Name: Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a isolar e imortalizar células musculares de biópsias de pacientes humanos usando FACS e infecção viral com CDK4 e hTERT. Este método fornece linhagens celulares ilimitadas para estudos de doenças musculares e triagem de fármacos.

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Esta publicação é financiada pela Cure CMD, uma bolsa da Association Contre Les Myopathies (AFM) (projeto 16297) e pelos Institutos Nacionais de Saúde (números de concessão K08 AR059750, L40 AR057721 e 2R01NS047727).

NOTA: Os protocolos para a coleta do tecido humano deve ser analisado e aprovado pelo Comitê Institucional IRB. Coleção de descartado, tecido humano identificado-de ter sido aprovado pelo Hospital Infantil de Boston e Comitês IRB Hospital Brigham and Women. Os métodos descritos a seguir foram aplicadas para o isolamento de células miogénicas do de-identificados, tecido descartado. Os métodos descritos são aplicáveis ​​ao tecido a partir de material coletado do paciente consentiu. 1. Isolamento celular <ol><li> A dissociação de biópsia do músculo e purificação de células miogénicas <ol><li> Pré-pesar uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros em uma biossegurança capa de cultura de tecidos, e, em seguida, re-pesar a placa contendo a biópsia muscular para calcular a quantidade de tecido a ser dissociados. </li><li> Usando bisturis estéreis, tecido muscular pique finamente e adicione algumas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que o tecido seque. </li><li> Adicionar 3,5 ml de cada dispase II e colagenase D por grama de tecido muscular a ser digerido. Pipeta o tecido picada e solução de enzima através de uma pipeta estéril 25 ml algumas vezes. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 15 minutos e digerir tecido até que a lama passa facilmente através de uma pipeta de 5 ml estéril. NOTA: dissociação Tissue é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. Por favor, consulte a secção &#39;Os resultados representativos &quot;para obter detalhes adicionais. </li><li> Adicionar 2 volumes de meio de cultura estéril de tecido dissociado, filtrar através de um filtro de 100 um sobre uma célula de células de 50 ml para tubos cónicos e pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm), a temperatura ambiente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 volume de meio de cultura estéril e adicionar 7 volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos. Filtrar a solução através de um filtro de células 40 pm, então sedimentar tele células durante 10 minutos a 329 xg, à temperatura ambiente. </li><li> Contar as células num hemocitómetro e ressuspender as células em HBSS 1x 0,5% de BSA numa concentração de 1 x 10 6 células / 100 ul. Separe ~ 250.000 células em um único tubo que vai ser utilizado como um controlo negativo (sem mancha). Definir uma só cor manchadas tubos de controle de lado adicionais de iodeto de propídio e para CD56, que são necessários para a correcta delimitação de células positivas CD56 por FACS classificação. Por favor, consulte a célula manuais seleção ou consultar com FACS triagem especialistas instalação central para assegurar os controlos adequados estão incluídos. </li><li> Corar as células a serem classificados com 5 ul / 10 6 células do anticorpo anti CD56. Incubar todas as amostras (incluindo o controlo) em gelo durante 30 min. </li><li> Lavar as amostras em 10 ml de HBSS e 1x células pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1.100 rpm) numa centrifugadora refrigerada, 4 ° C de temperatura. </li><li> Adiciona-se iodeto de propídio a uma concentração final de 1 ug / ml para a amostra a ser sorted para a exclusão de células mortas. Purifica-se células positivas para CD56 a partir de células miogénicas não miogénicos usando o separador de células activadas por fluorescência. </li></ol></li><li> A dissociação de biópsia de pele NOTA: dérmica de fibroblastos podem ser isolados a partir de uma punção da pele de doentes biópsias musculares quando não estão disponíveis. Fibroblastos dérmicos podem ser usadas como biomaterial para diversos estudos, incluindo a transdução com MyoD para gerar células miogénicas. Além disso, os fibroblastos da derme pode ser usado para gerar células iPS, que podem ser diferenciadas em vários tipos de células para estudo posterior. <ol><li> Transportar a biópsia da pele para o laboratório em meio de transporte. Uma