Figura 3D). </li><li> Retire o aplicador, mas manter o pulmão esquerdo retraído. Segure as contundentes micro-tesoura de ponta com a mão direita e cortar o brônquio e distal da artéria pulmonar ao clipe e remover pulmão esquerdo (Figura 3E). </li><li> Retire os afastadores de costela. </li><li> Use a pinça sem corte curvas para beliscar até 1 cm de pele inferior ao incisiem, mas acima do nível do diafragma e inserir um angiocateter de 24 L através da pele e para dentro da cavidade torácica esquerda (Figura 4A, B). </li><li> Use 5-0 prolene sutura para colocar dois pontos separados em torno da 4ª e 5 ª costelas para fechar a cavidade torácica. </li><li> Remover os afastadores de pele. Usar dois conjuntos de pinças para aproximar a pele ao longo do comprimento da incisão e cola a pele fechada. </li><li> Conecte-se a 3 ml seringa luer-lock ao angiocateter e remover o ar residual através da aplicação de sucção suave e retirada do angiocateter. </li><li> Cole a incisão no pescoço fechada com dois conjuntos de fórceps, como antes. </li></ol> 5. Rato Sham Pneumonectomia <ol><li> Exponha o pulmão esquerdo como observado no protocolo &quot;Rato Pneumonectomia&quot;. Levantar a caixa torácica com uma pinça sem corte curvas para permitir que o ar na cavidade torácica esquerda (Figura 5A, B). </li><li> Coloque um G angiocateter 24 para o tho esquerdaRacic cavidade como acima tomando cuidado para não ferir o pulmão esquerdo. </li><li> Usando 5-0 prolene sutura e tomando cuidado para não perfurar o pulmão (Figura 5C), coloque dois pedaços de material de sutura na 3ª / 4ª e 5ª / 6 interspaces th costela (Figura 5D). Coloque os dois pedaços de material de sutura antes de amarrar para diminuir os riscos de hérnia de pulmão esquerdo. Amarre o material de sutura para fazer dois pontos separados (Figura 5E). </li><li> Cole a pele sobre a incisão torácica, remover o ar residual com o angiocateter e cole a incisão no pescoço, como acima. </li></ol> 6. Resuscitation, Analgesia, e Recovery <ol><li> Desligue o isoflurano, e administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina e 0,5 ml de solução salina normal subcutaneamente. </li><li> Quando respirações espontâneas retomar, remova o tubo endotraqueal. </li><li> Observe rato até que seja novamente ambulatorial. Andando normalmente resumes vários minutos após a remoção do tubo endotraqueal. </li><li> Posicione o mouse em um 27 ° C incubadora (umidificado, 25% de oxigênio) para recuperar O / N. NOTA: Nós colocamos vários pellets de ração umedecida com água no chão da gaiola para as primeiras 24 horas após a cirurgia. </li><li> Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via intraperitoneal duas vezes por dia durante três dias após a cirurgia. Tome cuidado para não abrir o local da cirurgia ao manusear animais. </li></ol> 7. Rato Monitoring <ol><li> Pesar camundongos em 1, 3, 5, e 7 dias após a cirurgia. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós fornecemos a descrição mais detalhada dos procedimentos PNX PNX rato e rato sham reportados à data. Fizemos o leitor ciente de várias das armadilhas comuns que os investigadores de aprendizagem do procedimento comumente encontrar, e nós descrevemos várias técnicas desenvolvidas por nosso laboratório para mitigar contra essas armadilhas. Outros laboratórios que utilizam este modelo pode ter desenvolvido outras modificações na técnica ou utilizar diferentes instrumentos. Ao avaliar as diferenças de técnicas, os invest...

