Name: Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Aprenda a investigar a propagação e toxicidade de proteínas prion-like usando o organismo modelo C. elegans. Este método emprega microscopia de fluorescência time-lapse e triagem RNAi para identificar modificadores da toxicidade celular.

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Agradecemos a Cindy Voisine e Yoko Shibata pela discussão útil e comentários críticos sobre o manuscrito. Agradecemos ao Laboratório de Análise de Alto Rendimento (HTAL) e ao Biological Imaging Facility (BIF) da Northwestern University por sua assistência. Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (NIGMS, NIA, NINDS), da Fundação Médica Ellison e da Fundação Daniel F. e Ada L. Rice (para R.I.M.). C.I.N.-K. foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo 47. <ol><li> Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a microinjeção 48. Para mais detalhes e métodos que descrevem como integrar estas linhas extracromossómicos, consulte 49. </li><li> Prepare populações sincronizadas por colocação de ovo ou branqueamento de acordo com métodos padronizados 50. <ol><li> Sincronização de postura de ovos <ol><li> Transferência de 10-20 adultos grávidas em um prato e deixe que eles põem ovos por 1-2 horas. Remover adultos a partir da placa e deixar a crescer até a progenitura idade desejada. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronização por branqueamento <ol><li> Recolha uma população de adultos grávidos não sincronizado e branquear com uma solução de hipoclorito alcalino (NaOH a 250 mM e 1: 4 (v / v) diluição da lixívia comercial em H 2 O). Lavar os ovos duas vezes (218 xg durante 1 min) com tampão M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO · 4 7H 2 O, adicionar dH2O até 1 L). </li><li> Permita-lhes a eclodir em tampão M9 com suave agitação O / N a 20 ° C. Desenvolvimento verme vai prender na fase L1 na ausência de uma fonte de alimento, deixando uma população sincronizada. Transfira para L1s fresco nematóides Crescimento Media (NGM) placas semeadas com OP50 E. coli bactérias e deixar a prole se desenvolver até a idade desejada 47. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare 2% almofadas de agarose (em H 2 O) em uma lâmina de microscópio como descrito 50. <ol><li> Prepare dois microscope com lâminas de fita de rotulagem colocados ao longo de todo o seu comprimento para ser usado como espaçadores. Colocar uma terceira lâmina de microscópio entre eles. </li><li> Dissolve-se 2% de agarose em H 2 O e uma pipeta de queda sobre a lâmina limpa. </li><li> Coloque uma quarta corrediça perpendicular aos outros três lâminas sobre o topo da gota de agar. Pressione levemente para baixo para achatar a almofada para a mesma espessura que a fita de rotulagem. </li><li> Deixe secar por 1 min antes de retirar os espaçadores e puxando os slides separados. A almofada de agar vai ficar com um deles. </li></ol></li><li> Pipeta ~ 10 ul anestésico (2 levamisol mM em tampão M9) para a almofada de transferência e ~ 10 animais utilizando-se uma escolha de fio de platina. Cubra com uma lamela (~ 22 x 22 mm) e tirar fotos dentro de 1 hora. </li><li> Alternativamente, para adquirir os filmes ao longo de um longo período de tempo ou para reduzir ainda mais a possibilidade de uma deslocação dos animais, usar uma combinação de anestésico e talão de imobilização 51. <ol><li> Prepare 10% agaalmofadas aumentou (em tampão M9), conforme descrito 51 e adicionar minhocas a 3 ul solução padrões de tamanho nanosphere (esferas de poliestireno, 100 nm), mais 3 anestésicos ul (4 levamisol mM em tampão M9). Cubra delicadamente com uma lamela. Para evitar a desidratação, selar a lamínula com valap (mistura de quantidades iguais de vaselina, lanolina e cera de parafina). </li></ol></li><li> Imagem vermes imobilizada utilizando um microscópio confocal. Nota: Os resultados são obtidos utilizando um disco giratório AF confocal microscópio equipado com uma câmera de EM-CCD e um Software Microscopia Automação e Análise de Imagem, como MetaMorph e delinear os detalhes abaixo, mas outros sistemas de imagem confocal