Name: A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a introduzir proteínas efetoras bacterianas em células de mamíferos por eletroporação. Este método rápido permite estudar a localização e função proteica com microscopia confocal.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Partes significativas deste trabalho foram realizadas no Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais, uma instalação nacional de usuários científicos do DOE / BER localizada no Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico (PNNL). O PNNL é operado para o DOE pela Battelle sob o Contrato DE-AC05-76RLO1830.

1. Prepare-se com antecedência <ol><li> Quente fosfato estéril salina tamponada (PBS) a 37 ° C. </li><li> Modificação de Dulbecco quente de Meio de Eagle (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estes representam crescimento normal de mídia (NGM) para as células RAW e HeLa, respectivamente. </li></ol> 2. Preparação de Células <ol><li> Crescer 264.7 RAW para 70-90% de confluência em NGM. <ol><li> Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de CO2. </li></ol></li><li> Cultivar células HeLa a 70-90% de confluência em NGM. <ol><li> Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de CO2. </li></ol></li><li> Antes da coleta, lave monocamada de células uma vez com PBS estéril. </li><li> Recolher as células pré-confluentes num tubo cónico estéril. <ol><li> Raspe suavemente as células RAWcom um policia de borracha em PBS, com pipetagem repetida para dispersar agregados de células. </li><li> Separar as células HeLa com solução de tripsina a 0,25% até que o exame visual mostra a dissociação a partir da superfície de cultura. Por exemplo, uso de 2 a 3 ml de um frasco T-75. Ajustar o volume da solução em conformidade para assegurar tripsina cobre toda a superfície de crescimento. <ol><li> Extingue-se reacção com dissociação NGM contendo 10% de FBS. </li><li> Use pelo menos duas vezes o volume de NGM a tripsina, com pipetagem repetida para dispersar agregações celulares. </li></ol></li></ol></li><li> Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min. </li><li> Ressuspender em volume igual solução de tripsina / têmpera usando PBS estéril. </li><li> Contagem de células usando hemocitômetro ou contador de partículas. </li><li> Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min. </li><li> Ressuspender em volume adequado de PBS para 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 células / ml. Nota: Por exemplo, um frasco de T-75 irá produzir aproximdamente 7,5 x 10 6 células 29. </li><li> Mantenha suspensão de células em gelo até eletroporação. </li></ol> 3. Preparação para electroporação <ol><li> Cuvetes Pré-chill eletroporação (0,4 centímetros de folga) em gelo. </li><li> Ligue aparelho de eletroporação e definir a tensão de 0,3 kV. NOTA: capacitância e resistência não eram configurações ajustáveis ​​em nosso electroporator (fixado em 10 iF e 600 Ω pelo fabricante). </li><li> Encha com placas de recuperação NGM e equilibrar em humidificada de 95% ar / 5% de CO2 a 37 ° C. </li></ol> 4. Eletroporação <ol><li> Colocar 400 mL da suspensão de células em cuvetes de pré-gelada e adiciona-se 20 ug de proteína seleccionada a cuvete (50 ug / ml). </li><li> Flick tina suavemente ~ 10 vezes para misturar sem danificar as células. Nota: A cuvete pode também ser invertida diversas vezes para misturar bem, mas não pipetar para cima e para baixo ou de vórtice, para evitar danificar as células. </li><li&gt; fora seco de tina com toalha de papel ou outro limpador de para evitar a formação de arco elétrico no electroporator. </li><li> Amostra electroporate a 0,3 kV para 1,5-1,7 ms. Nota: Isso era típico para este estudo. </li><li> Imediatamente após a eletroporação filme tina suavemente ~ 10 vezes para misturar bem. </li></ol> 5. chapeamento de Células <ol><li> Tina loja com células eletroporados no gelo até que esteja pronto para colocar em placas de recuperação. </li><li> Para a maioria das análises a jusante, lave as células 1x com NGM pré-aquecido para remover a proteína estranha efectora. <ol><li> Remover as células para análise e suspender em 3-5 ml de NGM. </li><li> Peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min. </li><li> Ressuspender em volume adequado de NGM para o tamanho da placa desejada (por exemplo 2 ml para 35 milímetros prato). </li></ol></li><li> Remover quantidade adequada de células para análise de downstream. <ol><li> Exemplo 1: placa em pratos com fundo de vidro para análise de microscopia. </li><li> Exemplo 2: placa into plástico de cultura de células para análise de proteínas, tais como purificação por afinidade. </li></ol></li><li> Permitir que as células em placas de recuperar humidificada equilibrada em 95% de ar / 5% de CO2 a 37 ° C durante pelo menos 4 horas. </li></ol> 6. Análise de Microscopia 6.1) Fixação / técnica de imunofluorescência <ol><li> Lave as células 1x com PBS estéril após o período de recuperação de 4 horas. </li><li> Fix células em 100% de metanol durante 2 minutos à temperatura ambiente. Use metanol suficiente para cobrir completamente as células (por exemplo, 2 ml para 35 milímetros prato). </li><li> Lavar 3x com PBS estéril. </li><li> Permeabilizar as células com 0,4% de Triton X-100 em PBS durante 15 min. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm. <ol><li> Ajustar o comprimento de permeabilização e força de Triton X-100 de acordo com epitopo e localização da proteína alvo. Nota: Os melhores resultados terá de ser determinado empiricamente para cada alvo, no entanto, as condições acima mencionadas, deve ser adequada para a maioria cmetas ytosolic. </li></ol></li><li> Bloco com 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS durante 1 h à TA. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Incubar anticorpo primário em solução de ligação do anticorpo (0,1% de Triton X-100 e 1% de BSA em PBS) durante a noite a 4 &#160; ° C com agitação suave. Por exemplo, usar 0,5 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm. <ol><li> Siga as recomendações do fabricante para a diluição do anticorpo. Nota: Por exemplo, o anticorpo marcador peptídico de ligação a estreptavidina (SBP-tag) foi utilizado a 1: 1000 de diluição, enquanto que o anticorpo PKN1 foi utilizado a 1: 200 de diluição. </li></ol></li><li> Lavar 4x com PBS. </li><li> Incubar com anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado em solução de ligação do anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente, protegida da luz. <ol><li> Por exemplo, usar Alexa 488 ou Alexa 647, durante 1 h à temperatura ambiente. <ol><li> Siga as recomendações do fabricante para a formigadiluição ibody. (Por exemplo, cerca de 1: 1000 para este estudo). </li></ol></li><li> Adicionar outras manchas, conforme necessário, por exemplo, 5 uM de gérmen de trigo agglutinnin (WGA) conjugada com Alexa 647 ou DAPI de acordo com a recomendação do fabricante, durante 1 hora à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Wash 5x com PBS e armazenar a 4 ° C, protegido da luz até que esteja pronto para a imagem. </li></ol> 6.2) microscopia confocal e Análise de Imagem <ol><li> Amostras de imagem em um microscópio confocal invertido utilizando uma objectiva de imersão em óleo de 63x. <ol><li> Imagem canal verde usando a linha de 488 nm de um laser de argônio, com emissão de largura de banda entre 492-542 nm. </li><li> Imagem canal vermelho usando um laser de diodo 633 nm, com emissão de largura de banda entre 640-718 nm. </li><li> Imagem do canal de azul usando um laser de diodo 405 nm, com emissão de largura de banda entre 407-453 nm. </li><li> Assegurar o canal múltiplo z pilhas cobrir a totalidade do volume celular. </li></ol></li><li> Processar imagens com o software de processamento de imagem apropriado. </li></ol> 7. Affinity Purificação <ol><li> Lave as células eletroporados duas vezes com 4 ° C PBS após o período de recuperação de 4 horas. </li><li> Lise com ~ 1,0 ml de tampão de lise (1% Triton X-100 com um cocktail inibidor de protease e inibidores de fosfatase em PBS) em gelo. Use inibidores de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Por exemplo, ambos os inibidores da protease e da fosfatase utilizados neste estudo foram fornecidas a 100x, mas outras formulações deve funcionar igualmente bem. </li><li> Prontamente raspar células com polícia de borracha e recolher em tubos cônicos. </li><li> Lise por vórtice vigoroso e sonicação. Nota: Outros métodos de lise pode funcionar igualmente bem, mas a eficiência será necessário ser empiricamente determinada como a adequação dos requisitos do ensaio. <ol><li> Sonicar 3 x 30 segundos com agitação em vórtex intermitente. </li></ol></li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para recolheros detritos celulares e agregados insolúveis; salvar o sobrenadante. </li><li> Combinar volumes iguais (~ 1,0 ml) de lisado de células electroporadas com 50 ul de suspensão de estreptavidina resina de agarose a 4 ° C durante a noite com uma rotação de extremidade sobre extremidade. Nota: Esta resina captura a proteína electroporadas (e complexos associados), através do seu péptido marcador de afinidade de ligação