Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células musculares purificadas de biópsias musculares de pacientes humanos e imortalizá-las para estudos posteriores. Isso é conseguido primeiro pesando, picando e digerindo o tecido coletado para dissociar as células mononucleares. Como segundo passo, as células miogênicas são purificadas de células não miogênicas por fatos.

Em seguida, as células miogênicas são infectadas com CDK quatro e H turt para gerar células imortalizadas. Os resultados mostram que as células musculares vivas derivadas do paciente podem ser expandidas por várias passagens e diferenciadas com base em ensaios de fusão celular, na presença de tubos de mio em contração e na expressão de marcadores miogênicos. As implicações dessa técnica vão além do diagnóstico de doenças musculares, pois podem fornecer um número ilimitado de células miogênicas para triagem de drogas ou outras aplicações a jusante, onde é necessário um grande número de células.

Estarei demonstrando o procedimento junto com Jerome Robbin, um pós-doutorado do laboratório do Dr. Woody Wright em Dallas. Comece dissociando a biópsia muscular para purificar as células miogênicas. Primeiro, em um capuz de biossegurança de cultura de tecidos, registre a massa da biópsia muscular.

Em seguida, em um prato de 10 centímetros, use bisturis estéreis para picar o tecido em pedaços picados. Adicione algumas gotas de um X-H-B-S-S para que o tecido não seque por grama de tecido. Adicione 3,5 mililitros de pasta de disco dois e 3,5 mililitros de soluções de colagenase D.

Em seguida, misture as células com uma pipeta de 25 mililitros e transfira a placa para uma incubadora a cada 15 minutos. Misture as células com uma pipeta de cinco mililitros em 90 minutos. Deve haver uma dissociação completa do tecido.

Uma vez que o tecido esteja dissociado, adicione dois volumes de meio de crescimento e filtre-o através de um filtro de 100 mícrons. Recolher o filtrado num tubo de 50 mililitros. Pulverizar as células do filtrado a 329 G durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, ressuspenda as células no HBSS com 0,5% BS, A e conte-as. Ajuste o volume para obter 1 milhão de células por 100 microlitros. Separe uma alíquota de 250.000 células como controle não corado e reserve duas alíquotas semelhantes para controles de coloração simples.

Tudo isso é necessário para a análise do fax. Agora, core as células com cinco microlitros de anticorpo anti-CD 56 por milhão de células e incube todas as amostras no gelo por meia hora. Em seguida, lave rapidamente as amostras com 10 mililitros de HBSS.

Em seguida, jogue as células como antes, mas a quatro graus Celsius após as células terem sido peletizadas, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um X-H-B-S-S a 5 milhões de células por mililitro. Em seguida, adicionar iodeto de propídio a uma concentração final de um micrograma por mililitro. Agora purifique as células positivas miogênicas do CD 56 das células não miogênicas usando fatos após a placa de purificação.

As células miogênicas a 50.000 por poço em seis placas de poços revestidas com 0,1% de cultura de gelatina, as células até que estejam presas, infectam-nas com vírus para linha celular imortal. No protocolo de texto, há uma revisão adicional de como purificar e cultivar fibroblastos dérmicos, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare as células do trópico da fênix após incubar as células do trópico da fênix durante a noite com a mistura de plasmídeo PolyJet.

Alimente as células frescas, médias, compostas por quatro partes de DME M1, parte de meio, 1 99 e 10% de soro de bezerro. Prepare também embalagens inotrópicas. PA três células de 17 em uma placa de seis poços com cerca de 400.000 PA três células de 17 por poço.

12 horas depois, colete o vírus contendo sobrenadante sobre as células tropicais de Phoenix e passe-o por um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, use um mililitro do sobrenadante para infectar o PA três células 17 e cultive-as durante a noite. No dia seguinte, selecione uma linha celular produtora de vírus a partir das três células PA 17 aplicando antibióticos a 0,5 miligramas por mililitro no meio quando as células estiverem próximas da cofluência, colha o sobrenadante das células três vezes em intervalos de 12 horas.

