Name: Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a criar lesões por compressão na medula espinhal em camundongos usando pinças calibradas. Este protocolo cirúrgico padronizado garante reprodutibilidade em modelos de trauma medular para pesquisa em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O financiamento para este trabalho foi fornecido pelos Hospitais Shriners e bolsas CIRM para AMC e AM. Gostaríamos também de agradecer a Plemel et al.7 para primeiro projetar e publicar o modelo de fórceps calibrado.

Todos os procedimentos com animais e métodos de cuidados de animais deve ser aprovado pela Institutional Animal Care e Uso Comitê da instituição (IACUC). 1. Preparação Cirúrgica <ol><li> Montar todos os instrumentos cirúrgicos necessários e reagentes: fórceps, tesouras vana, roungeurs, afastador, bisturis, tesouras, suturas, grampos de pele, cotonetes, soro fisiológico estéril, esponjas cirúrgicas, e isoflurano. Preparar e autoclave um pacote completo de ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia. Se a realização de cirurgias em mais de um rato, preparar e autoclave de um pacote de ferramentas por animal, ou autoclave de um pacote de instrumentos cirúrgicos e esterilizar com um esterilizador ferramenta entre cirurgias. Geralmente, um pacote de ferramentas esterilizadas podem ser utilizadas em até 5 ratinhos se uma ferramenta terilizer esferas de vidro é usado para limpar as ferramentas no meio cirurgias (5 animais após as ferramentas devem ser re-limpos e esterilizados antes da utilização). Por favor, verifique com o administrador IACUC local para INSTITUTIsobre as orientações específicas. </li><li> Esterilizar o campo cirúrgico com 70% de algodão embebido em álcool isopropílico. Configurar campos cirúrgicos para garantir um campo estéril é mantida durante a cirurgia. </li><li> Pesar cada rato antes da cirurgia. Administrar uma dose de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina, por via subcutânea. </li><li> Anestesiar o animal através da administração de isoflurano a uma dose de 4% na câmara de indução da máquina de isoflurano. </li><li> Uma vez que o animal é anestesiado, aplicar pomada para os olhos para impedir a desidratação, definir o animal numa almofada de aquecimento a 37 ° C, e assegurar que a cabeça do rato está adequadamente situado no cone de anestesia. (Nota: Utilizar uma fonte de aquecimento que não irá causar queimaduras térmicas, ou seja, uma manta de circulação de água, a garrafa de água quente, ou equivalente..) Neste ponto de administrar uma dose de 2% de isoflurano para o animal. </li><li> Raspar a superfície dorsal do rato, aproximadamente 1 cm ao redor do local da incisão que se destina. </li><li> Desinfetar a incisão site por lavagem com 70% de toalhetes de álcool isopropílico, em seguida, com uma solução de iodo (10% Povidona-iodo, 1% de iodo disponível). Repita 3 vezes. </li></ol> 2. Dorsal Laminectomy <ol><li> Antes de fazer uma incisão, garantir que o animal está devidamente anestesiados, verificando reflexos usando o método pitada toe ou cauda. </li><li> Faça uma incisão ao longo da espinha dorsal com bisturi e lâmina, e, em seguida, verificar se há reflexos novamente. Arquear as costas para ajudar a visualizar correctamente pontos de referência, como as fronteiras entre as vértebras. </li><li> Corte através da pele. Insira afastador para manter a pele e fáscia de volta da medula espinhal. Limpar o tecido em ambos os lados da medula espinal para expor os músculos que cobrem a espinha. NOTA: O cirurgião deve estar familiarizado com os marcos anatômicos. Por exemplo, o ângulo inferior da escápula corresponde com T7. A parte superior da curva natural da medula do rato é T12 e pode ser utilizado como um ponto de referência. </li><li> Com piluminação Roper, determinar o espaço entre as vértebras. Encontre a extremidade posterior do T10 e cortar músculos e fáscia perpendicular ao espaço em disco intervertebral. Corte apenas o suficiente para expor o processo e posterior lamina espinhoso de T10. </li><li> Utilizando um par de ponta fina Dumont # 5 fórceps, remover uma parte do tecido da lâmina e processo espinhoso para expor uma pequena porção da medula espinhal. Quando necessário, utilizar uma pinça para estabilizar a coluna vertebral. </li><li> Realizar a laminectomia, inserindo um lado de um par de tesouras pequenas vana ao longo do lado dorsolateral da vértebra e logo abaixo da lâmina. <ol><li> Faça pequenas, snips cuidadosas para cortar a lateral da lâmina vertebral. Assegure-se que não é aplicada pressão para a medula espinhal. </li><li> Repita no outro lado. </li><li> Aplique uma leve pressão para parar o sangramento, se necessário com um Q-tip ou esponja cirúrgica, tendo o cuidado de não aplicar pressão sobre a medula espinhal. Nota: Preparar espuma gelembebido em solução salina estéril no caso em que as necessidades de sangramento a ser controlada. </li><li> Uma vez que as incisões foram feitas, retire o aspecto dorsal da vértebra e limpar suavemente quaisquer acessórios de tecido. Utilize os meios adequados para controlar o sangramento, se necessário. </li></ol></li></ol> 3. compressão da medula espinhal <ol><li> Usando fórceps ou roungeurs laminectomia, assegurar que os lados laterais da medula espinal são livres de osso vertebral, de modo que a pinça calibrada para a lesão por compressão pode situar em ambos os lados da medula espinal. Os braços da pinça deve ser capaz de ser colocado no interior do espaço epidural em lados adjacentes da espinal medula e as pontas das pinças tem de ser capaz de atingir o chão do canal vertebral. <ol><li> Certifique-se de que a visibilidade da medula espinhal é bom. </li></ol></li><li> Situar o calibrado Dumont # 5 fórceps aproximadamente no meio do segmento exposto da espinal-medula. Recorde-se que os braços da forçaps deve ser colocada dentro do espaço epidural em lados adjacentes e as pontas deve tocar o solo do canal vertebral para gerar lesões reprodutíveis. </li><li> Comprimir cuidadosamente a medula espinal até que os espaçadores ligar. Mantenha no lugar por 15 segundos. </li><li> Suavemente libertar a força de compressão e remover