a estreptavidina. </li><li> Centrifugar a 2.500 xg por 2 min e elimine o sobrenadante. </li><li> Lavar duas vezes com 40 volumes de leito (~ 1 ml de PBS). </li><li> Adicionar 30 ul de tampão de carga 4x LDS (141 mM de base Tris, 2% de LDS, 10% glicerol, 0,51 mM de EDTA, 0,22 mM de L SERVA azul, vermelho de fenol 0,175 mM, pH 8,5), 20 ul dih 2 O, e 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), permitindo um certo volume para permanecer em grânulos. </li><li> Aquece-se a 95 ° C durante 10 min e arrefecer em gelo. </li><li> Rotação&gt; 10.000 xg, a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Recolher o sobrenadante. </li><li> Realizar um western blot utilizando anticorpos apropriados Nota: Elere, anti-PKN1 anticorpo primário é usado. </li></ol>

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<li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+PKN1%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology+%2F+Editorial+Board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science+%2F+Editorial+Board%2C+John+E.+Coligan+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Efectores secretadas a partir de bactérias patogénicas evoluíram a funcionar dentro do ambiente da célula hospedeira e, assim, é útil para estudá-los in situ dentro do hospedeiro. Introdução de efetores específicos de interesse em células hospedeiras permite a interação patógeno-hospedeiro relevantes a serem estudados de forma isolada, sem a interferência de outras proteínas bacterianas. O objectivo foi o de explorar a electroporação como um meio para introduzir proteínas efectoras bacterianas em células hosped...

Muitas bactérias Gram-negativas empregam sistemas de secreção especializados para injetar proteínas relacionadas à virulência (referidas como efetores) diretamente nas células hospedeiras 1-5. Estes efectores têm uma ampla gama de funções biológicas, incluindo: supressão da imunidade do hospedeiro, alterações do citoesqueleto, a modificação do tráfico intracelular e de sinalização, alterações da transcrição, e as alterações de proteassoma hospedeiro 6-9. As funções de alguns efectores são conhecidos, no entanto, os alvos do hospedeiro e de acção bioquímica (s) de muitos outros permanece a ser determinada. Ao se comparar o tipo selvagem e infecções bacterianas recombinantes é uma aproximação válida para estudar os mecanismos de virulência efector intracelular, é muitas vezes vantajoso para introduzir um indivíduo efectora na célula hospedeira. Assim, os métodos simples para a introdução e caracterização de proteínas efectoras bacterianas no contexto de células hospedeiras é altamente desejável. Simplificar o wi análise experimentalth um único efetor é crítica como outros efetores podem ter funções opostas ou redundantes. Para realizar esta simplificação, os pesquisadores já introduziu macromoléculas em células por muitos métodos diferentes, incluindo a transdução viral 10, microinjeção 11, raspar o carregamento 12,13, fusão celular com microinjeção induzido quimicamente 14, proteína proprietária &quot;transfecção&quot; reagentes 15, precipitações de fosfato de cálcio 16, 17-20 e electroporação. As moléculas introduzidas variam de ácidos nucleicos, incluindo as espécies de ADN, ARN, e proteínas de ARNi a, corantes de células-impermeável, e anticorpos para alvos intracelulares 21,22. Alguns métodos têm limitações, incluindo o tipo de macromoléculas que podem ser introduzidas, e em particular análises a jusante pode ser limitada devido à elevada toxicidade celular, prejudiciais mecanismos de acção, a baixa eficácia, ou eficiência de introdução. A transfecção, uma oftemétodo de n-utilizado para a expressão de genes bacterianos em células de mamífero, também sofre da limitação de que alguns tipos de células hospedeiras relevantes, tais como macrófagos e células primárias, são particularmente resistentes às transfecção. Além disso, é difícil controlar os níveis de proteína bacteriana produzida após a introdução de ADN estranho. Muito trabalho estabeleceu eletroporação de ácidos nucleicos em ambas as células bacterianas e de mamíferos como uma técnica de laboratório comum; no entanto, há investigação em curso sobre os melhores métodos para a entrega de proteínas nas células sob condições fisiológicas. Relatórios sobre a transfecção de proteína são promissores, mas requerem reagentes e otimização caros. O desejo de introduzir efectores bacterianas potencialmente tóxicos em uma grande variedade de alvos celulares com um custo mínimo nos levou a considerar electroporação como um método para o estudo destas proteínas