Filtre as coleções após cada colheita. O filtrado é o sobrenadante viral em funcionamento. Divida-o em um mililitro. Alíquotas.

Separe algumas alíquotas para uso imediato. As alíquotas extras podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius, mas perderão 50% de eficiência a cada ciclo de congelamento e descongelamento. Observe que, durante todo o processo, o equipamento que tocou as partículas virais deve ser lavado com alvejante antes de ser descartado na lixeira.

Para armazenar permanentemente a linha celular estável de produção de vírus PA três 17, congele as células em soro 10% DMSO 90% e armazene-as a menos 150 graus Celsius para cada poço de células purificadas por fax. Em uma placa de seis poços, adicione 400 microlitros de sobrenadante viral recém-produzido. Deixe dois poços sem vírus como controle.

Incube a placa durante a noite e no dia seguinte mude o meio em cada poço para 2,5 mililitros de meio muscular fresco. Certifique-se de descartar a mídia e as pipetas que contêm partículas virais no recipiente de alvejante. Deixe as células incubarem no meio muscular fresco por três dias.

Em seguida, selecione as células para resistência a antibióticos usando 400 microgramas de neomicina por mililitro para infecção por CDK quatro ou 300 microgramas de higromicina por mililitro para telomerase humana. Infecção por transcriptase reversa por uma ou duas semanas. Mantenha as células sob as condições seletivas até que as células e os poços de controle estejam todos mortos.

Sempre passe as células antes que elas se tornem confluentes, mesmo durante a seleção, quando atingirem 60 a 80% de fluência de Co, use uma solução de EDTA de 0,05% de tripsina para coletar e passar as células. Passe as células para pratos de 10 centímetros com mioblastos frescos, médios com antibióticos. Primeiro semeie as células em uma densidade muito baixa de três a 500 por prato de 10 centímetros.

Mantenha as células nessas placas por cerca de duas semanas até que pequenas colônias de 10 a 20 células se formem quando as pequenas colônias forem evidentes. Remova a maior parte do meio, deixando apenas uma fina película de meio para evitar que as células sequem. Agora, mergulhe um lado de um anel de clonagem em graxa de silicone a vácuo e o anel sobre um clone desejado.

Coloque um anel diferente ao redor de cada clone desejado em cada anel. Adicione algumas gotas de solução de tripsina EDTA. Quando as células ficarem arredondadas, use um microscópio para aspirar cuidadosamente cada bola de células em uma ponta de pipeta de 200 microlitros.

Transfira as bolas de células para poços da menor placa de vários poços disponível. Em seguida, expanda cada clone conforme necessário para evitar a fluência co. Usando o protocolo descrito, as células miogênicas foram isoladas junto com fibroblastos, células adipogênicas e possivelmente células imunes e, em seguida, purificadas por fatos.

As células foram então imortalizadas conforme descrito usando vírus que expressam quinase dependente de ciclina quatro, CDK quatro e transcriptase reversa da telomerase humana Era crucial manter os pratos abaixo da cofluência em cada etapa, pois eles poderiam entrar no programa de diferenciação e formar tubos myo comparando a formação e contração do tubo myo em células controle não imortalizadas e as células imortalizadas. Não foram observadas diferenças.

O imortal da linhagem celular foi confirmado medindo o comprimento dos telômeros e a atividade dos telômeros. Imortal também foi evidente nas curvas de crescimento celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar as células musculares primárias da biópsia do paciente.

Imortalize o mioblasto primário e isole e selecione imortalizar clones miogênicos. Não se esqueça de que trabalhar com vírus requer o uso de cultura de tecidos específica e o sistema de ventilação seguro. Além disso, tudo o que está envolvido na manipulação do vírus, como pipetas, pontas, pratos, seringas e filtros, deve ser branqueado para evitar qualquer contaminação indesejada.

As partículas virais podem ser perigosas e, por precauções, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.