comparável também pode ser usado. <ol><li> Use o objetivo de óleo 63X ou 100X / 1.4NA e coloque a lâmina de microscópio contendo vermes no suporte da lâmina de microscópio. </li><li> Abra o software. Ajuste de potência do laser e filtros para MRFP imagem. Use o laser 561 nm a 10% de energia e emissão de filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Open &quot;MultiDimensional Aquisição&quot;. Na aba &quot;Main&quot;, marque as caixas de &quot;Timelapse&quot; e &quot;Run Journals&quot; (Hardware Auto Foco: off). </li><li> Sob a guia &quot;Saving&quot; selecionar ou criar a pasta do diretório onde os arquivos devem ser salvos. Atribua um nome para o arquivo. </li><li> No separador &quot;Comprimento de onda&quot;, selecione a iluminação adequada e ajustar a exposição e ganho. Use &quot;YokoQuad Red&quot; (ou uma configuração de iluminação equivalente para MRFP de imagem) com uma exposição de entre 100 e 300 ms e um ganho da câmera entre 100 e 300, dependendo da amostra individual (avaliada usando a imagem ao vivo). </li><li> No separador &quot;Timelapse&quot; selecionar &quot;Número de pontos de tempo&quot; = 301, &quot;Duração&quot; = 5 min e &quot;Time / Interval&quot; = 1 seg. </li><li> Sob a &quot;Journals&quot; tab selecione Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; e &quot;AFC Return to Z HOLD&quot;, Tipo: &amp;# 8220; Special &quot;(duas vezes), Ponto inicial:&quot; Inicio do horário de ponto &quot;e&quot; Fim do ponto de tempo &quot;. Esta opção de focagem automática é importante para a imagem da mesma secção ao longo de um período mais longo de tempo. </li><li> Quando a instalação for concluída, pressione &quot;Adquirir&quot;. O vídeo timelapse é safed como arquivos TIFF separados. </li><li> Abra todas ficheiros.tiff de uma determinada série tempo em ImageJ. Vá em &quot;Imagem&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Imagens para Stacks&quot;. Opcionalmente, ajustar brilho e contraste, adicionar bar tamanho, etc. Exportar o filme em &quot;File&quot; → &quot;salvar como&quot; → &quot;AVI ...&quot; (por exemplo, ver vídeo 1 e 2 correspondente à Figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Usando dobráveis ​​Sensores e Repórteres de estresse para Investigar celular autónomos e não celular Autónoma afeta em Proteostase e Toxicidade <ol><li> Gerar linhagens transgênicas que co-expressar um sensor de dobragem ou estresse reporter em conjunto com a proteína prião semelhante. Para os métodos sobre como estabelecer cruzes ou gerar linhagens transgênicas, ver 48,49,52. Ver Tabela 1 para uma lista de C. elegans estirpes que podem ser utilizadas. </li><li> Prepare populações sincronizados de animais transgênicos e cultivá-las até a idade desejada, conforme descrito acima (seção 1.2) 50. </li><li> Usando um microscópio estereoscópico, examinar o respectivo fenótipo do sensor de dobragem ou estresse repórter. <ol><li> Para o sensor de dobragem, determina o número de animais que albergam agregados em cada dia depois da sincronização (por exemplo, ver Figura 2E e F). </li><li> Para o repórter tensão, se o ensaio de co-expressão dos resultados priões do tipo de proteína em uma fluorescência aumentada do repórter (para um exemplo, ver Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Tela Genome-wide para Repressão de toxicidade induzida por Prion em C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Representação esquemática do protocolo de triagem RNAi. Consulte a seção de protocolo 3 para uma descrição detalhada das etapas individuais. <ol><li> Sincronização de C. vermes elegans e duplicação de biblioteca RNAi <ol><li> Para a tela de RNAi, usar a biblioteca Ahringer RNAi (ou a biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray a biblioteca de RNAi do original 384 formato bem em placas de 96 poços, preenchendo as placas com 100 ul meio LB-amp (50 ug / ml de ampicilina em LB) suplementado com 10% de glicerol e inocular utilizando um replicador de 96 pinos. Crescer a 37 ° CO / N com agitação e armazenar a -80 ° C. </li><li> Manter C. linhagens transgênicas em 20 ° C em placas NGM elegans WT e semeado com OP50 