as pinças calibrados a partir da medula espinal. Salina estéril deve ser usada para recuperar antes da homeostase ferida é fechada. </li></ol> 4. Wound Encerramento <ol><li> Suturar com cuidado a camada muscular ao longo da medula espinal, tendo o cuidado de não perturbar ou aplicar pressão para a medula espinhal. </li><li> Utilize qualquer suturas ou grampos para fechar a pele sobre a ferida. </li><li> Se estiver usando gás anestésico, começam a afunilar / desligar o anestésico. </li><li> Administrar 0,1 ml de Ringer com lactato por 10 g de peso corporal para ajudar a conta para a desidratação durante a cirurgia e após a cirurgia quando o animal está letárgico e se recuperando da lesão. A solução deve ser warmed a temperatura do corpo antes da injecção. </li><li> Posicione o mouse em uma gaiola sem roupa de cama. A gaiola deveria assentar no topo de uma almofada de aquecimento (conforme descrito em 1.1.5) de uma maneira que permite que metade da superfície da gaiola estar na almofada, enquanto a outra metade está apoiada sobre um contador de RT, a fim de dar a opções de clima do mouse uma vez que é ambulatorial. Tome cuidado para garantir que a &quot;gaiola de recuperação&quot; está localizado em um ambiente silencioso. Acompanhar de perto o animal até que ele recuperou a consciência, momento em que o rato pode ser transferido para uma gaiola regular com roupa de cama. </li></ol> Cuidados 5. Pós-operatório <ol><li> Após a cirurgia, administrar uma dose de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 horas durante os primeiros 3 dias após a cirurgia, e em seguida, conforme necessário para controlar os sintomas de dor. </li><li> Administrar uma dose de Ringer com lactato (0,1 ml por 10 g de peso corporal por via subcutânea) para os primeiros 3-5 dias após a cirurgia. Dê esta dose se / quando a umimal começa a exibir sinais de desidratação fora deste período de tempo inicial. </li><li> Expressar manualmente a bexiga dos animais utilizando a manobra Crede duas vezes por dia. Gentilmente apalpar o abdômen do animal para localizar a bexiga, e em seguida, aplicar uma pressão descendente suave até a bexiga está vazia. <ol><li> Se a bexiga não se esvazia ou a urina é sangue ou nublado, administrar 50 mg / kg por peso corporal de Baytril para o animal, por injecção intraperitoneal, durante 10 dias. </li></ol></li><li> Monitorizar os animais quanto a sinais de autofagia, desidratação e perda excessiva de peso (superior a 20% do peso corporal). Se um animal experimenta algum destes sintomas, consulte um veterinário imediatamente com relação a opções de tratamento, ou a eutanásia do animal de forma humana seguindo orientações IACUC. <ol><li> Dado que a mobilidade pode ser limitado logo após a cirurgia, tomar as medidas necessárias para garantir que os animais têm acesso a comida e água. Pré-embalados alimentos úmidos, bem como umas hidrogel, pode ser disponibilizado para animais nestes casos. </li></ol></li></ol> 6. Avaliar os danos do tecido resultante da lesão Compression <ol><li> Anestesiar animal, tal como descrito nas etapas 1.4 e 1.5. Verifique a profundidade da anestesia, pela pitada toe e monitoramento dos reflexos de pestanejar córnea. Quando o animal é insensível aos estímulos, vá para o passo 6.2. </li><li> Executar uma perfusão intracardíaca 10. <ol><li> Expor a cavidade torácica e inserir uma agulha no interior do ventrículo esquerdo. Lave fluidos existentes com 20 - 30 ml de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS) seguida de 15 - 25 ml de gelado a 4% de paraformaldeído (PFA). </li></ol></li><li> Remover a medula espinhal. <ol><li> Cortar a pele dorsal da medula espinal e limpar qualquer excesso de tecido em torno do comprimento da coluna vertebral. </li><li> Excise coluna vertebral e cortar qualquer tecido remanescente. O nível real da laminectomia e injury pode ser confirmada pela contagem costelas. </li><li> Use tesouras e pinças vanna para deslocar pequenas seções da coluna vertebral em uma direção caudal-to-rostral. Continuar a cortar até que o cabo está exposto o suficiente para permitir a remoção segura. A visualização do local de corte e processo pode ser facilitado através da utilização de um estereoscópio. </li></ol></li><li> Coloque tecido da medula espinhal em 4% PFA. Permitir que o tecido para pós-fix nesta solução por 24 horas a 4 ° C. </li><li> Cryoprotect tecido, por incubação em sacarose a 30% durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Tecido Incorporar em outubro Resumidamente, o tecido de tomar a incubação de sacarose a 30% e remover qualquer excesso de solução. Colocar o tecido em um cryomold preenchido com outubro e incubar durante 1 hora a 4 ° C. <ol><li> Retirar o molde de 4 ° C, confirmar a orientação direccional do tecido, colocar o molde num prato raso de 2-metilbutano (pré-arrefecido durante 1 hora em gelo seco) e permitir OCT para solidificar completamente. Manter em gelo seco se usar imediatamente ou store-se a -80 ° C. </li></ol></li><li> Cortar o tecido em 20 mm sagitais utilizando um criostato. Mount tecido diretamente sobre slides. Armazenar a -20 ° C até o uso. </li><li> Execute Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) mancha. <ol><li> Resumidamente, re-hidratar o tecido (5 minutos, 2 vezes), mancha com hematoxilina (2,5 min), e lava-se com água (1 min, 2 vezes). </li><li> Incubar o tecido em 50% e em seguida de etanol a 70% (3 min cada), com mancha de eosina (45 seg), e desidratar por incubação em 90% (5 segundos), 95% (5 segundos), etanol a 100% (2 min) , e isopropanol (2 min). </li><li> Limpar com xileno (5 min, 3 vezes). NOTA: H &amp; E coloração varia em função da espessura e das condições de tecido específico. Portanto, a padronização é necessária antes de prosseguir com amostras de tecidos experimentais. </li></ol></li><li> Cobrir o tecido com uma fina tira de Permount (~ 100 mm) e lamela. Pressionar para baixo em todos os lados da lamela para assegurar a distribuição apropriada do fluido. Deixe secar lâminas O / N. </li><li> Visualize cortes de tecido usando um microscópio e de captura de imagens digitais usando o software que o acompanha. </li></ol>

