Name: Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a distinguir mRNAs altamente e pouco traduzidos em células de mamíferos usando perfilamento de polissomos com gradiente de sacarose e ultracentrifugação. Este método identifica tradução seletiva sob estresse.

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Somos gratos aos membros anteriores e atuais do laboratório, em particular Urszula Liwak, pela discussão crítica sobre protocolos de perfil de polissomos e compartilhamento de dados. Este trabalho foi apoiado por subsídios operacionais dos institutos canadenses de pesquisa em saúde, da Sociedade de Pesquisa do Câncer e do Conselho Nacional de Pesquisa em Ciência e Engenharia do Canadá para o MH. O MDF foi apoiado pelo Prêmio de Doutorado Vanier Canada Graduate Scholarship e pela Ontario Graduate Scholarship, e este trabalho faz parte de seu Ph.D. dissertação.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Perfilamento polissomal é uma técnica poderosa que permite a quantificação do estado da tradução de transcritos específicos sob diferentes condições de tratamento. É uma técnica muito simples, em princípio, no entanto, requer várias etapas de execução, alguns dos quais são críticos para produzir bons perfis de polissomas. Estes passos principais são: 1) uso de produtos químicos RNase e de plástico, 2) a preparar bons gradientes de sacarose (em nossa experiência de 10-50% gradientes de sacarose funcionar melhor para resolver de forma eficiente 40 / 60S subunidades e mRNAs com ribossomos ligadas), e 3 ) utilizando células que estão em crescimento exponencial e não confluentes mais do que 80%, a fim de capturar as maiores taxas de tradução. Este último passo deve ser tomado em consideração quando se faz tratamentos celulares longos, tais como o knockdown ou a sobre-expressão do gene, de modo que a quantidade de células a placa será uma função da quantidade de células vão ser confluentes no final do estudo. Nos resultados da presented aqui, polissoma análise do perfil era uma ferramenta importante para avaliar o papel de PDCD4 na regulação tradução dos IRES-abrigando mRNAs XIAP e Bcl-xL 12. O fato de que nós não observamos qualquer mudança nos perfis gerais polissomas sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitiu-nos concluir que PDCD4 não prejudicou tradução celular mundial nas condições do experimento. A seguir, utilizaram a análise de RT-qPCR para determinar a distribuição do XIAP e Bcl-xL ARNm em células tratadas com PDCD4 ou siRNAs de controlo. qPCR é um método de escolha para a análise de perfis de polissomas, em oposição ao padrão de RT-PCR ou Northern blotting, uma vez que permite uma análise quantitativa ao invés de semi-quantitativa da distribuição de ARNm e para a detecção de mudanças subtis na eficiência de translação entre os tratamentos. Usando esta técnica, fomos capazes de mostrar que a distribuição dos XIAP e Bcl-xL mRNAs (expresso como uma percentagem do total de mRNA-alvo em todo o gradient) foi significativamente deslocado para polirribossomas pesados ​​(mRNAs com um grande número de ribossomas associados com eles) após PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando, assim, um aumento na tradução destes mRNAs. Isto foi ainda confirmado por um aumento em XIAP e Bcl-xL, mas os níveis de proteína não nos seus níveis de ARN de estado estacionário (Figura 1F, G). É importante notar que a distribuição de polissoma a variante não-IRES de XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em alternativa, a eficiência de translação pode ser apresentada como uma proporção do teor de ARNm em polissomas (geralmente fracções 5 a 10) contra monosomes (geralmente frações 2-4) 14. O uso de controles durante todo o protocolo é importante para validar qualquer polissoma perfis resultado, como picos observados a partir de leituras de absorbância a 254 nm não pode em seu próprio ser atribuído ao RNA ribossomal (detergentes, tal como Triton X-100 absorvem fortemente nesta regi do espectro e pode obscurecer 40 / 60S picos no topo do gradiente). Gradientes em branco sem ligado e / ou com tampão de lisado precisa ser executado para determinar a contribuição relativa dos buffers para a absorvância a 254 nm. Artefactual estruturas de ordem superior também pode levar a interpretações errôneas dos polissomos onde há de fato nenhum (por exemplo, &quot;pseudo-polissomos&quot; 20). Sequestrar de magnésio (usado durante todo o procedimento para estabilizar ribossomas 80S) com o catião bivalente quelante EDTA adicionado ao lisados ​​e para o buffer de gradiente (20 mM durante 15 min) vai provocar a separação do ribossoma nos seus componentes pequenos (40S) e grandes (60S subunidades). Assim, se os picos de absorvância registados a 260 nm polissomas são, de facto, o