vez que a amostra é recebido, realizar a cultura primária tão rapidamente quanto possível. Se a cultura primária não podem ser estabelecidos no mesmo dia, armazenar a amostra à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Transfira a biópsia da pele para um estéril 35 milímetros placa de Petri na capela de fluxo laminar. </li><li> Lavar a biópsia da pele em uma placa de Petri estéril com 1x PBS para remover o sangue e detritos. Remover o tecido adiposo com um bisturi estéril. </li><li> Adicionar 2 ml de solução de colagenase e mediu o tecido com bisturi, incubar a 37 ° C durante 45 min a 1 hora, dependendo do tamanho do tecido. </li><li> Transferir o tecido digerido a um tubo de 15 ml, lavar a placa de Petri com 2 ml de meio de cultura de fibroblastos duas vezes, e recolher o meio no mesmo tubo. </li><li> Sedimentar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 3 ml de meio de fibroblastos para remover a colagenase, em seguida, as células pellet novamente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia. </li><li> Repita o passo 1.2.7 mais uma vez. </li><li> Re-suspender o sedimento em 5 ml de células de fibroblastos e médias placa em um frasco de cultura de tecidos T25 estéril. Incubar o balão a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Avaliar a cultura de fibroblastos para fixação e crescimento nos próximos 1-3 dias. &lt;br /&gt; NOTA: Alguns pequenos pedaços de tecido também pode anexar a placa e fibroblastos migram para fora desses pedaços de tecido. </li><li> Manter a cultura sob as mesmas condições até que os fibroblastos são cultivadas a cerca de 80% de confluência. </li><li> Recolhe fibroblastos por tripsinização e transferir para frascos de cultura frescas para a expansão adicional. Realizar tripsinização por lavagem das culturas 3 vezes em PBS 1x isento de Ca ++ e Mg ++. Adicionar tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) para as células (frascos de 2 ml / T25), durante 2 min a 37 ° C. </li><li> Dividir células destacadas em frascos adicionais. Se alguns pedaços de tecido permanecer solidários com os frascos T25 originais, adicionar 5 ml de meio de cultura fresco para este frasco e mais fibroblastos vão migrar para fora continuamente. NOTA: A cultura de fibroblastos expandidos podem ser congelados para baixo como P1 e armazenados em azoto líquido para futuras experiências. </li></ol></li></ol> 2. Imortalidade de Células Miogênica <ol><li&gt; de 5 milhões de células Placa ecotrópica de empacotamento Phoenix (PE) durante uma noite numa placa de cultura de tecido de 10 centímetros estéril em DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo. </li><li> Células de alimentação 30 minutos antes da transfecção com 5 ml de meio fresco suplementado com 10 mM de cafeína. </li><li> Homogeneizar uma mistura de 2 ug de DNA de plasmídeo a partir de uma preparação midi (hTERT CDK4 ou plasmídeo) e PolyJet e incubar à temperatura ambiente durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante. </li><li> Adicione a mistura de plasmídeo / PolyJet às células PE durante a noite. </li><li> Células de alimentação com meio fresco (DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo). Doze horas mais tarde, recolhe-se o sobrenadante contendo vírus, filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um. </li><li> Use 1 ml de sobrenadante recolhido para infectar durante a noite a linha celular de empacotamento anfotrópico PA317 5 e obter uma linha de células produtoras de vírus, após selecção com estável ou 0,5 mg / mL de neomicina (G418) para CDK4 ou 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT. </li><li> Prepare trabalhando sobrenadantes virais pelo crescimento das células de embalagem estáveis ​​para próximo da confluência, em seguida, a colheita do sobrenadante cada manhã, à noite e de manhã a três colheitas. </li><li> Filtrar os sobrenadantes virais e utilizar quer directamente ou dividi-los em alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C para uso posterior. Note-se que o sobrenadante viral perde 50% de eficiência de infecção com cada congelamento-descongelamento. Lembre-se de branquear-lavagem antes de descartar tudo o que tem tocado as partículas virais. NOTA: A linha de células produtoras de vírus PA317 estáveis ​​pode ser congelada e mantida a -150 ° C para o armazenamento permanente (meio de congelação é de 10% de DMSO; 90% soro). </li><li> Placa células miogénicas-purificado FACS (descrito nos passos 