E. bactérias coli de acordo com métodos padrão 47. </li><li>Sincronize transgênico domínio prion e WT (controle) nematóides pelo branqueamento (ver secção 1.2). </li><li> No mesmo dia em que os vermes são branqueados, preparar meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina. Usar um dispensador automático para distribuir o reagente (ou pipeta manualmente) 65 ul dos meios LB-amp em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Retirar 96 poços placas biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C e trazê-los para um capuz estéril forrado com papel toalha. Remover imediatamente o selo-tape, segurando a placa de cabeça para baixo, enquanto as placas ainda estão congelados, tendo o cuidado para evitar a contaminação de gelo do lado de fora das placas. Reinverter as placas e deixá-los descongelar por cerca de 30 min. </li><li> Mergulhe uma estéril 96 pin replicador em uma placa de RNAi biblioteca, e, em seguida, em uma placa de LB-amp fresco. Use um replicador estéril nova para cada prato. Vede todas as placas com fita adesiva e papel alumínio retornar as placas da biblioteca para -80 ° C. Os replicadores pode ser embebido em água sanitária, enxaguado,e autoclavado para ser usado novamente. </li><li> Permitir placas duplicadas de ARNi para crescer O / N em uma incubadora ajustada a 37 ° C e 300 rpm. Para usar HT115 E. coli bactérias que albergam o vector vazio (L4440) como um controlo, crescem-lo separadamente num tubo de cultura e, em seguida, pipeta 65 ul da cultura com uma pipeta de canais múltiplos dentro de um quarto de duas placas de 96 poços. </li></ol></li><li> A indução da produção bacteriana ARNcd e adição de vermes <ol><li> Dilui-Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) para uma concentração de 5 mM em ddH 2 O. Utilize uma estação de trabalho automatizada com uma cabeça para dispensar múltiplos canais (ou pipeta manualmente) 10 ul de IPTG diluída em todos os poços das bactérias RNAi e as placas de controlo. Voltar a vedar e colocar as placas de novo na incubadora. Deixá-los agitar durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Enquanto as bactérias estão tremendo, preparar os vermes. Misture a suspensão M9 / verme bem, e pipetar uma pequena amostra (~ 5 - 10 ul) para uma lâmina de microscópio de vidro. Contaro número de vermes sob microscópio estereoscópico e calcular o número de vermes por ul. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, preparar uma solução de M9 suplementado (M9 +) com as seguintes concentrações finais: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 ug / ml de colesterol, 50 ug / ml de ampicilina, 9,6 ug / ml de tetraciclina, 0,0835 ug / ml de Fungizone, e 15 vermes por 50 ul. <ol><li> Faça soluções separadas para transgênica domínio prion e vermes WT. O volume final da solução verme M9 + necessária irá depender do número de placas de ARNi copiados (ver abaixo), além de ~ 30 ml de volume morto que vai permanecer no reservatório, se um distribuidor automático é usado. </li></ol></li><li> Após a indução de 3 horas de produção dsRNA bacteriana, tirar as placas fora da incubadora e deixe-os arrefecer à RT (~ 30 min) para evitar calor perturbar os animais. </li><li> Dispensar 50 ul de domínio de prião solução verme transgénico M9 + para cada poço das placas de ARNi e uma das placas de controlo do vector vazio. FazerCertifique-se de misturar a solução verme antes de cada passo como os animais tendem a sedimentar para o fundo do reservatório. </li><li> Dispensar vermes WT para a segunda placa de controle. Deixar as placas não vedadas para permitir o arejamento. Para manter a cultura líquido evapore, empilhe 4-5 placas juntos e enrole com uma toalha de papel úmido e papel alumínio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 dias. </li></ol></li><li> Scoring NOTA: Após 4 dias na incubadora, os vermes estará no segundo dia de vida adulta e estão prontos para o rastreio. Deixe os animais se adaptar às condições não agitam durante 30 minutos antes de triagem para garantir surra sem serem incomodados. <ol><li> Usando uma câmara Falcon 4M60 ligado a um computador com um