tratamento com EDTA vai entrar em colapso o perfil de tal modo que uma única máxima vai ser observada perto do topo do gradiente que corresponde a libertar o ARNm e unidades ribossomais (dados não mostrados). Coincidentecom colapso induzido pelo EDTA do perfil, todos os alvos específicos analisados ​​por qPCR agora deve ser encontrada no topo do gradiente. O número de ribossomas associados a um ARNm não é sempre um indicador de quão eficiente de ARNm em particular que está a ser traduzida. Na verdade, existem contextos específicos em que a tradução se torna ativo em polissomos paralisadas 21,22 que o leitor deve estar ciente. Determinar se ou não transcritos estão activamente envolvidos com a maquinaria de tradução pode ser realizado por a) tratar a amostra com puromicina, que ao contrário de EDTA, faz com que &quot;run-off &#39;de ribossomas que estão activamente a translocação através de um mRNA, ou b) o tratamento da amostra com homoharringtonina que inibe a translocação de apenas a primeira ribossoma no codão de iniciação, de novo causando &#39;off-correr &quot;de quaisquer ribossomas translocar a jusante. O uso dos transcritos de controlo para análise qPCR também é crítico. A selecção de transcritos que não são afectados pelas diferentes condições de tratamento, tais como alguns genes de manutenção (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribossómicos, RPL13A (18S) ou, neste caso, a variante não-IRES do IRES de XIAP, é importante na verificar se o efeito do tratamento sobre a tradução é específica ou generalizada. Estes transcritos de controlo pode ser utilizado para normalizar a distribuição dos mRNAs analisada como foi feito aqui (XIAP e Bcl-xL mRNAs foram normalizadas para GAPDH mRNA e expresso como uma percentagem do conteúdo total de ARNm representado pela soma do teor de ARNm em cada fracção ) ou, alternativamente, os ARNm alvo e de controlo podem ser expressos como valores absolutos e mostrada separadamente. análise qPCR dos lisados ​​de entrada (geralmente 10% do volume total) é uma outra etapa que vai controlar a distribuição de mRNAs específicos. Idealmente, o conteúdo de um transcrito de ARNm específico no lisado de entrada deve ser comparável à soma do teor de ARNm em todas as 10 fracções analisadas. Finalmente, Um passo opcional para controlar o fenol: clorofórmio passo de extracção é a espiga cada fracção com um ARNm de polissoma repórter transcrito in vitro (tal como CAT, cloranfenicol acetil-transferase) que irá ser subsequentemente quantificados por qPCR e pode até mesmo ser utilizados para normalizar o dados 14. Como acontece com qualquer técnica, o profiling polissoma apresenta algumas limitações. O facto de normalmente um mínimo de 10 fracções (turnos de mais subtis em termos de eficiência de tradução podem exigir 20 ou mais) precisam de ser recolhido, a fim de ter distribuições de polissomas agradáveis ​​torna este passo limitante, no sentido de que apenas um máximo de 4 amostras pode ser analisados ​​de cada vez para ser capaz de lidar confortavelmente extracção de ARN e análise de qPCR de 40 amostras e os controlos de entrada 4 ao mesmo tempo. O tamanho da amostra pode facilmente adicionar até com quantos transcrições devem ser analisados ​​e quantos qPCR replica para fazer, e isso pode ser caro. Outra limitação de um polissomal profiling uma base-qPCRnálise é que ela só pode ser feito em uma abordagem baseada no candidato (onde os transcritos para serem analisados ​​são conhecidos de antemão) e não pode ser aplicado para a análise de todo o genoma de tradução. No entanto, no início do século 21, os investigadores começaram a interrogar o seu RNA polissomal em nível genômico usando DNA microarrays 15 e, mais recentemente, com a próxima geração de sequenciamento 16,17. Nesta abordagem poderosa, perfilamento polissomal é realizado como descrito no presente protocolo, excepto que em vez de efectuar a análise de qPCR de fracções individuais, monosomes fracções (geralmente de fracções 2-4) e polissomas fracções (normalmente fracções) são reunidas em conjunto e variações globais na tradução analisados por microarray de DNA ou todo o genoma RNA seqüenciamento. Assim, com esta abordagem, é possível avaliar todos os mRNAs cuja distribuição turnos de polissomos para monosomes (diminuição na tradução), ou vice-versa (aumento na tradução) após um tratamento específicomento. Validação e quantificação de ARNm específico polissomas distribuição pode, então, ser feito por qPCR. Um uso ainda mais poderoso do princípio da polissomal perfil é profiling ribossomo. Nova prorrogação alto rendimento desta técnica foi relatado recentemente que permite o monitoramento simultâneo de centenas de polissomas frações 23. Isso proporciona uma clara vantagem quando sondagem eficiência de translação