Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

O objetivo geral do experimento a seguir é distinguir entre RNAs mensageiros altamente e pouco traduzidos por meio da imobilização e separação de polirribossomos. Isso é alcançado primeiramente pela adição de cicloheximida às células para inibir a translocação dos ribossomos e a tradução do RNA. Como segundo passo, lisados das células tratadas são carregados em um gradiente de sacarose e ultracentrifugados para separar os polirribossomos armazenados de acordo com suas massas.

Em seguida, o gradiente é dividido em frações iguais para separar os transcritos altamente e pouco traduzidos na etapa final. A técnica R-T-Q-P-C-R é utilizada para detectar a presença dos RNAm de interesse em cada fração. Em última análise, o perfilamento de ribossomos pode ser empregado para detectar alterações na tradução global, bem como na tradução específica de RNAm em resposta a estresses fisiológicos e patofisiológicos distintos.

O perfilamento PolyOne pode responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia molecular e celular, como quais RNAm são selecionados e traduzidos durante o estresse por S, e como isso permite que as células se adaptem a essas condições. Para demonstrar este procedimento, a mãe de um estudante de pós-graduação no laboratório utiliza um gradientador automatizado para preparar um gradiente de sacarose; comece ligando o gradientador e nivelando a placa que irá conter os gradientes; quando a placa estiver nivelada, clique em concluído.

Em seguida, para selecionar o programa de gradiente, abra o menu grad e selecione lista. Clique em SW 41 e, em seguida, percorra a lista até que o programa de gradiente de 10 a 50% com 11 etapas esteja visível e pressione Usar. Em seguida, coloque um tubo cônico de ultracentrífuga SW 41 no bloco marcador e use o marcador fino para tubos fornecido para traçar uma linha no tubo ao longo do degrau superior do bloco.

Coloque os tubos em um suporte apropriado sobre uma superfície estável e, em seguida, fixe as duas cânulas fornecidas a duas seringas de 10 mililitros. Pipete água destilada morna contendo RNAs na solução de ativação para cima e para baixo algumas vezes para lavar as seringas. Em seguida, após remover todos os vestígios da água, encha uma das seringas com sacarose 10% mais cyclo heide e insira a cânula na parte inferior do tubo de ultracentrifugação.

Dispense suavemente a solução até que ela ultrapasse ligeiramente a marca feita no tubo. Tendo o cuidado de evitar bolhas. Em seguida, encha a outra seringa com sacarose 50% mais ciclo-heide e remova qualquer líquido adicional do tubo com um lenço.

Use a cânula para inserir suavemente a solução de sacarose a 50% no tubo, parando quando a solução atingir o nível da marca e, em seguida, remova rapidamente e suavemente a cânula. A solução de sacarose a 10% deve subir, formando um menisco na parte superior do tubo. Em seguida, incline levemente o tubo de ultracentrífuga para deslocar quaisquer bolhas de ar e insira a tampa usando uma micropipeta para remover qualquer líquido em excesso no reservatório da tampa.

Coloque os tubos no gerador de gradiente e, em seguida, pressione o botão de execução. Observe que a placa irá inclinar no ângulo especificado. Pausa por cinco segundos, e então as rotações para formar o gradiente serão iniciadas.

Após cerca de dois minutos, a máquina emitirá um sinal sonoro indicando que a formação do gradiente está completa. Transfira cuidadosamente os tubos para um suporte e remova rapidamente as tampas em um único movimento ascendente para evitar perturbar o gradiente. Em seguida, carregue suavemente 260 unidades de A260 de lisado celular previamente preparado em cada gradiente de sacarose e centrifugue os tubos por uma hora e meia a 260.343 × g e 4 °C em uma ultracentrífuga.

Para configurar o instrumento do sistema de fracionamento em gradiente, comece ligando o espectrofotômetro. Em seguida, clique duas vezes no ícone de pasta e depois duas vezes na seta de retorno para voltar à tela inicial e configurar o coletor de frações no método PolyZone, garantindo que a válvula do coletor de frações esteja direcionada para o descarte. Clique na seta apontando para o ícone da lixeira e, então, posicione um frasco MIA de 250 mililitros contendo água destilada sob o tubo de coleta de resíduos.

