Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

O objetivo geral do experimento a seguir é distinguir entre mRNAs altamente e mal traduzidos pela imobilização e separação de polirribossomos. Isso é conseguido primeiro adicionando cicloheide às células para inibir seu ribossomo, translocação e tradução de RNA. Como segunda etapa, os lisados das células tratadas são carregados em um gradiente de sacarose e ultracentrífuga para separar os polirribossomos armazenados de acordo com suas massas.

Em seguida, o gradiente é dividido em frações iguais para separar as transcrições altamente e mal traduzidas na etapa final. R-T-Q-P-C-R é usado para detectar a presença dos mRNAs de interesse dentro de cada fração. Em última análise, o perfil do ribossomo pode ser usado para detectar mudanças na tradução global e específica do mRNA em resposta a estresses fisiológicos e fisiopatológicos distintos.

O perfil PolyOne pode responder a perguntas-chave nos campos da biologia molecular e celular, como quais mRNAs são selecionados, traduzidos durante o estresse S e como isso permite que as células se adaptem a essas condições. Demonstrando este procedimento está a mãe Dar de um estudante de pós-graduação no laboratório Para usar um gradiente automatizado para preparar um gradiente de sacarose, comece ligando o gradiente e nivele a placa que manterá os gradientes quando a placa estiver nivelada. Clique em concluído.

Em seguida, para selecionar o programa de gradiente, abra o menu de graduação e selecione a lista. Clique em SW 41 e, em seguida, percorra a lista até que o programa de 10 a 50% de gradiente de 11 etapas esteja em view e pressione. Usar. Em seguida, coloque um tubo de ultracentrífuga cônico SW 41 no bloco marcador e use o marcador de tubo fino fornecido para traçar uma linha no tubo ao longo do degrau superior do bloco.

Coloque os tubos em um rack de encaixe em uma superfície estável e, em seguida, conecte as duas cânulas fornecidas a duas seringas de 10 mililitros. Pipet água destilada morna contendo RNAs em solução de ativação para cima e para baixo algumas vezes para lavar as seringas. Depois de remover todos os vestígios da água, encha uma das seringas com 10% de sacarose mais cicloureia e insira a cânula no fundo do tubo da ultracentrífuga.

Dispense suavemente a solução até que ela ultrapasse a marca feita no tubo. Tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, encha a outra seringa com 50% de sacarose mais cicloheide e limpe qualquer líquido extra do tubo com um lenço.

Use a cânula para inserir suavemente a solução de sacarose a 50% no tubo, parando quando a solução estiver nivelada com a marca e, em seguida, remova a cânula de forma rápida e suave. A solução de sacarose a 10% deve subir para formar o menisco na parte superior do tubo. Em seguida, incline ligeiramente o tubo da ultracentrífuga para deslocar quaisquer bolhas de ar e insira a tampa usando uma micropipeta para remover qualquer excesso de líquido no reservatório da tampa.

Coloque os tubos no gradiente e pressione o botão de execução. Observe que a placa se inclinará no ângulo especificado. Faça uma pausa de cinco segundos e, em seguida, as rotações para formar o gradiente começarão.

Após cerca de dois minutos, a máquina emitirá um bipe indicando que a formação do gradiente está completa. Transfira suavemente os tubos para um rack e remova rapidamente as tampas no movimento ascendente para evitar perturbar o gradiente. Em seguida, carregue suavemente 260 unidades de lisado celular previamente preparado em cada gradiente de sacarose e gire os tubos por uma hora e meia a 260, 343 vezes G e quatro graus Celsius em uma ultracentrífuga.

Para configurar o instrumento do sistema de fracionamento de gradiente, comece ligando o espectrofotômetro. Em seguida, escolha o ícone da pasta duas vezes e, em seguida, a seta de retorno duas vezes para retornar à tela inicial e definir o coletor de frações para o método PolyZone para garantir que a válvula no coletor de frações esteja definida como desperdiçada. Clique na seta apontando para o ícone da lixeira e, em seguida, coloque um balão MIA de 250 mililitros contendo água destilada sob o tubo de coleta de resíduos.