de coleções mutantes ou em telas de RNAi em larga escala. Profiling ribossomo é uma técnica que aproveita a próxima geração de sequenciamento para mapear fragmentos de RNA protegidas por ribossomos (pegadas ribossomo) envolvidos na síntese de proteínas 24,25. Nesta técnica, a translocação do ribossoma pode ser inibida com ciclo-heximida (reversíveis) ou emetina (irreversível), seguida por lise celular e digestão de RNase para produzir uma população de pegadas ao ribossoma. Os ribossomas são enriquecidos, o ARN total é isolado, e contaminando ribossomal e RNA ribossomal mitocondrial é removido.Pegadas de RNA de aproximadamente 26-28 nucleotídeos são isolados, transcrição reversa, convertida em uma biblioteca de cDNA e seqüenciados 26. Ao contrário de perfis polissoma padrão, esta abordagem não só identifica mRNAs específicos que são regulados em translação, mas também fornece informações mRNA específico da resolução no códon tais como a ocupação exata e densidade dos ribossomos ao longo de uma transcrição específica. Isto é particularmente interessante para mRNAs com modos específicos de tradução, como mRNAs IRES-abrigam, como poderia dar mais informações sobre onde na transcrição ribossomo-recruitment está ocorrendo.

Regulação da síntese de proteína (tradução) é um processo celular fundamental que está intimamente ligada à sobrevivência celular. Dado que a tradução consome mais de 50% da energia da célula, não é de estranhar que a tradução é rigidamente controlado e que as perturbações na tradução não são bem tolerados. Por outro lado, muitos processos celulares aberrantes que requerem maquinaria de tradução e a saída da tradução (isto é, proteoma) tem de ser modificado. Este é frequentemente o caso em vários estados de resposta ao estresse e doenças, e é provavelmente o melhor exemplificado no câncer. Uma vantagem chave do controlo translacional é a capacidade das células para reprogramar a saída rápida de proteína em resposta a vários disparadores internos e externos, assim mecanismo de ajuste fino que inclina o equilíbrio entre morte celular e sobrevivência 1. Dois aspectos do controle de translação são particularmente interessantes; compreensão da natureza do mec regulamentarhanism (s) e elementos de controlo que permitem a tradução específico, bem como a identificação de mRNAs específicos e seus produtos proteicos que participam na resposta celular ao gatilho particular, que provocou a tradução selectiva em primeiro lugar. Perfilamento polissoma é uma técnica que permite o estudo eficaz de ambos os processos. O objetivo geral da técnica polissoma profiling é estudar e quantificar o estado de tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. O princípio da técnica é capturar tradução do mRNA por &#39;&#39; congelar &#39;&#39; traduzindo ativamente ribossomos em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos (ligado por vários ribossomos) e os mal traduzido (ligado por um ou dois ribossomos). Neste protocolo particular, o antibiótico ciclo-heximida que se liga ao60S da subunidade ribossômica e bloqueia a liberação de desacetilados tRNA do local E ribossomo 2, é usado para inibir a translocação ribossomo e parar ribossomos em mRNAs de tradução. No entanto, outros agentes bloqueadores, tais como emetina, que também bloqueia a tradução de alongamento 3, podem ser utilizados. Ao contrário da transferência western e 35 S-metionina técnicas de marcação que medem a saída final do processo de tradução, polissoma caracterização tem a vantagem de medir ribossomas associação com mRNAs activamente-traduzidas, permitindo, assim, para um estudo mais detalhado de mecanismos de tradução sob diferentes condições. Assim, a técnica pode ser facilmente adaptado especificamente para estudar a diferentes modos de tradução 4-6, factores de proteínas envolvidas na regulação de tradução 7-9, condições de stress que afectam a síntese de proteínas 1,10,11 ou os efeitos de estruturas de ARNm tais como IRES ou a montante quadros de leitura abertos no sintetizador de proteínasesis 12-14. Hoje em dia, polissomas aplicações de perfil são ainda mais ampla com o uso de microarranjos de DNA de 15 ou de próxima geração seqüenciamento 16,17 analisar polissomos-mRNAs associados.