Agora selecione as seguintes configurações no registrador de gráficos: o seletor de sensibilidade para ajustar a lâmpada e a óptica, o filtro de ruído. Alterne para 1,5 o seletor de separação de picos para desligado, a velocidade do gráfico, o seletor para 30 centímetros por hora e a linha de base e ajuste o seletor na parte superior da unidade de espectrofotômetro para abertura máxima. Em seguida, coloque a seringa e o cilindro na bomba e use os parafusos e a chave Allen fornecidos para apertá-los firmemente no lugar.

Use o comando rev em alta velocidade para preencher a seringa com a solução de remoção. Em seguida, coloque a bomba na posição vertical e use o comando forward para expelir o ar através da tubulação. A seguir, instale um tubo de ultracentrífuga preenchido com água livre de RNAses no suporte e, então, perfure o tubo com a cânula até que as duas marcas pretas fiquem visíveis.

O orifício de dispensação está entre as duas marcas. Inicie a bomba de seringa no modo manual direto a 6,0 mililitros por minuto. Quando a solução de chasing preencher um terço do tubo, mude para a velocidade variável com uma taxa de fluxo de 1,0 mililitro por minuto.

Agora, gire o botão de ajuste da linha de base no espectrofotômetro até que a voltagem no gráfico esteja em zero. A água começará a sair pelo tubo de descarte em direção ao frasco el Mya. Em seguida, ajuste a sensibilidade desejada para 1,0 au.

Quando a sensibilidade tiver sido ajustada, pressione o botão de linha de base e gire o botão de deslocamento do registrador para ajustar a configuração da linha de base até a marca de 10% no registrador de gráficos. Em seguida, após alcançar uma linha de base estável, desligue a chave da bomba e o seletor de velocidade do gráfico. Assim que a bomba estiver desligada, mude-a para a posição rev para recuperar a solução de rastreamento até que atinja a primeira marca na cânula perfurante.

Em seguida, remova o tubo de centrífuga, dissipe as bolhas na cânula com um pouco da solução de lavagem e remova qualquer resíduo de água que possa ter vazado da célula de fluxo para fracionar o gradiente. A seguir, instale o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose no suporte e perfure o tubo com a cânula. Depois, coloque dez tubos microcentrífuga de dois mililitros nas posições de dois a 11 da bandeja do coletor de frações e um tubo de descarte na posição um, de modo que as tampas não fiquem voltadas para cima.

Defina o seletor de controle da bomba na posição manual e ajuste a taxa de fluxo na bomba de seringa para 6,0 mililitros por minuto. Em seguida, pressione reproduzir no coletor de frações assim que o braço atingir o primeiro tubo. Pressione o botão de pausa para posicionar o braço e abrir a válvula de dispensação de frações.

Em seguida, use o comando de avanço para iniciar a bomba e monitorar a caneta do registrador gráfico. Quando a caneta começar a se deslocar para cima, indicando que a amostra está passando pela cela de fluxo, substitua rapidamente o tubo de descarte pelo tubo número um. Quando a primeira gota for coletada, troque rapidamente os comandos para início remoto, parada e volume variável de 1,0 mililitro por minuto e pressione reproduzir para permitir que a interface do coletor de frações colete frações de um mililitro a cada minuto.

Por fim, após a solução azul de chasing entrar no último tubo, pressione parar. O perfilamento PolyZone é uma técnica fundamental para demonstrar o envolvimento específico do PD CD4 na tradução mediada por IRAs. Por exemplo, neste experimento, células HEC 2 93 foram transfectadas temporariamente para esgotar os níveis endógenos de PDC D quatro e, em seguida, submetidas à análise de perfilamento PolyZone.

A redução dos níveis de PDC D quatro não prejudicou a tradução global do gene, conforme indicado pela ausência de alterações no perfil do PolyZone. Ao comparar as células controle de SI e as células tratadas com IPD CD quatro, a distribuição de polissomos de uma variante não IRAs do XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas. Em contraste, a distribuição de polissomos dos dois RNAs mensageiros que abrigam IS, XIAP e BCL XL, foi significativamente alterada.

Na ausência de PD CD4, a distribuição desses dois RNAm foi deslocada para ribossomos pesados. Como isso não é acompanhado por alterações nos níveis de estado estacionário dos RNAm XIAP e BCL XL, esses resultados demonstram a tradução aumentada de XIAP e BCL XL em células com níveis reduzidos de PDC D quatro, conforme confirmado adicionalmente por Western blossoming. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a tradução de RNAm mediante o preparo da região de sacarose e a separação de polissomos por ultracentrifugação.