in vivo. Electroporação é uma proteína de 23-25 ​​method para introduzir as proteínas em células vivas através electropermeabilization, também conhecidos como electro-transfecção ou electro-injeção 26. Esta técnica utiliza-alta intensidade impulsos eléctricos para criar poros em membranas celulares. Estes poros reversíveis permitir macromoléculas que são normalmente excluídos do espaço intracelular para entrar na célula. Após a remoção do campo eléctrico externo, a membrana pode selar novamente, permitindo que a célula de reter moléculas que passaram pelos poros 27,28. Um electroporador padrão foi utilizada neste estudo para introduzir consistentemente efectores bacterianas em ambas as células tipo macrófagos do rato e as células epiteliais humanas. O método é rápido, eficiente e barato, sem redução apreciável na viabilidade celular. As proteínas podem ser introduzidos visualizado por microscopia de imunofluorescência ou utilizadas para ensaios funcionais. Isto foi demonstrado utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como um padrão não-tóxicos, bem comoduas proteínas efectoras Salmonella, SspH1 e GTGE. Propomos electroporação proteína como uma ferramenta adicional para o repertório para o estudo de proteínas de virulência da bactéria e das suas funções em células hospedeiras eucarióticas.

<table><tbody><tr><td>Solução de Tripsina-EDTA a 0,25%</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cubetas de eletroporação descartáveis</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino inflamável e tóxica (BSA)</td><td>Aparelho de contagem de células Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>- Hemocitômetro ou contador de relhas</td><td>Beckman Coulter</td><td>Incubadora de Cultura de Células Modelo Z1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td>Umidificado 95% ar/5% CO2 atmosfera a 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Plástico de cultura de células</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td>Frascos de cultura de células/placas, pipetas, tubos, borracha Modificação</td></tr><tr><td>do Eagle do policial Dulbecco' s Médio (DMEM)</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>Quente a 37 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulser</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal fluorescente&nbsp;</td><td>Modelo Ziess</td><td>&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de Fundo de Vidro para Microscopia</td><td>Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inibidor de Protease Cocktail</td><td>Pierce</td><td>78430</td><td>Linha</td></tr><tr><td>Celular HeLa</td> Corrosiva e Tóxica <td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X Buffer de Carregamento</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>Quente para 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Outras colorações fluorescentes (WGA, DAPI) em conjunto com reagente anti-desbotamento</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário contra alvo de interesse</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado ao fluoróforo</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td><td>qualquer</td><td>resfriamento N / A</td><td>a 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato estéril tamponado com solução salina</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td>quente a 37 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Streptavidin Suspensão de Resina de Agarose&nbsp;</td><td>Perfure</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa capaz de aceitar tubos cônicos (balde oscilante preferido)</td><td>Qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>corrosivo, tóxico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>irritante, tóxico</td></tr></tbody></table>

a electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

O estudo das interações proteína no contexto de células vivas podem gerar informações importantes sobre a localização, dinâmica e parceiros interagem. Esta informação é particularmente valiosa no contexto das interacções hospedeiro-agente patogénico. Muitas proteínas de agentes patogénicos funcionar dentro das células hospedeiras na forma de uma variedade tais como, permitindo a evasão do sistema imunitário do hospedeiro e a sobrevivência no ambiente intracelular. Para estudar essas interações célula-hospedeiro de patógenos em proteínas, diversas abordagens são comumente usados, incluindo: infecção in vivo com uma estirpe que expressa uma proteína marcada ou mutante, ou a introdução de genes de patógenos via transfecção ou transdução. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens. Buscamos um meio para introduzir directamente proteínas exógenas nas células. A electroporação é geralmente utilizado para introduzir ácidos nucleicos em células, mas foi mais raramente aplicado a proteínas, embora a base biofísica é exactamente o mesmo.Um electroporador padrão foi utilizada para introduzir efectores bacterianas de afinidade marcado com em células de mamífero. Macrófagos epiteliais e mouse Humanos foram cultivados pelos métodos tradicionais, individual, e colocados em 0,4 centímetros cuvetes gap eletroporação com uma proteína exógena bacteriana patógeno de interesse (por exemplo, Salmonella Typhimurium GTGE). Após a eletroporação (0,3 kV) e um curto período de recuperação (4 horas), proteína intracelular foi verificada por fluorescently rotulando a proteína através da sua marca de afinidade e examinar a distribuição espacial e temporal por microscopia confocal. A proteína também electroporação mostrou ser funcional no interior da célula e capaz de tráfico subcelular correcta e interacção proteína-proteína. Enquanto as proteínas exógenas tendia a acumular-se sobre a superfície das células, as amostras electroporadas teve grandes aumentos na concentração intracelular de efector em relação à incubação sozinho. O protocolo é simples e rápido o suficiente para ser feito em apmoda arallel, permitindo a caracterização de alta taxa de transferência de proteínas de patógenos em células hospedeiras incluindo segmentação e função das proteínas de virulência subcelular.

Como um teste de conceito, a proteína fluorescente verde purificada foi introduzida com sucesso em células de mamíferos utilizando eletroporação. GFP, um valor aproximado de 27 kD, uma proteína de peso molecular é geralmente introduzido nas células de mamífero (normalmente expressos a partir de ADN de plasmídeo), como uma ferramenta de biologia molecular, sem toxicidade celular significativa. As células HeLa foram incubadas (Figura 1A) ou electroporação (Figura 1B) com 25 ug / ml de GFP...

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir proteínas exógenas, potencialmente citotóxicas, como efetores bacterianos, em células de mamíferos para estudar seus efeitos e funções. Isso é alcançado primeiramente cultivando células de mamíferos em condições padrão de cultura, a fim de obter células hospedeiras adequadas para a introdução da proteína purificada de interesse. Como segundo passo, realiza-se a eletroporação das células hospedeiras cultivadas na presença de um efetor bacteriano purificado, o que permite que a proteína entre e interaja com as células hospedeiras.Em seguida, realiza-se a visualização ou algum outro ensaio funcional para avaliar a localização subcelular e a funcionalidade da proteína efetora. Os resultados baseados em microscopia confocal, métodos imunoquímicos ou outras técnicas de análise mostram a localização dos efetores bacterianos funcionais em suas localizações subcelulares esperadas e a ligação aos seus parceiros de interação conhecidos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como transfecção ou transdução, é que este protocolo representa uma abordagem rápida, simples e econômica para contornar a citotoxicidade potencial.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de patógenos, como a descoberta ou validação das funções de proteínas efetoras bacterianas. Embora este método tenha sido usado para fornecer informações sobre proteínas efetoras bacterianas, ele também pode ser aplicado a outras proteínas ou moléculas pequenas. A visualização do resultado é essencial.Como a colocalização com características celulares conhecidas verifica a associação subcelular esperada da proteína eletroporada para iniciar este procedimento. Transfira 400 microlitros de suspensão celular para um tubo previamente resfriado. Em seguida, adicione 20 microgramas da proteína selecionada para atingir uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.Bata suavemente no Q Vet cerca de 10 vezes para misturar e evitar danificar as células. Em seguida, seque a parte externa do Q Vet com um papel-toalha para evitar arco elétrico no eletro. Coloque a amostra no eletro e ajuste para 0,3 quilovolts durante 1,5 a 1,7 milissegundos imediatamente após a eletroporação.Bata levemente no qve cerca de 10 vezes para misturar bem a amostra antes de prosseguir para a fixação e coloração por imunofluorescência ou purificação por afinidade. Após quatro horas de recuperação da eletroporação, lave as células com PBS estéril. Em seguida, fixe as células em metanol a 100% por dois minutos à