Agora selecione as seguintes configurações no gravador gráfico: o dial de sensibilidade para definir lamp e óptica o filtro de ruído. Mude para 1,5 o mostrador do separador de pico para fora da velocidade do gráfico, disque para 30 centímetros por hora e a linha de base e ajuste o mostrador na parte superior da unidade do espectrofotômetro para abertura máxima. Em seguida, coloque a seringa e o cilindro na bomba e use os parafusos fornecidos e Alan Key para apertá-lo no lugar.

Use o comando rev em alta velocidade para encher a seringa com solução chase. Em seguida, coloque a bomba na posição vertical e use o comando de avanço para perseguir o ar através da tubulação. Em seguida, instale um tubo de ultracentrífuga cheio de água livre de RNAs no suporte e, em seguida, perfure o tubo com a cânula até que as duas marcas pretas sejam visíveis.

O orifício de distribuição está entre as duas marcas. Inicie a bomba da seringa no manual de encaminhamento a 6.0 mililitros por minuto. Quando a solução de perseguição encher um terço do tubo, mude para a velocidade para variável com uma vazão de 1,0 mililitros por minuto.

Agora gire o botão de ajuste da linha de base no espectrofotômetro até que a tensão no gráfico esteja em zero. A água começará a sair do tubo de resíduos para o frasco el Mya. Em seguida, defina a sensibilidade desejada para 1,0 UA.

Quando a sensibilidade tiver sido ajustada, pressione o botão também de linha de base e gire o dial de deslocamento do gravador para ajustar a configuração de linha de base para a marca de 10% no gravador gráfico. Então, uma vez que a linha de base estável seja alcançada, gire o interruptor da bomba e a discagem rápida do gráfico para desligar. Assim que a bomba estiver desligada, coloque-a na posição de rotação para recuperar a solução de perseguição até atingir a primeira marca na cânula de perfuração.

Em seguida, remova o tubo da centrífuga, disperse quaisquer bolhas na cânula com um pouco de solução de perseguição e limpe qualquer água residual que possa ter vazado da célula de fluxo para fracionar o gradiente. Em seguida, instale o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose no suporte e perfure o tubo com a cânula. Em seguida, coloque dez tubos de microcentrífuga de dois mililitros nas posições da bandeja coletora de frações de dois a 11 e um tubo de cintura na posição um de forma que as tampas não se projetem para cima.

Ajuste o botão de controle da bomba para manual e a vazão na bomba de seringa para 6.0 mililitros por minuto. Em seguida, pressione play no coletor de frações assim que o braço atingir o primeiro tubo. Pressione o botão de pausa para posicionar o braço e abrir a válvula de distribuição de frações.

Em seguida, use o comando forward para iniciar a bomba e monitorar a caneta do registrador gráfico. Quando a caneta começar a desviar para cima, indicando que a amostra está passando pela célula de fluxo, substitua rapidamente o tubo de resíduos pelo tubo número um. Então, quando a primeira gota for coletada, alterne rapidamente os comandos para partida remota, parada e variável de 1,0 mililitros por minuto e pressione play para permitir que a interface do coletor de frações colete frações de um mililitro a cada minuto.

Finalmente, depois que a solução de perseguição azul entrar no último tubo, pressione parar. O perfil PolyZone é uma técnica chave para demonstrar o envolvimento específico do PD CD4 na tradução mediada por IRAs. Por exemplo, neste experimento, as células HEC 2 93 foram transfectadas transitoriamente para esgotar os níveis endógenos de PDC D quatro e, em seguida, submetidas à análise do perfil PolyZone.

A redução dos níveis de PDC D quatro não prejudicou a tradução global do gene, a julgar pela falta de alterações no perfil PolyZone. Ao comparar o controle SI e o IPD CD quatro células tratadas, a distribuição polissômica semelhante de uma variante não IRAs de XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas. Em contraste, a distribuição polissômica dos dois IS que abrigam mRNAs XIAP e BCL XL foi significativamente alterada.

Na ausência de PD CD4, a distribuição desses dois mRNAs foi deslocada para ribossomos pesados. Uma vez que isso não é acompanhado por mudanças nos níveis de estado estacionário de mRNA de XIAP e BCL XL, esses resultados demonstram a tradução aprimorada de XIAP e BCL XL em células com níveis reduzidos de PDC D quatro, conforme confirmado pelo florescimento ocidental. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como medir a tradução do mRNA preparando a região da sacarose e separando o polissomo por ultracentrifugação.