<ol><li>McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+proliferation+after+SCI+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Endogenous proliferation after SCI in animal models.</a> Stem Cells Int. 2012, 387513(2012).</li>
<li>Onifer, S. M., Rabchevsky, A. G., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+traumatic+SCI+to+assess+motor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Rat models of traumatic SCI to assess motor recovery.</a> ILAR J. 48 (4), 385-395 (2007).</li>
<li>Bunge, R. P., Puckett, W. R., Becerra, J. L., Marcillo, A., Quencer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+human+SCI.+A+review+and+classification+of+22+new+cases+with+details+from+a+case+of+chronic+cord+compression+with+extensive+focal+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of human SCI. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination.</a> Adv Neurol. 59, 75-89 (1993).</li>
<li>Beattie, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+repair+after+spinal+cord+contusion+injuries+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Endogenous repair after spinal cord contusion injuries in the rat.</a> Exp Neurol. 148 (2), 453-463 (1997).</li>
<li>Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+histological+and+locomotor+outcomes+after+spinal+cord+contusion+using+the+NYU+weight-drop+device+versus+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+SCI+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe SCI in rats.</a> J Vis Exp. 78, (2013).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+graded+forceps+crush+SCI+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A graded forceps crush SCI model in mice.</a> J Neurotrauma. 25 (4), 350-370 (2008).</li>
<li>Wu, D., Shibuya, S., Miyamoto, O., Itano, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+NG2-positive+cells+associated+with+radial+glia+following+traumatic+SCI+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Increase of NG2-positive cells associated with radial glia following traumatic SCI in adult rats.</a> J Neurocytol. 34 (6), 459-469 (2005).</li>
<li>Namiki, J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+nestin+expression+in+the+ependyma+of+the+adult+rat+spinal+cord+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and nestin expression in the ependyma of the adult rat spinal cord after injury.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (5), 489-498 (1999).</li>
<li>Teletin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+in+Mouse+Metabolic+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Histopathology in Mouse Metabolic Investigations.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 29, (2007).</li>
<li>McDonough, A., Hoang, A. N., Monterrubio, A. M., Greenhalgh, S., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+injury+in+the+mouse+spinal+cord+elicits+a+specific+proliferative+response+and+distinct+cell+fate+acquisition+along+rostro-caudal+and+dorso-ventral+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compression injury in the mouse spinal cord elicits a specific proliferative response and distinct cell fate acquisition along rostro-caudal and dorso-ventral axes.</a> Neuroscience. 254, 1-17 (2013).</li>
<li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+SCI+in+five+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after SCI in five common mouse strains.</a> J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A escolha de um modelo SCI é importante na concepção de experiências para determinar a eficácia de tratamentos para os casos humanos de LM. Tais experiências requerem um modelo animal que é altamente reprodutível para limitar a variabilidade que pode resultar em dados inconclusivos. Eles também devem ser de relevância clínica para avaliar com precisão a condição humana que está modelando. Para esse efeito, a escolha de uma lesão ou de compressão ao longo de um transecção contundente é mais clinicamente relevante 3. No entanto, pêndulos e aparelhos de queda de peso para os ferimentos contusos requerem o uso de maquinaria cara e complicada. Em contraste, o modelo da SCI pinça calibrada utiliza uma pinça, que são fáceis de montar a partir de materiais comuns de laboratório modificada, e a cirurgia exige apenas uma etapa adicional após a laminectomia dorsal padrão para expor a medula espinhal. No entanto, uma desvantagem da utilização deste método é que a força de compressão deve ser sempre aplicada lateralmente e não dorsalmente, comoé mais freqüentemente vista em casos clínicos humanos da SCI 9, e lesões de compressão gerados usando o método afeta em maior medida rostral-caudal de tecido do que os modelos contusão 1,2. Este modelo tem sido demonstrado pelos criadores da técnica, e nós, para gerar reprodutível SCI 7,11, e é bem adequado para o tamanho de ratos. Além disso, este modelo de lesão permite aos animais a serem avaliadas após cirurgia e tratamentos terapêuticos usando uma multiplicidade de testes comportamentais, tais como a Escala de Basso rato para locomoção e o teste de cabelo de von Frey, para verificar que um grupo de animais partilham a mesma gravidade de lesão e déficits neurológicos 7,11-13. Estas mesmas técnicas também podem ser usadas para avaliar a eficácia dos tratamentos administrados aos animais durante os estudos de investigação, que preencham os critérios gerais para os modelos animais utilizados para avaliar as terapias para a SCI 2,7. O método de produção da pinça calibradas para o modelo de lesão é simples e pode ser realizado com uma variedade de métodos diferentes. Temos utilizado o método espaçador 11, conforme publicado pela Plemel 7, e também modificado fórceps usando um pequeno parafuso, o que não só proporciona um método mais fácil para a criação do dispositivo de compressão, mas também permite a versatilidade em ajustar a largura de compressão final, de benefício para estudos comparativos. A gama de opções na criação da pinça é praticamente ilimitado, desde que o espaçador (s) fornecer um meio estáveis ​​de fechar a pinça sempre à mesma distância e pode suportar tratamento em autoclave e esterilização. Os métodos cirúrgicos descritos neste vídeo são altamente reprodutível entre os usuários, no entanto, é necessário ter o cuidado ao realizar a laminectomia e suturar o animal após o procedimento foi realizado para que a medula espinhal não sofre quaisquer forças de compressão adicionais que podem aumentar a gravidade da lesão e confundir experimentos futuros. </p&gt; Com treino e prática adequada, o modelo de lesão de compressão pinça calibrada é bem adequado para a realização de SCI em ratos que imitam casos clínicos observados em humanos 2,3,7. Devido à facilidade de criação de uma pinça, produzindo camundongos de diferentes graus de gravidade da lesão pode ser feito facilmente. Isto será de grande benefício para a observação de efeitos genéticos em SCI de diferentes graus de severidade em camundongos transgênicos, bem como a avaliação da eficácia dos transplantes de células-tronco em camundongos. A maioria dos estudos na literatura foram realizados em ratos, devido ao seu tamanho, o que geralmente faz cirurgias mais fácil de executar. No entanto, o método publicado por Plemel et al. 7 e descrito por nós neste vídeo deve permitir SCI para ser realizado em ratinhos com grande facilidade e reprodutibilidade.