1,1-1,9) a uma densidade de 5 x 10 4 células / poço em placas de 6 poços revestidas com 0,1% de gelatina. Certifique-se de que as células estão ligados à placa antes de prosseguir com a infecção viral. </li><li> Adicionar 400 ul filtrada, freshly produzido sobrenadante viral ou alíquotas congeladas a cada seis poços durante a noite (manter dois poços como controles). </li><li> Mudar meio alimentando as células com 2,5 ml de poço de media / fresco muscular (4: 1 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio 199 suplementado com 15% de soro fetal de bovino; 0,02 M de tampão HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l dexametasona, factor de crescimento de hepatócitos de 2,5 ug / L e factor de crescimento de fibroblastos básico / L 10? g). Descartar os meios de comunicação e pipetas contendo as partículas virais em um recipiente de água sanitária. Deixar as células no mesmo meio durante 3 dias para recuperar de infecção, em seguida, tratar por selecção usando 400 ug / ml de neomicina (infecção CDK4) ou 300 ug / ml de higromicina (infecção hTERT). </li><li> Manter as células sob selecção de droga até as células da matriz de controlo prato (1-2 semanas). </li><li> Células de passagem antes de se tornarem confluentes (60-80% de confluência, utilizando tripsina EDTA 0,05%), mesmo durante a selectino período. Células replate 10 centímetros em vários pratos com meio de mioblastos fresco (como descrito em 2.11) suplementadas com a droga seleção. Manter células imortalizadas seleccionados como uma população heterogénea ou clonar obter um fundo genético completamente homogénea (mesma inserção do transgene em todas as células). </li><li> Realizar a selecção clonal utilizando os seguintes passos: <ol><li> Semear as células a uma densidade baixa (por exemplo, 300 a 500 células em placas de 10 cm) e mantê-los durante cerca de duas semanas, até que colónias pequenas são formadas células (10-20). </li><li> Remover a maior parte do meio, neste ponto, deixando apenas uma película fina para evitar que as células de secar. </li><li> Coloque um anel de clonagem (com uma extremidade mergulhada em silicone graxa de vácuo) ao longo de cada clone desejado e adicione algumas gotas de tripsina / EDTA. </li><li> Células colheita, uma vez que se tornam arredondadas com cuidado aspirar as células utilizando uma ponta de 1 ml ou uma pipeta de Pasteur e transferi-las para o menor pla multipoço disponívelte (96 ou 48, 24 ou placas de 12 poços). </li><li> Expandir clones conforme necessário para evitar confluência local. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Células como um recurso útil O isolamento e cultura de populações de células miogênicas é extremamente útil quando estabelece fenótipos da doença ou em modelos in vitro de doença. O procedimento de isolamento de células miogénica descrito aqui permite o isolamento de fibroblastos a partir de mioblastos e amostras do músculo esquelético, o que pode, em seguida, ser propagadas, diferenciados, ou imediatamente analisadas. Estrutura e função de mioblastos pode ser avaliada atra...

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Stacy C. Cossette
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Stacy A. Cossette

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Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

O diagnóstico molecular evoluiu drasticamente nos últimos 20 anos. O DNA genômico agora é rotineiramente isolado do escarro ou do swab da bochecha, enquanto no passado exigia uma coleta de sangue. Com o atual tempo de resposta rápido e a facilidade de sequenciamento de genes, muitas mutações de doenças são rotineiramente identificadas sem a necessidade de testes adicionais. No caso do diagnóstico de doenças musculares, a identificação de dezenas de novos genes na última década responsáveis pela distrofia muscular ou miopatia mudou drasticamente a forma como essas doenças são diagnosticadas 1,2. Atualmente, existem dezenas de genes que foram identificados como causas de distrofia muscular e miopatia congênita, embora os mecanismos pelos quais muitos desses genes produzem doenças permaneçam obscuros. Em particular, as doenças raras constituem um desafio devido ao pequeno tamanho das populações de pacientes. Para esses casos, assim como para doenças mais comuns, a geração de ferramentas estáveis que facilitem estudos sobre o mecanismo de patogênese e rastreamento de drogas terapêuticas é altamente desejável. 