A principal função do pulmão é o de proporcionar para o oxigénio e dióxido de carbono troca entre um organismo e a atmosfera. Nos seres humanos, uma série de condições congênitas e adquiridas levar à redução da área de superfície do pulmão o que resulta em redução da função pulmonar. Apesar de uma série de terapias, como corticóides inalatórios, broncodilatadores, oxigênio suplementar e ventilação mecânica crônica são usados ​​para atenuar as consequências da redução da função pulmonar 1-3, a terapia ideal para essas condições seria promover o crescimento do tecido pulmonar funcional - ou seja, pulmão regeneração. Regeneração de tecidos de mamíferos tem sido bem documentada. O espinhoso Rato Africano pode regenerar grandes áreas da pele, sem a formação de cicatrizes 4. A falange distal em seres humanos podem se regenerar após uma lesão ou amputação 5-7. Seguindo pneumonectomy (PNX), o crescimento compensatório pulmonar ocorre em camundongos 8, 9 ratos, fazergs 10, e os humanos 11. Por definição, o crescimento compensatório pulmonar envolve não apenas a expansão dos espaços aéreos existentes, mas re-septation desses espaços aéreos ampliada com a expansão da microcirculação associada 12. Análise da expressão gênica tem demonstrado que este modelo recapitula muitos dos eventos de sinalização de desenvolvimento pulmonar 13. Quatro semanas após rato PNX, área superficial alveolar é equivalente ao de animais operados simulados 14. Neste artigo, são apresentadas a PNX mouse e procedimentos PNX sham.

<table><tbody><tr><td>Aplicador de clipe vascular de 6 polegadas</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>137062</td><td></td></tr><tr><td>Horizon pequeno clipe vermelho de titânio</td><td>Teleflex Medical (WECK)</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva de padrão estreito de 12 cm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada curva de 10 cm Graefe</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha</td> <td>CastroviejoFine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura reta de estrabismo de 9 cm (ponta romba)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina endurecida reta de 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Cohan-Vannas de ponta reta e romba</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-12</td><td></td></tr><tr><td>Cola para a pele</td><td>Gluture</td><td>32046</td><td></td></tr><tr><td>22 G Angiocateter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 G Angiocateter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td></td>Luer lock de 3 ml</tr><tr><td>4 Afastadores</td><td></td><td></td><td></td>curtos</tr><tr><td>2 Afastadores</td><td></td><td></td><td></td>longos</tr><tr><td>5-0 Prolene em agulha cortante curva</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Seringa em agulha</td><td></td><td></td><td></td> 27 G</tr><tr><td>Solução salina</td><td></td><td></td><td></td>normal</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Press-n-Seal envoltório</td><td>Glad Products Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 x 12 polegadas Pilha de placa de cortiça</td><td>Office Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de rato</td><td>Hugo Sachs Elektronnik</td><td>Minivent Tipo 845</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>OHMEDA</td><td>Excel 210 SE</td><td></td></tr><tr><td>Pomada lacrimal artificial</td><td>Puralube</td><td>NDC: 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

rato pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

Em humanos, o reparo e a remodelação interrompidos do pulmão lesionado contribuem para uma série de distúrbios pulmonares agudos e crônicos que podem levar à incapacidade ou morte. Modelos animais de reparo e regeneração pulmonar baseados em lesões são limitados por respostas específicas de lesões, dificultando a diferenciação de alterações relacionadas à resposta e resolução de lesões de alterações relacionadas ao reparo pulmonar e regeneração pulmonar. No entanto, o uso de modelos animais para identificar essas vias de sinalização de reparo e regeneração é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias destinadas a melhorar a função pulmonar após lesão pulmonar. O modelo de pneumonectomia em camundongos utiliza o crescimento pulmonar compensatório para isolar esses sinais de reparo e regeneração, a fim de definir mais claramente os mecanismos de reseptação alveolar. Aqui, descrevemos nossa técnica para realizar pneumonectomia em camundongos e pneumonectomia simulada. Esta técnica pode ser utilizada em conjunto com o rastreamento de linhagem ou outros modelos de camundongos transgênicos para definir o mecanismo molecular e celular de reparo e regeneração pulmonar.

. Um lote de PNX e operação simulada rato pesos é fornecido na Figura 6 Em nossas mãos, a sobrevivência é constantemente 95-100% para ambos PNX e sham pneumonectomy. 14 Para obter descrições de como o pulmão direito re-cresce neste modelo e o curso do tempo esperado, nos referimos ao leitor manuscritos de Gibney 15 et al. E Wang et al. Várias armadilhas comuns devem ser evitados para realizar com êxito os procedimentos sham pneumonecto...