Modelos animais de SCI são ferramentas valiosas para avaliar a eficácia de paradigmas terapêuticas destinadas a mitigar os danos como conseqüência do trauma na medula espinhal. Em caso de necessidade experimental, estes modelos devem fornecer défices reprodutíveis no locomotora e os comportamentos sensoriais, ser ajustável para produzir lesões de gravidade diferente, e demonstrar que a gravidade da lesão correlaciona com o grau de déficit neurológico observado. Existem três tipos principais de SCI com características distintas de lesão: transection, contusão, e compressão 1. Resumidamente, uma lesão é uma laceração transecção da medula espinhal, uma contusão surge a partir de uma breve força, aplicada focal para a espinal medula dorsal, e uma lesão por compressão ocorre quando uma força é aplicada prejudicial para a medula espinhal, e pode também ser referido como uma lesão por esmagamento 2. Lesões transecção completa são clinicamente rara em seres humanos 3, enquanto uma contusãod lesões de compressão são mais comuns. A lesão de compressão produz um resultado semelhante ao que é encontrado em SCI humana causada por, por exemplo, por compressão do tumor ou outras forças compressivas prejudiciais, e pode ser realizada utilizando um simples conjunto de ferramentas. Ferimentos contusos e compressão são semelhantes em que ambos são uma força de compressão e ambos têm características patológicas semelhantes, como desorganização citoarquitetônicos, e evocam respostas endógenas semelhantes a lesão 1,4. O modelo de lesão por contusão geralmente aplica-se esta força com a medula espinal dorsal utilizando um aparelho especial de uma maneira semelhante aos casos humanos de LM resultantes de uma impacção da coluna vertebral 2,5,6. Em contraste, as lesões de compressão podem ser gerados por uma variedade de métodos de aplicação de força dorsalmente ou lateralmente. Métodos de uma lesão de compressão incluem pinças 7, clips de aneurisma calibrada 2, ou colocando um peso diretamente na medula espinhal 8. Uma vantagem doclips de aneurisma é que eles são capazes de fornecer quantidades diferentes de força 9. O método de adição de pesos para a superfície dorsal da medula espinhal directamente 8 requer o peso de estar no lugar durante 10 minutos, aumentando drasticamente o comprimento da cirurgia e resultando em inconsistências devido à colocação do peso e o movimento devido à respiração do animal. Devido ao tamanho pequeno dos ratos, situando animais em aparelhos especializados para a utilização em ratos, tais como pêndulos para lesões contusas, pode ser difícil ou causar ferimentos inconsistentes 7. No entanto, os ratinhos são disponíveis em uma ampla gama de estirpes transgénicas, ao contrário dos animais maiores tais como coelhos ou ratos que são muito úteis para a investigação SCI. O método Plemel de usar fórceps calibrados para comprimir a medula espinhal gera um SCI reprodutível com um elevado grau de correlação entre a gravidade da lesão e déficit neurológico 7. Este modelo SCI cirúrgico égerado usando um par de fórceps Dumont No. 5 adaptados para serem mantidas afastadas a uma distância definida por um epoxi de metal ou algum outro obstrução para impedir o fechamento completo. Este espaçamento engenharia garante que a pinça vai sempre perto de uma determinada largura de múltiplas cirurgias e por diferentes usuários. A vantagem do método é que Plemel os materiais para produzir as pinças calibrados podem ser facilmente adquiridos e montados no laboratório sem necessidade de equipamento especializado. Esta pinça pode suportar vários ciclos de tratamento em autoclave e esterilização, e pela falta de um aparelho separado, volumoso simplifica cirurgias. Neste vídeo demonstramos a utilização cirúrgica de um par de pinças calibrados na medula espinal do rato para gerar uma lesão por compressão. Nós também lidar com as preocupações originais relacionados ao cuidado de medula espinhal feridos animais de laboratório para melhorar a sua qualidade de vida no pós-operatório e reduzir a mortalidade.