Apesar do progresso dramático no diagnóstico de DNA, as biópsias musculares ainda são realizadas para estabelecer o diagnóstico primário em muitos pacientes nos quais há suspeita de doença metabólica ou muscular primária. Quando uma biópsia muscular é necessária, ela oferece a oportunidade de coleta adicional de tecidos diagnósticos e de pesquisa com risco mínimo de morbidade adicional para o paciente. Como há vários usos para cada amostra de tecido, é altamente desejável estabelecer técnicas para cultura de células primárias usando tecido cirúrgico que sejam diretas, eficientes e exijam quantidades mínimas de tecido. A triagem adequada de biópsias musculares ou de pele é necessária para maximizar o isolamento das células primárias do tecido e o armazenamento a longo prazo do material vivo. Além disso, a pesquisa com células-tronco e a triagem de medicamentos são uma grande promessa para o desenvolvimento de terapias para muitas doenças usando ensaios baseados em células 3,4.
Descrevemos aqui métodos para isolamento de células primárias de biópsias de músculo ou pele humana. Além disso, incluímos um protocolo para imortalização de células miogênicas, que é útil para gerar um grande número de células de um indivíduo. Essas células podem ser usadas para aplicações a jusante, como exames personalizados de medicamentos, que de outra forma seriam inatingíveis com o baixo número geral de células obtidas do tecido primário.

<table><tbody><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecido&nbsp; capa de biossegurança cultural</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Centrífuga de bancada modelo SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>, como Beckman Model&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modelo Allegra 6R</td><td>Se a classificação de células for realizada, uma centrífuga com refrigeração é preferida</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>Modelo Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos, conectada a uma fonte de CO2</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>Série II</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células ativadas por fluorescência (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes para isolamento de mioblastos primários do tecido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Prepare uma solução de meia de 2.4U/ml em DMEM</td></tr><tr><td>Collagenase D&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Prepare uma solução de estoque de 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Sterile Hank' s Solução salina balanceada (HBSS), livre de cálcio e magnésio</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Prepare uma solução estéril de 1X HBSS 0,5% BSA para classificação FACS</td></tr><tr><td>Meio de crescimento estéril para mioblastos: Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM) com glicose alta (4,5 g) suplementado com 30% de soro bovino fetal</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td> Contém solução de lise de <td>L-glutamina</td></tr><tr><td>RBC</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Estoque de iodeto de propídio 10mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Prepare a solução estoque diluindo o pó em água destilada estéril</td></tr><tr><td>Anticorpo CD56 anti-humano para citometria de fluxo</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>Anticorpo conjugado com APC, outros rótulos estão disponíveis</td></tr><tr><td>Reagentes para imortalização de mioblastos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linha celular de embalagem ecotrópica PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular de embalagem anfotrópica PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele de porco</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Prepare uma solução estoque de gelatina a 0,1% em água. Cubra o prato com a solução a 37&graus; C por uma hora. Retire a solução e adicione meio.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeos pBabe contendo mCDK4 e hTERT</td><td>não disponíveis</td><td></td> comercialmente <td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Kit midiprep de plasmídeos Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Médio 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Médio 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td> <td>Mix 4:1 DMEM: 199</td></tr><tr><td>Meio de crescimento mioblasto: 4:1 Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) e Medium 199 suplementado com 15% de soro fetal bovino; Tampão HEPES de 0,02 M; 1,4 mg/L de vitamina B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L dexametasona, 2,5 &mu; g/L de fator de crescimento de hepatócitos e 10 &mu; g/L beta fator de crescimento de fibroblastos.