In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar funcionalmente as terminações nervosas aferentes extrínsecas no co-reto de camundongos in vitro. Isso é conseguido colhendo o nervo do pescoço Splunk pélvico ou lombar colorretal e o nervo do pescoço Splunk pélvico ou lombar anexado em continuum e colocando o tecido em uma câmara de gravação in vitro Como uma segunda etapa, o tronco nervoso do pescoço Splunk pélvico ou lombar é dividido em filamentos finos para que registros eletrofisiológicos de fibra única possam ser feitos de axônios nervosos individuais. Em seguida, as terminações nervosas colorretais individuais são identificadas por estimulação elétrica imparcial dos campos receptivos e classificadas funcionalmente com base nos perfis de resposta a três estímulos mecânicos distintos.

Além disso, as respostas aos produtos químicos aplicados às terminações nervosas podem ser testadas isolando o campo receptivo com um pedaço de tubo de latão e substituindo a solução pela solução contendo o produto químico ou a mistura de produtos químicos. Os resultados mostram que o colorretal de camundongo é inervado por cinco classes diferentes de ens sensíveis ao mechano. Além disso, cerca de 25% dos ens colorretais são nociceptores mecanicamente insensíveis ou silenciosos.

Este método é usado por nós e outros para estudar a inervação sensorial do colorretal. Estamos interessados em usar essa abordagem de pesquisa porque muitos distúrbios gastrointestinais estão associados à sensibilização ou a uma mudança na excitabilidade da inervação sensorial. Nosso interesse em entender os mecanismos de sensibilização está relacionado ao nosso desejo de ajudar a desenvolver estratégias terapêuticas que possam ser úteis para modular a dor e o desconforto tipicamente associados a esses distúrbios gastrointestinais, como a síndrome do intestino irritável.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissecção do tecido e divisão do nervo são muito difíceis de dominar. Os nervos inovando. O colorretal distal pode ser facilmente danificado durante a dissecção.

Assim, uma dissecação cuidadosa e suas etapas de divisão são realmente críticas para aqueles que desejam replicar esse experimento. Imediatamente após a eutanásia de um camundongo, exsanguine-o, abra a câmara torácica, perfure o átrio direito e mergulhe a carcaça do camundongo e cerca de meio litro de solução de Creb gelada. Em seguida, remova cuidadosamente todas as vísceras, exceto o cólon e os órgãos pélvicos.

Em seguida, transeccione o corpo do camundongo em cerca de T 12 ligeiramente acima do diafragma torácico e transfira a metade do corpo para uma câmara de dissecção contendo solução de crebs de bolhas geladas. Sob um estereoscópio, remova a bexiga e os órgãos reprodutivos por transecção em suas junções com a uretra. Além disso, remova a aorta descendente até que ela se bifurque nas artérias ilíacas comuns.

Agora, libere os nervos pélvicos ou lombares do pescoço dos tecidos circundantes. Siga os nervos de fora da crista ilíaca até seu ponto de entrada na coluna vertebral. Os nervos pélvicos entram na coluna vertebral L seis e S um e os nervos esplâncados lombares entram em T 13 e L um demonstrado.

Aqui está a dissecção dos nervos pélvicos esquerdo e direito. Em seguida, corte a síntese púbica e corte as articulações acetabulares direita e esquerda. Em seguida, remova o osso ilíaco Depois de remover o ilíaco, disseque o colorretal distal com o nervo anexado livre.

O nervo anexado ao músculo circundante e ao tecido conjuntivo. O nervo é suscetível a danos mecânicos. Estamos livres do tecido circundante, portanto, cuidados especiais devem ser dados para evitar puxar ou beliscar o nervo.

Em seguida, transfira o colorretal com o nervo anexado para a câmara de tecido. Abra o colorretal longitudinalmente ao longo da borda antimesentérica e posicione o lado da mucosa colorretal para cima. Em seguida, estenda o nervo para o compartimento de gravação, que é conectado ao compartimento do banho por um orifício de rato e um portão.

Posicione o tronco nervoso em um pequeno espelho de vidro. O espelho é hidrofílico e o nervo adere a ele. Agora, ao lado do compartimento de gravação, prenda a borda mesentérica do colorretal.

Agora superfunda um compartimento de banho com solução Creb oxigenada quente e encha o compartimento de gravação com óleo mineral para completar a configuração. Prenda o comprimento antimesentérico do colorretal a um ancinho de ganchos conectados a um atuador de força sob o microscópio estéreo em alta ampliação. Retire cuidadosamente a bainha nervosa do nervo pélvico ou lombar isolado usando uma pinça fina.

Provoque o tronco nervoso em cinco a oito feixes nervosos, cada um com cerca de 100 mícrons de espessura. Agora coloque o eletrodo de referência em contato com a solução de Krebs na câmara de tecido. Em seguida, posicione sequencialmente os feixes nervosos individuais no eletrodo de registro para evocar potenciais de ação do enferm colorretal.

Acaricie suavemente a superfície colorretal usando um pincel macio. Assim, identifique o feixe ou feixes nervosos que inervam o cólon. Agora, usando um par de pontas de agulha de calibre 30, divida ainda mais o feixe de nervos em filamentos de 10 mícrons de espessura e coloque um dos filamentos no eletrodo de gravação.