<table><tbody><tr><td>Máquina de isoflurano</td><td>Smiths Medical PM, Inc</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Phoenix Pharmaceutical</td><td>NDC: 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Seiler Precision Microscopes</td><td>SSI 202/402</td><td></td></tr><tr><td>Germinator-500 (esterilizador de ferramentas)</td> <td>Thomas Scientific</td><td>3885A20</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (pomada para os olhos)</td> <td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi (#11)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Afastador (Colibri)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson roungeur</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td>, <td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vanna (Castroviejo)</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Tecido</td>, <td>Ferramentas de Belas Ciências</td>, <td>11029-14</td><td></td></tr>, <tr><td>Pinça de Laminectomia (Dumont #2)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td>, <td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Grampeador</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Grampos (clipes de ferida)</td><td>Reflex7</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas (30 G x &frac12;)</td>Seringa <td>de 305106</td><td></td> <td>BD Biomedical</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>BD Biomedical</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacina)</td><td>Bayer</td><td>NADA 140-913</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex (buprenorfina)</td><td>Cardinal Health</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr></tbody></table>

calibrado fórceps modelo de lesão medular compression

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Lesões de compressão da medula espinhal murino são valiosos modelos animais para o estudo da lesão medular (SCI) e terapia regenerativa espinhal. O modelo de lesão compressão forceps calibrado é um conveniente, de baixo custo, e modelo animal muito reprodutível para SCI. Foi utilizado um par de fórceps modificados de acordo com o método publicado por Plemel et al. (2008), para comprimir lateralmente a medula espinal a uma distância de 0,35 mm. Neste vídeo, iremos demonstrar uma laminectomia dorsal para expor a medula espinhal, seguido de compressão da medula espinal com o fórceps modificados. No vídeo, vamos também abordar questões relacionadas com os cuidados de animais de laboratório paraplégicos. O modelo de lesão produz camundongos que apresentam prejuízo na sensação, assim como o comprometimento da função dos membros posteriores locomotor. Além disso, este método produz lesão de aberrações consistentes na patologia da SCI, conforme determinado por métodos imuno-histoquímicos. Depois de assistir a este video, os espectadores deve ser capaz de determinar as fontes e métodos necessários para a produção de várias gravidades SCI no rato para os estudos sobre a SCI e / ou tratamentos concebidos para mitigar prejuízo após a lesão.