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 máquina de gradiente automatizada</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow máquina de gradiente de duas câmaras</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modelo # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Fracionador de gradiente de densidade</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composto por: sistema de perfuração de tubo,&nbsp; bomba peristáltica, Detector UA-6 com filtros de 254 e 280 nm e Coletor de Frações Foxy R1</td></tr><tr><td>WinDaq software de aquisição de dados</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmTubos de ultracentrífuga Pollyallomer (para SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 2 ml sem nuclease (nariz de golfinho)</td><td>Tubos</td> de centrífuga de 2 ml sem nuclease <td>DiaMed PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>(fundo plano)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose (sem nucleases)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Ressuspender em DMSO e manter a -80C para sotrage de longo prazo. Cuidado: TÓXICO! Pode causar tratos respiratórios e irritação da pele. Use máscara ao pesar.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (sem nucleases)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (sem nucleases)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (sem nucleases)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Cuidado: TÓXICO! Pode causar tratos respiratórios e irritação da pele</td></tr><tr><td>Inibidor de ribonuclease RNasin recombinante</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solução de inativação de Rnase</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-fenol:Clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Cuidado: TÓXICO! Pode causar irritação do trato respiratório, bem como irritação e corrosão da pele</td></tr></tbody></table>

avaliação da seletiva mrna tradução em células de mamíferos por polissoma profiling

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulação da síntese de proteínas representa um ponto de controlo chave na resposta celular ao stress. Em particular, os elementos reguladores discreta de RNA foram mostrados para permitir a tradução de mRNAs específicos selectiva, que tipicamente codificam para as proteínas necessárias para uma resposta de stress particular. A identificação destes mRNAs, bem como a caracterização dos mecanismos reguladores responsáveis ​​pela tradução selectiva tem sido na vanguarda da biologia molecular, por algum tempo. Perfilamento polissoma é um método fundamental nestes estudos. O objetivo do polissoma profiling é capturar tradução do mRNA imobilizando ribossomos traduzindo ativamente em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos e aqueles mal traduzidas. Estes podem então ser ainda caracterizada por métodos tradicionais de biologia molecular e bioquímica. Importante, combinando polysome perfis com abordagens genómicas alto rendimento permite uma análise em larga escala de regulação de translação.

Descrevemos recentemente um novo papel para o supressor de tumor PDCD4 como um inibidor selectivo de tradução de mRNAs que codificam inibidores apoptóticos XIAP e Bcl-xL 12 IRES-abrigando. Perfilamento polissoma foi uma técnica chave para demonstrar o envolvimento específico de PDCD4 na tradução IRES-mediada. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente para esgotar os níveis endógenos de PDCD4 (Figura 1A) e, em seguida, submetido a análise do perfil de polissoma. Observou-se que a redução dos níveis de PDCD4 não prejudicou tradução celular global, a julgar pela falta de mudanças no perfil polissoma quando comparando siCTRL e siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). De modo semelhante, a distribuição de polissoma variante não-IRES de XIAP 19 permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em contraste, polissoma distribuição dos mRNAs dois IRES-albergando, XIAP e Bcl-xL, foi significativamente alterada. Na ausência de PDCD4 a distribuição destes dois mRNAs é deslocada para dentro ribopolysomes pesados ​​(Figura 1D, E). Uma vez que este não é acompanhada por alterações nos níveis de estado estacionário de XIAP e Bcl-xL de mRNA (Figura 1F), estes resultados demonstram tradução de XIAP e Bcl-xL reforçada em células com níveis PDCD4 reduzidas, que foi posteriormente confirmada por Western blot (Figura 1G). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Perfilamento polissoma identifica PDCD4 como inibidor selectivo de XIAP e Bcl-xL tradução (A) HEK293 células foram tratadas com siRNA PDCD4 ou controlo (CTRL), não-alvo siRNA, lisadas e sujeitas a análise de Western blot com anti-PDCD4 e anticorpos anti-nucleolina para verificar a extensão da PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 foi derrubado como em (A) eOs lisados ​​celulares foram sujeitos a polissoma perfilamento. Polissoma perfil representativo é mostrado no painel de topo; a distribuição de XIAP não-IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) em relação ao ARNm que de GAPDH é mostrada como a percentagem de ARNm total (ARNm%) em cada fracção. (F) Firme Os níveis de ARNm -State foram medidas por RT-qPCR em PDCD4 siRNA ou de controlo (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Os lisados ​​a partir de (A) foram também submetidas à análise de Western blot com anti-XIAP, anti-Bcl-x, e Os anticorpos anti-nucleolina. (NB. Os dados apresentados na Figura 1 foram originalmente publicado em 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