monitor, para o aumento da tela visualmente debulha, em comparação com o domínio de prião animais transgénicos de controlo tratados. </li><li> Compilar uma lista de visitas preliminares para confirmar usando wrMTrck (veja a próxima seção). </li></ol></li></ol> 4. Confirmação da PreliminarBatida de tela <ol><li> Ensaio de motilidade em placas sólidas <ol><li> Preparar placas com NGM suplementadas com 100 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de tetraciclina e 1 mM de IPTG, de acordo com métodos padrão 47. Se possível, use uma máquina de despejar placa para assegurar todas as placas têm a mesma altura dos meios de comunicação, o que permitirá um processo de aquisição de vídeo mais simplificado. </li><li> Crescer as diferentes clones de ARNi em ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C e 250 rpm. </li><li> No dia seguinte, induzir a expressão do ARNcd com IPTG 1 mM durante 3 h. Semente as placas com 150 mL de cada clone bacteriano RNAi, distribuídos em uma camada fina. Deixe as bactérias secas durante 2 dias à TA no escuro. Prepare 3 placas por RNAi clone. </li><li> Sincronize a população sem-fim por branqueamento de acordo com métodos padronizados 50 (ver secção 1.2), e deixe os ovos eclodem O / N em M9 mídia. </li><li> Tomar uma amostra da suspensão verme e determinar a quantidade de NEMatodes por ul no microscópio estereoscópico. Em seguida, pipetar o volume adequado de meio M9 mais vermes em cada placa experimental de modo que contenha 25 - 30 vermes L1. Crescer as nemátodos a 20 ° C durante 4 dias até que os vermes atingir dia 2 da fase adulta. </li></ol></li><li> A análise quantitativa da motilidade verme com o plugin wrMTrck para ImageJ NOTA: Os vídeos foram gravados usando um microscópio estereoscópico com aumento de 10x com um Hamamatsu Orca-R2 câmera digital C10600-10B eo software PCI imaging Simples Hamamatsu. <ol><li> Ligue a câmera eo software PCI imagem simples. Clique em &quot;Live&quot; para permitir o ajuste das condições de imagem. </li><li> Configurar as condições de vídeo como se segue: Ganho = 0; Modo Luz = alta; Índice de Velocidade = 1; Binning = 2. Clique em &quot;Auto Exposé&quot; e, em seguida, ajustar as condições de iluminação, movendo-se os espelhos microscópio e do brilho e contraste mostradores. NOTA: O vídeo precisa ter um alto contraste sem ser OVEREXPosed, de modo que os animais aparecem como formas pretas em um fundo brilhante. </li><li> Clique em &quot;Scan Time&quot; e escolha uma pasta e um nome de arquivo. Defina &quot;Campo Delay&quot; para 20 ms e &quot;Pare no Time&quot; a 30 seg. Pressione &quot;Review Live&quot;, a fim de escolher a área da chapa para gravar (onde a maioria dos worms são). Toque na placa 3 ou 4 vezes no palco, rapidamente confirmar a sua posição no campo de visão e pressione &quot;Start&quot;. </li><li> Depois que o filme termina de gravar, clique direito sobre a imagem e escolha &quot;Exportar Montage Sequence&quot; para exportar o filme a partir de um formato .cxd a um .avi. </li></ol></li><li> Analisando os vídeos de motilidade <ol><li> Abra o software ImageJ, vá para a aba &quot;Plugins&quot; e depois em &quot;wrmtrck&quot; e selecione &quot;Batch wrMTrck&quot;. Selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados. </li><li> Na janela de entrada principal do wrMTrck_Batch, carregar os valores de entrada, conforme detalhado na Figure 5C. Explicação para cada um dos parâmetros podem ser encontradas no manual de instruções que acompanham o plugin. Clique em &quot;OK&quot; e deixar a análise do movimento de execução. </li><li> Para a curadoria os resultados e confirmar que todas as faixas detectadas são de real C. elegans e eliminar artefatos, abra cada um dos arquivos .txt criados para cada filme e copiar as informações em um arquivo de software de análise de dados. Abra o &quot;* _labels.zip&quot; arquivos criados e executar o que resulta &quot;* _labels.tif&quot; para verificar e eliminar faixas vermes falsos manualmente. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos 40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína tem de ser marcado com...

Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais 1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP Sc 2,3. Agregados de proteína auto-propagação também foram identificados em fungos, que partilham características importantes de mamíferos com priões 4,5. Além disso, os priões mamíferos são capazes de mover a partir de célula-a-célula e infectar células naive 6,7. Enquanto EPM other do TSE não são infecciosos, eles compartilham um princípio patogênico comum com doenças de príon 8,9. Embora as proteínas ligadas a cada um dos EPM não estão relacionados em termos de estrutura ou função, eles todos formam agregados por meio de um processo de cristalização, chamado nucleada ou semeada de polimerização; Além disso sementes proteicos crescer através do recrutamento de suas isoformas solúveis 2,10,11. A eficiência para a auto-propagam in vivo varia, dependendo das propriedades intrínsecas da proteína, que, em conjunto com factores celulares adicionais, tais como as chaperonas moleculares, em última análise determinam as taxas de nucleação agregado, a sementeira, a fragmentação e espalhamento 12-15. Por isso, deve haver um bom equilíbrio entre esses fatores que permite a propagação eficiente de agregação de proteínas. Isso também pode explicar por que apenas alguns agregados amiloidogénicas abrigar as características de um prião, e, assim, nem todos os EPM são infecciosas. Os príons parecem representar o &#39;top-performers&#39;fa amplo espectro de agregados proteicos de auto-replicação, o que os torna uma ferramenta poderosa para estudar EPM 8,13. Curiosamente, a toxicidade associada com agregados relacionados com a doença muitas vezes tem um componente autônomo não célula 16,17. Isto significa que eles afectam as células vizinhas que não expressam o gene correspondente, em contraste com um efeito estritamente autónoma célula, o que implica que apenas as células que expressam o gene exibem o fenótipo específico. Este foi convincentemente demonstrada pela expressão específica de tecido ou derrubar das respectivas proteínas em vários modelos de doenças neurodegenerativas 18-26. Vários mecanismos têm sido sugeridos como uma base para esta não-toxicidade celular autônomo na EPM, incluindo o fornecimento de nutrientes diminuído, o desequilíbrio na sinalização neuronal, excitotoxicidade do glutamato, e neuroinflammation 16,27,28. Além disso, um movimento de prião semelhante de agregados ligados de doenças entre as células might contribuir para este aspecto 29,30. Uma evidência crescente sugere que outras inclusões de proteína que pode transmitir priões a partir de célula-para-célula, o que pode explicar a característica de difusão na patologia observada em muitos EPM 30-36. No entanto, ele ainda não foi determinado se há um claro nexo de causalidade entre o movimento intercelular de proteínas doença eo efeito tóxico sobre as células vizinhas. Por conseguinte, um melhor entendimento das vias celulares que estão subjacentes a transmissão célula-a-célula e célula não autónomo toxicidade é necessária e essencial para o desenvolvimento de novas terapias. No entanto, muitos aspectos do prião como espalhando-celulares e factores que influenciam a transmissão célula a célula de proteínas mal enroladas em metazoários não são bem compreendidos, em particular ao nível dos organismos. O nemátodo Caenorhabditis elegans tem várias vantagens que oferecem o potencial de descobrir novas facetas de spreadi prion-likeng em metazoans 17. É transparente, permitindo a rastrear in vivo de proteínas marcadas fluorescentemente no organismo vivo. Além disso, muitos processos celulares e fisiológicas afectadas pela doença são conservados de vermes para a saúde humana, e C. elegans é também susceptível a uma grande variedade de manipulações genéticas e análises moleculares e bioquímicos 37-39. Exatamente 959 células somáticas compõem o hermafrodita adulto com um plano corporal simples, que ainda tem vários tipos de tecidos diferentes, incluindo músculos, neurônios e intestino. Para estabelecer um novo modelo de príon em C. elegans, que escolheu para expressar exogenamente a glutamina bem caracterizada / asparagina (Q / N) rico em prião NM domínio do cytosolic proteína de levedura prion Sup35, já que não há proteínas príon endógenas conhecidas em vermes 4,40. Prions levedura foram inestimáveis ​​para elucidar os mecanismos básicos de prion replicação 41-44. Além disso, NM é o abetoproteína prião como citosólica-r que tem sido mostrado para recapitular o ciclo de vida completo de um prião em cultura de células de mamífero 45,46. Da mesma forma, quando expresso em C. elegans, o domínio prion Sup35 adotado muito bem com as diferentes necessidades para propagação em células metazoários