</td><td>Tecnologias da vida (DMEM, F199); Atlanta Biológica (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (sulfato de zinco); Sigma (Vit.B12, Dexametasona); Chemicon International (HGF); Biopioneer (betaFGF)&nbsp;</td><td># 15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876,#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Prepare o meio e a solução de estoque Vit. B12 (20mg / ml); Sulfato de Zinco (60&micro; g/ml); Dex (55&micro; g/&micro; l) separadamente para facilitar o uso. Solução estoque HGF (5&micro; g/ml) e FGF (20&micro; g/ml) deve ser adicionado de novo todas as semanas na concentração final de trabalho.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de cadeia pesada de miosina para imunocoloração</td><td>Banco de hibridoma de desenvolvimento</td><td>MF20</td><td>Clone MF20</td></tr><tr><td>Desmin Anticorpo para imunocoloração</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clone D33 Soro</td></tr> de <tr><td>cavalo</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes para isolamento primário de fibroblastos da pele</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de transporte: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 0,2% de penicilina/estreptomicina</td><td>Meio RPMI 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de fibroblastos primários humanos: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina</td><td>Soro fetal bovino: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Solução de colagenase: Colagenase tipo 2 (100 mg) ressuspensa em 12,5 ml de meio de cultura de fibroblastos e esterilizado por filtro</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1X Tampão de fosfato solução salina (PBS) livre de cálcio e magnésio</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materiais para isolamento de mioblastos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 50 ml e 15 ml</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml); C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis estéreis</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estéreis de 5, 10 e 25 ml Vidro</td><td>Bellco</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>As pipetas reutilizáveis são lavadas, o algodão é tampado e autoclavado antes do uso</td></tr><tr><td>Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de nylon estéreis (100 &micro; m e 40 &micro; tamanho m)</td> <td>BD Falcon</td><td>352340 (40&micro; m); 352360 (100&micro; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Materiais para imortalização</td><td></td><td></td><td></td>de mioblastos</tr><tr><td>Estéril 0,45 &micro; m filtros</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Anéis de clonagem</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Para ser limpo e autoclavado antes e depois do uso</td></tr><tr><td>Materiais para linhas celulares de fibroblastos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pratos de plástico estéreis tratados com cultura de tecidos de 35 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis estéreis</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>Frascos estéreis para cultura de tecidos T25</td><td>Techno Plastic Product, TPP</td><td>90026</td><td>vendido nos EUA pela MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença modeling

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

A geração de linhagens celulares específicas do paciente representa uma ferramenta inestimável para pesquisa diagnóstica ou translacional, e essas células podem ser coletadas do tecido de biópsia de pele ou músculo disponível durante a investigação diagnóstica do paciente. Neste protocolo, descrevemos uma técnica para isolamento de células vivas de pequenas quantidades de tecido muscular ou cutâneo para cultura de células primárias. Além disso, fornecemos uma técnica para a imortalização de linhagens celulares miogênicas e linhagens celulares de fibroblastos a partir de células primárias. Uma vez que as linhagens celulares são imortalizadas, uma expansão substancial das células derivadas do paciente pode ser alcançada. As células imortalizadas são passíveis de muitas aplicações a jusante, incluindo triagem de drogas e correção in vitro da mutação genética. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

A Figura 1 ilustra alguns dos principais passos envolvidos na dissociação de tecido primário: a quantidade exacta de tecido é pesada num estéril de cultura de tecido de petri (Figura 1A, B). O tecido é então finamente picada usando bisturis estéreis, até que uma suspensão de tecido é obtida (figura 1C, D). Após a adição das enzimas de digestão, o tecido muscular primária dissociação é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. A progressão da digestã...

Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo. Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita. Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células musculares purificadas de biópsias musculares de pacientes humanos e imortalizá-las para estudos posteriores. Isso é alcançado primeiramente pesando, picando e digerindo o tecido coletado para dissociar as células mononucleares. Como segundo passo, as células miogênicas são purificadas a partir de células não miogênicas por meio de facts.Em seguida, células miogênicas são infectadas com CDK4 e Hturt para gerar células imortalizadas. Os resultados mostram que células musculares vivas derivadas de pacientes podem ser expandidas por várias passagens e diferenciadas com base em ensaios de fusão celular, na presença de miotubos contráteis e na expressão de marcadores miogênicos. As implicações dessa técnica vão além do diagnóstico de doenças musculares, pois podem fornecer potencialmente um número ilimitado de células miogênicas para triagem de fármacos ou outras aplicações posteriores nas quais é necessário um grande número de células.Eu demonstrarei o procedimento junto com Jerome Robbin, um pesquisador pós-doutorando do laboratório do Dr. Woody Wright em Dallas. Comece dissociando a biópsia muscular para purificar as células miogênicas. Primeiro, em uma capela de segurança biológica para cultura de tecidos, registre a massa da biópsia muscular.A seguir, em uma placa de 10 centímetros, use bisturis estéreis para picar o tecido em pedaços finamente cortados. Adicione algumas gotas de uma solução X-H-B-S-S para que o tecido não seque por grama de tecido. Adicione 3,5 mililitros da pasta disc dois e 3,5 mililitros da solução de colagenase D.Em seguida, misture as células com uma pipeta de 25 mililitros e transfira a placa para uma incubadora a cada 15 minutos. Misture as células com uma pipeta de cinco mililitros dentro de 90 minutos. Deve haver uma dissociação tecidual completa.Uma vez que o tecido esteja dissociado, adicione dois volumes de meio de crescimento e filtre através de uma peneira de 100 microns. Colete o filtrado em um tubo de 50 mililitros. Peliculize as células do filtrado a 329 G durante 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, ressuspenda as células em HBSS com 0,5% de BS, A, e conte-as. Ajuste o volume para obter 1 milhão de células por 100 microlitros. Reserve uma alíquota de 250.000 células como controle não corado e reserve duas alíquotas semelhantes para controles de coloração simples.Estes são todos necessários para a análise de fax. Agora, marque as células com cinco microlitros de anticorpo anti-CD56 por milhão de células e incube todas as amostras no gelo por meia hora. Em seguida, lave rapidamente as amostras com 10 mililitros de HBSS.Em seguida, centrifugue as células como antes, mas a quatro graus Celsius; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em um X-H-B-S-S a 5 milhões de células por mililitro. Em seguida, adicione iodeto de propídio até uma concentração final de um micrograma por mililitro. Agora, purifique as células miogênicas positivas para CD56 das células não miogênicas utilizando a técnica de separação celular ativada por fluorescência (FACS), seguindo a placa de purificação.Cultive as células miogênicas a 50.000 por poço em placas de seis poços recobertas com gelatina 0,1%, até que as células se fixem, e então infecte-as com o vírus para imortalização da linhagem celular. No protocolo descrito no texto, há uma revisão adicional sobre como purificar e cultivar fibroblastos dérmicos, conforme descrito no protocolo textual. Prepare as células phoenix tropic após incubação das células phoenix tropic durante a noite com a mistura de plasmídeo PolyJet.Alimente as células com meio fresco, composto por quatro partes de DME M1, uma parte de meio 199 e 10% de soro de bezerro. Prepare também o empacotamento inotrópico. Plaque três 17 células em uma placa de seis poços com cerca de 400.000 células PA três 17 por poço.Doze horas depois, colete o sobrenadante contendo o vírus das células Phoenix trópicas e filtre-o através de um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, use um mililitro do sobrenadante para infectar as células PA three 17 e cultive-as durante a noite. No dia seguinte, selecione uma linhagem celular produtora de vírus a partir das células PA three 17 aplicando antibióticos a 0,5 miligramas por mililitro ao meio quando as células estiverem quase confluentes, e colete o sobrenadante das células três vezes em intervalos de 12 horas.Filtre as coletas após cada colheita. O filtrado é o sobrenadante viral em trabalho. Divida-o em alíquotas de um mililitro.Reserve algumas alíquotas para uso imediato. As alíquotas extras podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius, mas perderão 