O objetivo geral do experimento a seguir é distinguir entre RNAs mensageiros altamente e pouco traduzidos por meio da imobilização e separação de polirribossomos. Isso é alcançado primeiramente pela adição de cicloheximida às células para inibir a translocação dos ribossomos e a tradução do RNA. Como segundo passo, lisados das células tratadas são carregados em um gradiente de sacarose e ultracentrifugados para separar os polirribossomos armazenados de acordo com suas massas.Em seguida, o gradiente é dividido em frações iguais para separar os transcritos altamente e pouco traduzidos na etapa final. A técnica R-T-Q-P-C-R é utilizada para detectar a presença dos RNAm de interesse em cada fração. Em última análise, o perfilamento de ribossomos pode ser empregado para detectar alterações na tradução global, bem como na tradução específica de RNAm em resposta a estresses fisiológicos e patofisiológicos distintos.O perfilamento PolyOne pode responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia molecular e celular, como quais RNAm são selecionados e traduzidos durante o estresse por S, e como isso permite que as células se adaptem a essas condições. Para demonstrar este procedimento, a mãe de um estudante de pós-graduação no laboratório utiliza um gradientador automatizado para preparar um gradiente de sacarose; comece ligando o gradientador e nivelando a placa que irá conter os gradientes; quando a placa estiver nivelada, clique em concluído.Em seguida, para selecionar o programa de gradiente, abra o menu grad e selecione lista. Clique em SW 41 e, em seguida, percorra a lista até que o programa de gradiente de 10 a 50% com 11 etapas esteja visível e pressione Usar. Em seguida, coloque um tubo cônico de ultracentrífuga SW 41 no bloco marcador e use o marcador fino para tubos fornecido para traçar uma linha no tubo ao longo do degrau superior do bloco.Coloque os tubos em um suporte apropriado sobre uma superfície estável e, em seguida, fixe as duas cânulas fornecidas a duas seringas de 10 mililitros. Pipete água destilada morna contendo RNAs na solução de ativação para cima e para baixo algumas vezes para lavar as seringas. Em seguida, após remover todos os vestígios da água, encha uma das seringas com sacarose 10% mais cyclo heide e insira a cânula na parte inferior do tubo de ultracentrifugação.Dispense suavemente a solução até que ela ultrapasse ligeiramente a marca feita no tubo. Tendo o cuidado de evitar bolhas. Em seguida, encha a outra seringa com sacarose 50% mais ciclo-heide e remova qualquer líquido adicional do tubo com um lenço.Use a cânula para inserir suavemente a solução de sacarose a 50% no tubo, parando quando a solução atingir o nível da marca e, em seguida, remova rapidamente e suavemente a cânula. A solução de sacarose a 10% deve subir, formando um menisco na parte superior do tubo. Em seguida, incline levemente o tubo de ultracentrífuga para deslocar quaisquer bolhas de ar e insira a tampa usando uma micropipeta para remover qualquer líquido em excesso no reservatório da tampa.Coloque os tubos no gerador de gradiente e, em seguida, pressione o botão de execução. Observe que a placa irá inclinar no ângulo especificado. Pausa por cinco segundos, e então as rotações para formar o gradiente serão iniciadas.Após cerca de dois minutos, a máquina emitirá um sinal sonoro indicando que a formação do gradiente está completa. Transfira cuidadosamente os tubos para um suporte e remova rapidamente as tampas em um único movimento ascendente para evitar perturbar o gradiente. Em seguida, carregue suavemente 260 unidades de A260 de lisado celular previamente preparado em cada gradiente de sacarose e centrifugue os tubos por uma hora e meia a 260.343 × g e 4 °C em uma ultracentrífuga.Para configurar o instrumento do sistema de fracionamento em gradiente, comece ligando o espectrofotômetro. Em seguida, clique duas vezes no ícone de pasta e depois duas vezes na seta de retorno para voltar à tela inicial e configurar o coletor de frações no método PolyZone, garantindo que a válvula do coletor de frações esteja direcionada para o descarte. Clique na seta apontando para o ícone da lixeira e, então, posicione um frasco MIA de 250 mililitros contendo água destilada sob o tubo de coleta de resíduos.Agora selecione as seguintes configurações no registrador de gráficos: o seletor de sensibilidade para ajustar a lâmpada e a óptica, o filtro de ruído. Alterne para 1,5 o seletor de separação de picos para desligado, a velocidade do gráfico, o seletor para 30 centímetros por hora e a