temperatura ambiente.Posteriormente, lave as células com PBS estéril mais algumas vezes. Permeabilize as células com Triton X-100 0,4% em PBS por 15 minutos. Ajuste o tempo de permeabilização e a concentração de Triton X-100 de acordo com o epítopo e a localização da proteína-alvo.Em seguida, bloquee as células com BSA a 5% em PBS por uma hora à temperatura ambiente. Depois, lave-as três vezes com PBS. A seguir, incube-as com o anticorpo primário na solução de ligação de anticorpos durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave no dia seguinte.Lave as células mais quatro vezes com PBS. Em seguida, incube-as com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado na solução de ligação de anticorpos. Adicione outras colorações conforme necessário, como cinco micromolares de aglutinina de trigo (wheat germ agglutinin ou WGA) conjugada com Alexa 6 47 ou DPI por uma hora à temperatura ambiente e protegidas da luz.Em seguida, lave as células com PBS cinco vezes e armazene a quatro graus Celsius, protegido da luz, até que estejam prontas para serem analisadas nesta etapa. Lave as células eletroporadas duas vezes com PBS a quatro graus Celsius. Após quatro horas de recuperação, lise as células com um mililitro de tampão de lise no gelo.Remova imediatamente as células com uma espátula de borracha e colete-as nos tubos cônicos. Em seguida, lise as células por sonicação e vortexamento vigoroso. A seguir, centrifugue a amostra a 10.000 vezes.Centrifugar por 10 minutos a quatro graus Celsius para recolher os detritos celulares e agregados insolúveis e guardar o sobrenadante. Combine um mililitro do lisado celular eletroporado clarificado com 50 microlitros de suspensão de resina strept inros. Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite com rotação de extremidade a extremidade para capturar a proteína eletroporada e complexos associados por meio da marcação por afinidade ao peptídeo de ligação strp havein.Em seguida, centrifugue a amostra a 2.500 × g por dois minutos e descarte o sobrenatante. Então, lave a amostra duas vezes com um mililitro de PBS. A seguir, adicione 30 microlitros de tampão de carga 4× XLDS, 20 microlitros de H2O destilada e um microlitro de TCEP 0,5 molar à amostra, deixando parte do sobrenatante para trás.Aqueça a amostra a 95 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, resfrie-a em gelo por cerca de um minuto. Posteriormente, centrifugue a amostra a 10.000 ×g a quatro graus Celsius por cinco minutos.No final, colete o sobrenadante para o western blot com os anticorpos apropriados. As células HeLa foram incubadas ou eletroporadas com 50 microgramas por mililitro de um efetor de Salmonella com marcação de afinidade, GTGE, e coradas com um anticorpo contra a marcação do efetor dpi, uma máscara nuclear e WGA para delimitar o limite citosólico. As células HeLa incubadas mostram ausência de fluorescência verde, indicando falta de internalização do GTGE. Esta é uma microfotografia representativa do GTGE eletroporado, que mostra a proteína efetora intracelular eletroporada.Aqui está o western blot para detectar a proteína quinase N um, o parceiro de interação eucariótico sem timo. Observe que a última faixa à direita inclui duas cubetas agrupadas. O sinal de uma qve se misturou ao fundo, ainda assim pkn um foi enriquecida acima da ausência de ligação observada no controle sem isca por microscopia confocal após eletroporação com 50 microgramas por mililitro.Células HeLa S sph uma mostram a colocalização entre pkn um e S SPH um. Essa sobreposição óptica indica que o efetor e a proteína do hospedeiro estão suficientemente próximos para interagir fisicamente. O fato de a interação ter sido demonstrada no núcleo pela primeira vez oferece apoio adicional de que a proteína foi transportada corretamente pelo hospedeiro.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada de maneira de alto rendimento. Para estudar múltiplas proteínas individuais, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de determinar empiricamente as melhores condições de eletroporação para cada tipo celular e alvo proteico. Este procedimento pode permitir a multiplexação com diversas proteínas, moléculas pequenas ou uma combinação de ambas, a fim de compreender melhor os processos celulares em uma variedade de sistemas modelo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a eletroporação pode ser usada para introduzir macromoléculas, como proteínas, em células de mamíferos.

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Research

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