Foi realizada uma laminectomia em 12 ratinhos (25 - 30 gramas), como descrito acima, seguidos por compressões medulares a 0,25 mm (n = 4), 0,35 mm (n = 4) e 0,55 mm (n = 4). Nós nos sacrificamos animais em três (n = 6) e sete (n = 6) dias após a lesão por perfusão intracardíaca. A medula foi retirada da coluna vertebral, e o tecido foi preparado e processado como descrito acima. Imagens da medula espinhal todo foram tiradas com um microscópio digital Leica EZ4 e software que o acompanha. Imagens de secções da espinal medula foram tiradas com uma ampliação de 2X usando um microscópio digital Olympus e software que o acompanha. Descobrimos que a compressão da medula espinal produz uma lesão com o epicentro no local da compressão (Figura 1). Os efeitos da lesão estender vários milímetros na direcção rostral e caudal. A gravidade da lesão como o aumento da distância entre os espaçadores diminuída (0,25 mm&gt; 0,35 milímetros&gt;0,55 milímetros, Figura 2). Três dias após a compressão havia sangue no epicentro da lesão e regiões vizinhas que não estava presente 7 dias após a lesão. As compressões de 0,25 milímetros e 0,35 milímetros produzida uma cavidade, mas não o modelo de 0,55 milímetros. Após 7 dias, a substância branca dorsal e ventral diminuiu largamente em tamanho no epicentro, a organização matéria cinzenta foi altamente distorcida, e cavitação foi persistente. Essas alterações cytoarchitectonical são traduzidos para limitações motoras e sensoriais em comportamento animal avaliado através de testes adequados, como o Basso Rato Scale for Locomotor Função e os cabelos e cloreto de etila testes de von Frey para a função sensorial como demonstramos em publicações anteriores 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Imagens representativas da medula espinhal intacta antes e aflesão ter. (A) medula espinhal intacta. (B) da medula espinhal após a compressão 0,35 milímetros. As setas indicam a fronteira de lesão. Asterisk identifica epicentro da lesão. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 0,50 milímetros <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. Imagens representativas de rato medula espinhal antes e após a lesão de compressão em diferentes larguras de compressão. (A) Corte sagital de controle da medula espinhal. (B) Secção coronal no epicentro de um 0,35 milímetros SCI sete dias lesão compressão post (dpi). (C, E, G) seções sagital da medula espinhal 3 dpi para uma largura de 0,25 , 0,35 ou 0,55 milímetros. (D, F, H), sagitais de H &amp; E manchada medula espinhals 7 dpi para uma largura de 0,25, 0,35 ou 0,55 milímetros. Asterisk identifica epicentro da lesão. Todas as seções coradas com H &amp; E. D = Dorsal, L = Lateral. Barra de escala:. 1,25 milímetros <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os modelos de lesão medular devem ser altamente reprodutíveis. Demonstramos que o modelo de compressão com fórceps calibrado de lesão medular é um método cirúrgico fácil de usar para gerar lesões reprodutíveis na medula espinhal murina.

Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar os passos necessários para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal em camundongos utilizando pinças calibradas. Isso é alcançado mediante a remoção cuidadosa das camadas de pele e músculo sobre a coluna vertebral e a identificação do alvo vertebral correto. Em seguida, realiza-se uma laminectomia na vértebra-alvo para expor a medula espinhal, e então pinças calibradas são utilizadas para produzir a lesão medular.Os resultados ilustram a extensão dos danos no tecido da medula espinhal após uma compressão da medula espinhal, utilizando técnicas histoquímicas. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades. Você está realizando um procedimento muito delicado em um animal pequeno, com pequena margem para erros.Este é um tecido sensível, e você pode acidentalmente causar uma lesão mais grave do que a pretendida; por isso, pode ser útil praticar primeiro. Para se preparar para a cirurgia, reúna os seguintes itens: instrumentos cirúrgicos e reagentes, pinças, tesouras tipo van, bisturis URS, suturas retratoras, grampos cirúrgicos, cotonetes, solução salina estéril, esponjas cirúrgicas e isoflurano, que é usado em conjunto com um aparelho de anestesia. Autoclave os instrumentos para uma única cirurgia e utilize um esterilizador de instrumentos para esterilizá-los entre procedimentos cirúrgicos. Use álcool isopropílico a 70% para desinfetar o campo cirúrgico e monte campos cirúrgicos para garantir que o campo estéril seja mantido durante a cirurgia.Após pesar cada camundongo antes da cirurgia, administrar uma dose de 0,05 miligramas por quilograma de peso corporal de buprenorfina por via subcutânea assim que o animal estiver anestesiado, de acordo com o protocolo descrito no texto; aplicar pomada nos olhos para prevenir desidratação e raspar a superfície dorsal do camundongo em um raio de aproximadamente um centímetro ao redor do local planejado para a incisão. Para desinfetar o local da incisão, utilizar uma solução de iodo seguida por álcool isopropílico a 70%. Repetir o procedimento três vezes antes de iniciar a cirurgia.Primeiro, realize uma compressão no dedo do pé ou na cauda para avaliar os reflexos. Se nenhum estiver presente, use um bisturi para fazer uma incisão ao longo da espinha dorsal, cortando a pele.Insira o afastador para manter a pele afastada da medula espinhal. Verifique novamente os reflexos. Em seguida, remova o tecido em ambos os lados da medula espinhal para expor os músculos que recobrem a coluna; arqueie as costas para ajudar a visualizar corretamente marcos anatômicos, como as fronteiras entre as vértebras.As seguintes referências devem estar visíveis: o ângulo inferior da escápula, que corresponde a T7, e o topo da curvatura natural da medula espinhal do camundongo em T12, com iluminação adequada. Determine o espaço entre as vértebras.Em seguida, localize a extremidade posterior de T10 e corte uma quantidade mínima de músculos e fáscia perpendicularmente ao espaço do disco intervertebral para expor o processo espinhoso e a lâmina posterior de T10 utilizando uma pinça fina Dumont número cinco. Remova parte do tecido da lâmina e do processo espinhoso para expor uma pequena faixa da medula espinhal. Quando necessário, utilize pinças de tecido para estabilizar a coluna vertebral.A seguir, realize a laminectomia inserindo um dos lados de uma tesoura pequena de VNA ao longo do lado lateral dorsal da vértebra, logo abaixo da lâmina. Em seguida, faça pequenos cortes cuidadosos para seccionar o lado lateral esquerdo da lâmina vertebral. Repita o procedimento do outro lado.Certifique-se de que nenhuma pressão seja aplicada à medula espinhal com um cotonete ou esponja cirúrgica. Aplique pressão suave para interromper o sangramento, conforme necessário. Tendo o cuidado de não exercer pressão sobre a medula espinhal.Após realizadas as incisões, remova a face dorsal da vértebra e limpe suavemente quaisquer aderências teciduais. Utilize meios apropriados para controlar o sangramento, se necessário. Com pinças inadequadas ou pinças para laminectomia, assegure-se de que os lados laterais da medula espinhal estejam livres do osso vertebral, de modo que as pinças calibradas para a lesão por compressão possam ser posicionadas corretamente em ambos os lados da medula espinhal.Agora posicione a pinça Dumont calibrada nº 5 aproximadamente no meio do segmento exposto da medula espinhal, com as hastes da pinça dentro do espaço epidural e as pontas tocando o assoalho do canal vertebral. Comprima cuidadosamente a medula espinhal até que os espaçadores se conectem e mantenha-a comprimida por 15 segundos.Em seguida, libere suavemente a força compressiva e remova a pinça calibrada da medula espinhal. Aplique solução salina estéril para restabelecer a homeostase e feche cuidadosamente com pontos a camada muscular sobre a medula espinhal, tomando cuidado para não perturbar ou exercer pressão sobre ela.Use suturas ou grampos para fechar a pele sobre o ferimento. Administre um mililitro de ringer lactato por 10 gramas de peso corporal para auxiliar na desidratação. Antes de colocar o camundongo em uma gaiola sem cama, sobre uma placa aquecida ajustada a aproximadamente 37 graus Celsius.Em um ambiente tranquilo, monitore atentamente o animal até que ele recupere a consciência. Em seguida, transfira-o para uma gaiola comum com forração pelos primeiros três dias após a cirurgia, administre uma dose de 0,05 miligramas por quilograma de peso corporal de buprenorfina por via subcutânea a cada 12 horas e, posteriormente, conforme necessário para controlar os sintomas de dor duas vezes ao dia. Utilize a manobra decretada para esvaziar manualmente a bexiga do animal, palpando suavemente o abdômen do animal para localizar a bexiga e aplicando pressão suave para baixo até que a bexiga esteja vazia.Devido à mobilidade reduzida do animal logo após a cirurgia, tome as providências necessárias para garantir que o animal tenha acesso a alimento e água, fornecendo alimento úmido e hidrogel. Consulte o protocolo descrito no texto para avaliar danos teciduais após laminectomia e compressões da medula espinhal no ponto 25 milímetros. Os pontos 35 milímetros ou 55 milímetros foram realizados em 12 camundongos, que foram sacrificados três ou sete dias após a lesão por perfusão intracardíaca, conforme mostrado aqui.A compressão da medula espinhal produz lesões com epicentro no local da compressão, e os efeitos da lesão se estendem por vários milímetros nas direções rostral e caudal. Esta figura mostra que a gravidade das lesões aumentou à medida que a distância entre os espaçadores diminuiu. Por exemplo, as compressões nos pontos de 25 milímetros e 35 milímetros produziram uma cavidade não observada no modelo de 55 milímetros; três dias após a compressão, havia sangue no epicentro da lesão e nas regiões circundantes, o qual não estava presente sete dias após a lesão. Após sete dias, a substância branca dorsal e ventral diminuiu significativamente em tamanho no epicentro.A organização da substância cinzenta estava altamente distorcida e a cavitação era persistente, conforme previamente demonstrado; a arquitetura citotécnica se traduz em alterações motoras e sensoriais no comportamento animal, avaliadas pela escala de movimentação de camundongo besso para função locomotora, e pelos testes do fio de von Frey e do cloreto de etila para função sensorial. Após este procedimento, é possível realizar métodos adicionais, como o transplante direto de células ou a injeção de outros reagentes terapêuticos na medula espinhal, para responder perguntas adicionais, como se essa terapia específica pode melhorar o resultado após lesão medular.