linha de base e ajuste o seletor na parte superior da unidade de espectrofotômetro para abertura máxima. Em seguida, coloque a seringa e o cilindro na bomba e use os parafusos e a chave Allen fornecidos para apertá-los firmemente no lugar.Use o comando rev em alta velocidade para preencher a seringa com a solução de remoção. Em seguida, coloque a bomba na posição vertical e use o comando forward para expelir o ar através da tubulação. A seguir, instale um tubo de ultracentrífuga preenchido com água livre de RNAses no suporte e, então, perfure o tubo com a cânula até que as duas marcas pretas fiquem visíveis.O orifício de dispensação está entre as duas marcas. Inicie a bomba de seringa no modo manual direto a 6,0 mililitros por minuto. Quando a solução de chasing preencher um terço do tubo, mude para a velocidade variável com uma taxa de fluxo de 1,0 mililitro por minuto.Agora, gire o botão de ajuste da linha de base no espectrofotômetro até que a voltagem no gráfico esteja em zero. A água começará a sair pelo tubo de descarte em direção ao frasco el Mya. Em seguida, ajuste a sensibilidade desejada para 1,0 au.Quando a sensibilidade tiver sido ajustada, pressione o botão de linha de base e gire o botão de deslocamento do registrador para ajustar a configuração da linha de base até a marca de 10% no registrador de gráficos. Em seguida, após alcançar uma linha de base estável, desligue a chave da bomba e o seletor de velocidade do gráfico. Assim que a bomba estiver desligada, mude-a para a posição rev para recuperar a solução de rastreamento até que atinja a primeira marca na cânula perfurante.Em seguida, remova o tubo de centrífuga, dissipe as bolhas na cânula com um pouco da solução de lavagem e remova qualquer resíduo de água que possa ter vazado da célula de fluxo para fracionar o gradiente. A seguir, instale o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose no suporte e perfure o tubo com a cânula. Depois, coloque dez tubos microcentrífuga de dois mililitros nas posições de dois a 11 da bandeja do coletor de frações e um tubo de descarte na posição um, de modo que as tampas não fiquem voltadas para cima.Defina o seletor de controle da bomba na posição manual e ajuste a taxa de fluxo na bomba de seringa para 6,0 mililitros por minuto. Em seguida, pressione reproduzir no coletor de frações assim que o braço atingir o primeiro tubo. Pressione o botão de pausa para posicionar o braço e abrir a válvula de dispensação de frações.Em seguida, use o comando de avanço para iniciar a bomba e monitorar a caneta do registrador gráfico. Quando a caneta começar a se deslocar para cima, indicando que a amostra está passando pela cela de fluxo, substitua rapidamente o tubo de descarte pelo tubo número um. Quando a primeira gota for coletada, troque rapidamente os comandos para início remoto, parada e volume variável de 1,0 mililitro por minuto e pressione reproduzir para permitir que a interface do coletor de frações colete frações de um mililitro a cada minuto.Por fim, após a solução azul de chasing entrar no último tubo, pressione parar. O perfilamento PolyZone é uma técnica fundamental para demonstrar o envolvimento específico do PD CD4 na tradução mediada por IRAs. Por exemplo, neste experimento, células HEC 2 93 foram transfectadas temporariamente para esgotar os níveis endógenos de PDC D quatro e, em seguida, submetidas à análise de perfilamento PolyZone.A redução dos níveis de PDC D quatro não prejudicou a tradução global do gene, conforme indicado pela ausência de alterações no perfil do PolyZone. Ao comparar as células controle de SI e as células tratadas com IPD CD quatro, a distribuição de polissomos de uma variante não IRAs do XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas. Em contraste, a distribuição de polissomos dos dois RNAs mensageiros que abrigam IS, XIAP e BCL XL, foi significativamente alterada.Na ausência de PD CD4, a distribuição desses dois RNAm foi deslocada para ribossomos pesados. Como isso não é acompanhado por alterações nos níveis de estado estacionário dos RNAm XIAP e BCL XL, esses resultados demonstram a tradução aumentada de XIAP e BCL XL em células com níveis reduzidos de PDC D quatro, conforme confirmado adicionalmente por Western blossoming. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a tradução de RNAm mediante o preparo da região de sacarose e a separação de polissomos por ultracentrifugação.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Aprenda a distinguir mRNAs altamente e pouco traduzidos em células de mamíferos usando perfilamento de polissomos com gradiente de sacarose e ultracentrifugação. Este método identifica tradução seletiva sob estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

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