em comparação com células de levedura e principais características expostas da biologia prion agregação 40. NM foi associada com um fenótipo tóxico profunda, incluindo a ruptura da integridade mitocondrial e aparecimento de várias vesículas autofagia relacionados sobre o nível celular, bem como prisão embrionário e larval, atraso do desenvolvimento, e uma perturbação generalizada do ambiente dobramento de proteínas ao nível do organismo. Surpreendentemente, o domínio príon celular apresenta toxicidade autônoma e não autônomos celular, afetando tecidos vizinhos em que o transgene não foi expressa. Além disso, o transporte vesicular do domínio prião dentro e entre as células é monitorado em tempo real &lt;em&gt; in vivo 40. Aqui nós descrevemos como examinar divulgação prion-like em C. elegans. Vamos explicar como monitorar o transporte intra e intercelular de vesículas contendo o domínio prion usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Vamos enfatizar o uso de sensores de dobradura de tecidos específicos e universalmente expressa repórteres de estresse para avaliar Cell efeitos autônomos autónomos e não sobre fitness celular. Finalmente, vamos descrever o procedimento de uma grande tela recentemente realizada genoma RNA de interferência (RNAi) para identificar novos modificadores de toxicidade induzida por prion. Em conjunto, estes métodos podem ajudar a provocar uma separação de caminhos genéticos envolvidos no movimento intercelular de proteínas e sua toxicidade autónoma non celular.

<table><tbody>Padrões de tamanho de nanoesferas de <tr><td>reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi library</td><td>Fonte: BioScience LifeSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Refrigerada Sorvall Legend XTR, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>Replicador de 96 pinos&nbsp;</td><td>Scionomix&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>Agitador de incubação de alta capacidade HiGro&nbsp;</td><td></td>Dispensador de Reagentes Combi <td>Multidrop Digilab</td><td></td> http://www.digilabglobal.com/higro</tr><tr><td></td>Estação de Trabalho Automatizada <td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Shaker Innova44</td><td>New Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& ação=produtos& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDicidade CCD</td> digital <td>Câmera Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>Spinning Disc AF Microscópio Confocal&nbsp;</td><td>Câmera Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Falcon 4M60&nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopia Automação & Software de Análise de Imagem</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu Software de Análise de Imagem SimplePCI</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>wrPlugin MTrck para ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>Laboratório <td></td><td>Morimoto</td><td>disponível em nosso laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>Consulte a tabela 1 para obter uma fonte para deformações</td><td></td><td></td><td></td> do sensor dobrável e do repórter de estresse</tr></tbody></table>

investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o metazoan organismo modelo<em&gt; c. elegans</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions são partículas proteicas não convencionais de autopropagação, desprovidas de qualquer ácido nucleico codificador. Essas sementes proteicas servem como modelos para a conversão e replicação de sua isoforma celular benigna. Evidências acumuladas sugerem que muitos agregados de proteínas podem atuar como modelos de autopropagação e corromper o dobramento de proteínas cognatas. Embora os agregados possam ser funcionais sob certas circunstâncias, esse processo geralmente leva à interrupção da homeostase da proteína celular (proteostase), levando a doenças devastadoras, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs). Os mecanismos exatos de propagação de príons e disseminação célula a célula de agregados proteicos ainda são objetos de intensa investigação. Para aprofundar esse conhecimento, recentemente foi estabelecido um novo modelo de metazoário em Caenorhabditis elegans, para expressão do domínio príon da proteína príon de levedura citosólica Sup35. Este modelo de príon oferece várias vantagens, pois permite o monitoramento direto do domínio do príon marcado com fluorescência em animais vivos e facilidade de abordagens genéticas. Aqui são descritos métodos para estudar o comportamento semelhante ao príon de agregados de proteínas e para identificar modificadores de toxicidade induzida por príons usando C. elegans.

Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de dentro do organism...