A pneumonectomia de camundongos é um modelo comumente empregado de crescimento pulmonar compensatório. Este procedimento pode ser usado em conjunto com o rastreamento de linhagem ou modelos de camundongos transgênicos para elucidar os mecanismos subjacentes.

Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

O objetivo deste procedimento é realizar uma pneumonectomia à esquerda para induzir o crescimento compensatório do pulmão direito. Isso é realizado primeiramente realizando uma toracotomia à esquerda e expondo o hilo esquerdo. O segundo passo do procedimento é ligar o hilo esquerdo e a artéria pulmonar esquerda.O terceiro passo é remover o pulmão esquerdo. O passo final é fechar a toracotomia. O modelo de pneumonectomia em camundongo para crescimento pulmonar compensatório pode ser utilizado em conjunto com outras técnicas biométricas ou bioquímicas para elucidar os mecanismos de crescimento e regeneração alveolar.Este método pode responder algumas perguntas-chave na área de desenvolvimento e regeneração pulmonar, como quais são os principais processos celulares envolvidos na septação e quais são os processos moleculares celulares críticos necessários para reiniciar a septação? Geralmente, pesquisadores novos nesta técnica terão dificuldades com uma das várias etapas principais. Eles podem ter dificuldade com a canulação traqueal.Eles podem ter dificuldade em criar uma janela cirúrgica adequada. Podem ter dificuldade em identificar o hilo e prendê-lo, e também podem ter dificuldade em evitar lesões no pulmão esquerdo durante a toracotomia simulada. A demonstração deste procedimento será feita por Shang Lu, assistente sênior de laboratório do meu laboratório. Para começar, após induzir anestesia no camundongo com 2% de isoflurano, depile a região torácica esquerda e o pescoço com uma máquina elétrica, aplique pomada de lágrima artificial nos olhos do camundongo e descontamine a área esfregando com clorexidina três vezes, seguido de álcool isopropílico três vezes e novamente com clorexidina.Três vezes. Confirme a profundidade da anestesia documentando a ausência de resposta a um aperto firme após fazer uma incisão vertical de um centímetro sobre a região anterior média do pescoço para expor a laringe; use uma pinça serrilhada de 10 centímetros para retrair levemente os músculos esternocleidomastoides. Em seguida, use as pontas de uma tesoura reta para separar os músculos esternocleidomastoides.A seguir, introduza oralmente um cateter angio com ponta romba de calibre 22 na traqueia média e confirme visualmente a colocação através da incisão. Coloque o camundongo em um ventilador para roedores e mantenha a anestesia com 2% de isoflurano e um limite de pressão de 15 centímetros de água. Posicione o camundongo ainda anestesiado em decúbito lateral direito, com o lado dorsal esquerdo voltado para o operador.Coloque uma película plástica autoadesiva sobre o corpo do camundongo como um campo estéril. Use uma tesoura curva com pontas rombas para fazer um corte de dois centímetros de comprimento paralelo às costelas no quarto e quinto espaços intercostais. Em seguida, insira as pontas da tesoura e dissecione a pele afastando-a das costelas subjacentes e dos músculos intercostais.Posicione quatro retratores na pele para formar uma janela cirúrgica de 1,5 por 1,5 centímetro. Fixe cada retractor na tábua de cortiça. Use pinças curvas para dissecar até as costelas e, em seguida, realizar uma dissecação romba do intercostal.Para expor as quarta e quinta costelas, use uma ponta de uma pinça curva para fazer um orifício e acessar a cavidade torácica. Agora, use a lâmina inferior de uma tesoura microcircular de ponta romba para pressionar ao longo do corte até que a lâmina inferior entre na cavidade torácica. Faça um corte de 0,5 centímetro entre as costelas e, em seguida, repita na direção oposta.Em seguida, abra o tórax ao longo do eixo anterior-posterior inserindo dois retratores e fixando-os na cortiça. Agora, carregue o aplicador de microclips. A seguir, usando pin&ccedil;as curvas com ponta romba seguradas na m&atilde;o n&atilde;o dominante, segure o pulm&atilde;o esquerdo e desloque a por&ccedil;&atilde;o superior