50% da eficiência em cada ciclo de congelamento e descongelamento. Observe que, durante todo o processo, os equipamentos que entraram em contato com as partículas virais devem ser lavados com hipoclorito antes de serem descartados no lixo.Para armazenar permanentemente a linhagem celular produtora do vírus PA estável três 17, congele as células em 10% DMSO 90% soro e armazene-as a menos 150 graus Celsius em cada poço de células purificadas por fax. Em uma placa de seis poços, adicione 400 microlitros de sobrenadante viral recém-produzido. Deixe dois poços sem vírus como controles.Incube a placa durante a noite e, no dia seguinte, troque o meio de cada poço por 2,5 mililitros de meio muscular fresco. Certifique-se de descartar o meio e as pipetas que contêm partículas virais no recipiente com água sanitária. Deixe as células em incubação no meio muscular fresco por três dias.Em seguida, selecione as células com resistência ao antibiótico utilizando 400 microgramas de neomicina por mililitro para infecção por CDK4 ou 300 microgramas de higromicina por mililitro para telomerase humana. Realize a infecção com transcriptase reversa por uma ou duas semanas. Mantenha as células sob condições seletivas até que as células e os poços controle estejam todos mortos.Realize a repicagem das células sempre antes que elas fiquem confluentes, mesmo durante a seleção, quando atingirem 60 a 80% de confluência. Utilize uma solução de tripsina-EDTA a 0,05% para coletar e repicar as células. Repique as células em placas de 10 centímetros com meio fresco para mioblastos, contendo antibióticos. Inicialmente, semeie as células em uma densidade muito baixa, de três a 500 por placa de 10 centímetros.Mantenha as células nestas placas por cerca de duas semanas, até que pequenas colônias de 10 a 20 células se formem, quando as pequenas colônias estiverem evidentes. Remova a maior parte do meio, deixando apenas uma fina película de meio para evitar que as células sequem. Agora, mergulhe um lado de um anel de clonagem em graxa de vácuo de silicone e coloque o anel sobre uma colônia desejada.Coloque um anel diferente ao redor de cada clone desejado em cada anel. Adicione algumas gotas de solução de tripsina EDTA. Quando as células ficarem arredondadas, use um microscópio para aspirar cuidadosamente cada grupo de células em uma ponteira de pipeta de 200 microlitros.Transfira as esferas celulares para poços da placa multipoços de menor tamanho disponível. Em seguida, expanda cada clone conforme necessário para evitar confluência. Utilizando o protocolo descrito, células miogênicas foram isoladas juntamente com fibroblastos, células adipogênicas e possivelmente células imunes, e posteriormente purificadas por FACS.As células foram então imortalizadas conforme descrito, utilizando vírus que expressam a quinase dependente de ciclina quatro, CDK4, e a telomerase reversa humana hTERT. Foi crucial manter as placas abaixo da confluência em cada etapa, pois elas poderiam entrar no programa de diferenciação e formar tubos miotubulares. Comparando a formação e a contração de tubos miotubulares em células controle não imortalizadas e em células imortalizadas, nenhuma diferença foi observada.A imortalização da linhagem celular foi confirmada pela medição do comprimento dos telômeros e da atividade telomerase. A imortalização também foi evidente a partir das curvas de crescimento celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissociar células musculares primárias a partir de biópsia de paciente.Imortalize os mioblastos primários e isole e selecione clones miogênicos imortalizados. Não se esqueça de que o trabalho com vírus exige o uso de uma capela de cultura de tecidos específica e um sistema de ventilação seguro. Além disso, tudo o que for utilizado na manipulação do vírus, como pipetas, ponteiras, placas, seringas e filtros, deve ser tratado com hipoclorito para evitar qualquer contaminação indesejada.Partículas virais podem ser perigosas e sempre devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Este protocolo utiliza eletroporação para introduzir e expressar proteínas marcadas com fluorescência em fibras musculares de camundongos. Após a recuperação após a eletroporação, as fibras são isoladas. As fibras individuais são então visualizadas usando microscopia confocal de alta resolução para visualizar a estrutura muscular.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo.  os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a isolar e imortalizar células musculares de biópsias de pacientes humanos usando FACS e infecção viral com CDK4 e hTERT. Este método fornece linhagens celulares ilimitadas para estudos de doenças musculares e triagem de fármacos.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

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