Esta etapa exige um alto nível de coordenação olho-mão e destreza. Em seguida, para excitar eletricamente as terminações nervosas aferentes, posicione o eletrodo concêntrico com ponta redonda perpendicular à superfície da mucosa e estimule em uma intensidade supra limiar. Isso produz uma corrente espalhada por um raio de dois milímetros.

Para encontrar terminações receptivas, mova o eletrodo sistematicamente em passos de 1,5 milímetro ao longo do comprimento e largura do co-reto achatado. Quando uma terminação aferente é excitada, ajuste a posição do eletrodo e a intensidade do estímulo para identificar o campo receptivo que requer a menor intensidade de estímulo para responder. Se o limiar de estímulo for maior que três miliamperes, descarte essa terminação nervosa e passe a estudar outro filamento nervoso.

Agora calcule a velocidade de condução a partir da distância entre o eletrodo estimulante no campo receptivo e o local de registro, e a partir do atraso de condução entre o artefato de estímulo e o início do potencial de ação. Depois de localizar um campo receptivo por estímulo elétrico, aplique três estímulos mecânicos. Primeiro, aplique um estímulo de sondagem pressionando a ponta de um von fray calibrado, como monofilamento de náilon perpendicularmente em direção ao campo receptivo no colorretal achatado.

Use monofilamentos que produzam uma força de 0,4 grama e um grama. Em segundo lugar, produza um estímulo de acariciar suavemente a mucosa colorretal com um fio de filamento de náilon fino, produzindo uma força de 10 miligramas para gerar uma pequena tensão de cisalhamento superficial no campo receptivo. Terceiro, conduza o alongamento circunferencial usando um atuador de força controlado por computador.

Faça com que ele forneça uma força esticada de rampa em uma direção circunferencial ao longo da borda antimesentérica do colorretal. Agora classifique o ENS como mucosa serosa muscular muscular ou aferente mecanicamente insensível MIAA. Com base nos resultados dos três testes.

Comece registrando uma resposta basal a um estímulo mecânico, como na seção anterior, por meio de uma sondagem mecânica circunferencial, de alongamento ou perpendicular em rampa para testar a sensibilidade química. Primeiro cubra a borda inferior de um pedaço de tubo de latão ou aço inoxidável com petróleo e coloque-o sobre o campo receptivo no colorretal. Agora aspire a solução de Krebs de dentro da tubulação e substitua a solução por 170 microlitros de solução de teste.

Deixe o tubo na posição por três a cinco minutos enquanto monitora as respostas no aferente. Imediatamente após a remoção do tubo dentro de quatro a seis minutos, teste a resposta aferente ao mesmo estímulo mecânico da resposta basal. Após 15 ou mais minutos, os reagentes podem ser considerados lavados.

Em seguida, o estímulo mecânico é aplicado novamente. Para comparar com as formigas basais, um nervo dissecado foi estimulado para encontrar um campo receptivo. O campo receptivo foi identificado por uma resposta de potencial de ação usando atraso de condução do potencial de ação.

A velocidade de condução calculada foi de 43 metros por segundo, o que está bem na faixa de uma fibra C não mielinizada. Depois de identificar o campo receptivo, ele foi sondado perpendicularmente por monofilamentos semelhantes a von fray portáteis e também suavemente acariciado por um filamento de náilon fino portátil. As respostas AFR à sondagem também foram avaliadas por um atuador de força controlado por computador que fornece ao mesmo local no colorretal, uma série de forças mecânicas precisamente cronometradas e reprodutíveis.

Da mesma forma, o alongamento circunferencial do colorretal foi entregue pelo mesmo esforço do atuador. As respostas podem ser distinguidas com base nas respostas à sondagem, carícias e alongamentos de um aferente sensível ao alongamento foram evocadas por três alongamentos circunferenciais consecutivos separados por cinco minutos. Os números de pico foram fixados uniformemente e exibidos como funções de resposta ao estímulo, revelando alta reprodutibilidade e magnitude e limiar de resposta.

Em seguida, produtos químicos foram aplicados. A ativação direta de ens ocorreu após a aplicação de uma solução hipertônica ácida após a aplicação de uma sopa inflamatória em um aferente mecanicamente insensível. Nenhuma ativação da terminação ocorreu, mas a aquisição da sensibilidade meno foi aparente.

Um aferente sensível ao estiramento e meno sensível também foi sensibilizado ao estiramento mecânico do campo receptivo após a aplicação de uma sopa inflamatória Uma vez dominado, geralmente leva de três a quatro horas para completar a dissecção do tecido e obter o registro de fibra única. Um experimento típico leva um dia inteiro do início ao fim. Depois de ver este vídeo, você deve entender como remover e colher cirurgicamente o colorretal com os nervos presos.

Em seguida, ser capaz de registrar a partir de fibras de Ahern únicas no nervo pélvico ou no nervo esplântico lombar, inervando o cólon usando uma estratégia de busca elétrica imparcial. Você deve então ser capaz de identificar terminações receptivas no co-reto e testá-las quanto à sensibilidade mecânica, bem como à sensibilidade à quimioterapia pela aplicação de produtos químicos diretamente nas terminações receptivas. Esta preparação é uma preparação poderosa que permite estudar mecanismos fisiopatológicos, bem como questões fisiológicas básicas no colorretal.