lateralmente e inferiormente atrav&eacute;s da toracotomia at&eacute; expor a art&eacute;ria pulmonar esquerda e o br&ocirc;nquio.Em seguida, segure o replicador de microclipe vascular de titânio carregado na mão dominante, com o corpo do aplicador na palma da mão e a ponta curva voltada para longe da palma. Deslize a ponta do aplicador para dentro do tórax ao longo da curvatura da face posterior do pulmão esquerdo e prenda a brônquio esquerdo e a artéria pulmonar. Remova o aplicador, mas mantenha o pulmão esquerdo retratado.Segure a tesoura microcirúrgica de ponta romba com a mão direita e corte o brônquio e a artéria pulmonar distal ao clipe, removendo então o pulmão esquerdo. Após a remoção do pulmão, retire os afastadores de costelas. Em seguida, use a pinça curva de ponta romba para pinçar um centímetro de pele inferior à incisão, mas acima do nível do diafragma, e insira um cateter angiocateter de calibre 24 através da pele e dentro da cavidade torácica esquerda.Em seguida, coloque dois pontos interrompidos de polipropileno 5-0 ao redor das quarta e quinta costelas. Para fechar a cavidade torácica, remova os afastadores de pele e use dois pares de pinças para aproximar a pele ao longo do comprimento da incisão e utilize adesivo tecidual para colar a pele fechada. Por fim, conecte uma seringa de 3 mL com conexão luva de bloqueio ao cateter angiocateter e remova o ar residual aplicando sucção suave e retirando o cateter angiocateter.Finalize colando o pescoço, fechando a incisão com dois conjuntos de pinças, como no fechamento da incisão torácica. Após expor o pulmão esquerdo do camundongo anestesiado conforme mostrado anteriormente, use pinças rombas curvas para levantar a caixa torácica e permitir a entrada de ar na cavidade torácica esquerda. Introduza um cateter angiocateter laser de calibre 24 no lado esquerdo da cavidade torácica, conforme mostrado anteriormente, tomando cuidado para não lesionar o pulmão esquerdo. Utilize sutura de polipropileno 5-0, tomando cuidado para não perfurar o pulmão.Coloque dois segmentos de material de sutura entre o terceiro e o quarto e entre o quinto e o sexto espaço intercostal. Posicione ambos os segmentos de material de sutura antes de dar os nós para reduzir os riscos de hérnia do pulmão esquerdo. Dê nós no material de sutura para fazer dois pontos separados.Cole a pele sobre a incisão torácica. Remova o ar residual com o cateter angio e cole a incisão no pescoço conforme mostrado anteriormente. Desligue o isoflurano e administre 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina e 0,5 mililitros de solução salina normal por via subcutânea.Quando a respiração espontânea retornar, remova o tubo endotraqueal. Observe o camundongo até que este consiga andar. A capacidade de caminhar geralmente retorna alguns minutos após a remoção do tubo endotraqueal.Administre 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina por injeção intraperitoneal duas vezes ao dia durante três dias após a cirurgia. Monitore cuidadosamente o animal durante esses três dias e tenha cuidado para não abrir o local cirúrgico ao manipular os animais. Esta imagem mostra a perda de peso após a cirurgia.24 horas após a cirurgia, os camundongos submetidos à pneumonectomia perdem em média 1,5 grama e os camundongos submetidos ao procedimento simulado perdem em média 1,1 grama. Ambos os grupos recuperam seu peso pré-operatório até o terceiro dia pós-operatório. Esta imagem fluorescente mostra a coloração por imunofluorescência de tropoelastina no lobo acessório sob condições controle.Aqui, a imunofluorescência de tropoelastina do lobo acessório é mostrada 72 horas após o pneumotomia; os espaços aéreos existentes estão aumentados. Esta imagem final de imunofluorescência de TRO Elastina mostra o lobo acessório quatro semanas após a pneumotomia. Observe o crescimento do lobo e a reação.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o modelo de pneumonectomia em camundongo para estudar o crescimento pulmonar compensatório e como realizar a toracotomia simulada, que é usada como controle para este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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