calibrated-forceps-model-of-spinal-cord-compression-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma maneira confiável e repetível para produzir uma lesão da medula espinhal cervical unilateral utilizando o pêndulo horizonte infinito é descrito. O método leva vantagem de um quadro projetado e grampo para estabilizar a coluna. O procedimento padronizado e biomecânica lesão os parâmetros resultam em lesões suficientes e sustentados.

Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

Fonte: Elzat, E. Y. Y., et al., Estabelecendo um modelo de lesão medular por contusão em camundongos com base em uma técnica minimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra o método para induzir uma lesão de contusão na medula espinhal no nível T9 em um modelo de camundongo, usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal. Um peso é colocado na medula espinhal de nível T9 que cria uma contusão que causa imediatamente descoloração e inchaço do tecido.

Induzindo uma contusão da medula espinhal em um modelo de camundongo usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal

Fonte: Zheng, W. et. al., Ressonância Magnética por Tensor de Difusão na Compressão Crônica da Medula Espinhal. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a imagem do tensor de difusão na avaliação da compressão crônica da medula espinhal. Ao analisar os padrões de difusão da água, anisotropia fracionada e valores do coeficiente de difusão aparente, os achados revelam danos axonais em regiões comprimidas. As descobertas fornecem informações críticas sobre a patologia da medula espinhal e a...

Avaliação da compressão da medula espinhal usando imagens por tensor de difusão

Um modelo de contusão grave lesão da medula espinhal é descrito. As etapas detalhadas no pré-operatório, operatório e pós-operatório são descritos para obter um modelo consistente.

Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos

Estabilização vertebral é necessário para minimizar a variabilidade, e para a produção de lesões da medula espinhal experimentais consistentes. Utilizando um aparelho de estabilização personalizado em conjunto com o dispositivo de pêndulo NYU / MASCIS, demonstramos aqui o equipamento e procedimento adequado para gerar cervical (C5) lesões na espinal hemi-contundente reprodutíveis medula em ratos adultos.

Um método de estabilização Novel Vertebral para a Produção de contusão Lesão Medular

Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Apresentamos um modelo de lesão medular contundente baseado em deslocamento de tecido que pode produzir uma lesão contundente consistente da medula espinhal em camundongos adultos.

Um Modelo de Lesão Medular Contusiva Baseado em Cilindrada de Tecidos em Ratos

Técnicas minimamente invasivas e um simples dispositivo laboratorial melhoram a reprodutibilidade do modelo de lesão medular, reduzindo os danos operatórios aos animais experimentais e permitindo a manutenção da morfologia anatômica. O método vale a pena porque os resultados confiáveis e o procedimento reprodutível facilitam as investigações dos mecanismos de reparação da doença.

Estabelecendo um Modelo de Lesão da Medula Espinhal por Contusão de Camundongo Baseado em uma Técnica Minimamente Invasiva

O presente protocolo simulando a síndrome da medula central (SCC) em camundongos melhorou a repetibilidade e minimizou os danos operacionais aos animais experimentais, evitando a ruptura excessiva da estrutura anatômica. A estratégia deste estudo é vantajosa, pois permite a pesquisa dos mecanismos de lesão ao produzir resultados consistentes.

Estabelecimento do Modelo de Síndrome do Cordão Central em Camundongos C57BL/6J

Apresentamos aqui um novo dispositivo de contusão de lesão medular automatizada para camundongos, que pode produzir com precisão modelos de contusão de lesão medular com diferentes graus.

Impactor Automatizado para Modelo de Lesão Medular Contusão em Camundongos

Aprenda a criar lesões por compressão na medula espinhal em camundongos usando pinças calibradas. Este protocolo cirúrgico padronizado garante reprodutibilidade em modelos de trauma medular para pesquisa em neurociência.

Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

Explorar mais vídeos