A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é examinar a disseminação e a toxicidade complexa de proteínas semelhantes a PreOn usando o organismo modelo Metazoário C elegance. Isso é obtido monitorando o transporte intra e intracelular de vesículas contendo a proteína do tipo PreOn, usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Em seguida, sensores de dobramento específicos do tecido e estresse expresso de forma onipresente.Os repórteres são usados para avaliar os efeitos autônomos e não celulares na aptidão celular. Em seguida, uma triagem de RNAi em todo o genoma é realizada para identificar novos modificadores da toxicidade induzida por PreOn. A triagem é realizada em cultura líquida usando thrashing como leitura de toxicidade.Finalmente, rastreador de worm, Um plugin para a imagem J é usado para quantificar o movimento da elegância C em combinação. Esses métodos permitem separar as vias genéticas envolvidas no movimento intercelular de proteínas semelhantes a PreOn e sua toxicidade autônoma não celular. Depois de preparar o controle sincronizado de elegância do mar e as linhas transgênicas de domínio PreOn e almofadas 10% agros, de acordo com o protocolo de texto que acompanha, pipete três microlitros de 100 nanogramas de esferas de poliestireno e três microlitros de quatro limassol milimolares na almofada agros.Usando um fio de platina, transfira vermes na idade desejada de uma placa para a solução e use uma lamínula para cobrir a imagem dos vermes no nível subcelular. Coloque uma lâmina no suporte da lâmina do microscópio de um microscópio confocal e use uma objetiva de óleo de 63 x ou 100 x 1.4 NA. Em seguida, abra METAMORPH e selecione aquisição multidimensional.E na guia principal, marque as caixas para lapso de tempo e executar diários. Na guia de salvamento, selecione ou crie a pasta de diretório para salvar files e atribua um nome ao file Na guia de comprimento de onda, use Yoko quad red ou uma iluminação equivalente de imagem MRFP e ajuste a exposição entre 100 e 300 milissegundos e o ganho da câmera para entre 100 e 300. Em seguida, na guia de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para um segundo, a duração para cinco minutos e o número de pontos de tempo para 301.Na guia diários. Para o diário, selecione Um conjunto de FC, Z hold e A FC retornam ao Z hold para o tipo select special duas vezes e, para o ponto inicial, selecione o início do ponto de tempo e o fim do ponto de tempo. Quando a configuração estiver concluída, pressione adquirir Seguindo este procedimento, outros métodos, como aplicativos de rastreamento de partículas, podem ser usados para medir as propriedades dinâmicas do debate.Depois de sincronizar o domínio do príon transgênico e enquanto nematóides do tipo e copiar as placas da biblioteca de RNAI inger de acordo com o protocolo de texto, incubar placas de RNAi duplicadas a 37 graus Celsius e 300 RPM para usar HT uma bactéria 15 E coli que abriga o vetor vazio L 4 4 4 0 como controle. Cultive-o separadamente em um tubo de cultura e, em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir 65 microlitros da cultura para um quarto dos poços de 2 96. Placas de poço com uma estação de trabalho automatizada contendo uma cabeça multicanal dispensada.10 microlitros de cinco, milimolar de IPTG diluído em cada poço das bactérias RNAi e placas de controle. Feche novamente antes de incubá-los por três horas enquanto as bactérias estão incubando. Misture o controle sincronizado do tipo selvagem e as larvas transgênicas de L um e M nove tamponam bem e pipetem de cinco a 10 microlitros em um microscópio de vidro.Deslize a contagem dos vermes e calcule o número de vermes por microlitro. Após a incubação bacteriana de três horas, remova as placas da incubadora e deixe-as atingir a temperatura ambiente para evitar que o calor estresse os vermes. Em seguida, suplemente o tampão M nove com colesterol IPTG e antibióticos de acordo com o protocolo de texto.E adicione o volume apropriado de solução de verme transgênico de domínio PreOn a uma concentração final de 15 vermes por mistura de microlitro para distribuir uniformemente. Em seguida, dispense 50 microlitros em cada poço das placas de RNAi e nos poços de uma das placas de controle de vetores vazias. Dispense a solução de verme do tipo selvagem na segunda placa de controle.Em seguida, deixe todas as placas sem lacre para permitir a aeração e evitar que a cultura líquida evapore, empilhando quatro a cinco placas juntas, envolvendo-as com uma toalha de papel úmida seguida de papel alumínio. Incube as placas a 20 graus Celsius e 200 RPM por quatro dias. Para as placas, use uma câmera Falcon four M 60 conectada a um computador com um monitor para rastrear visualmente o aumento da surra em comparação com animais transgênicos de domínio PreOn tratados com controle.A principal vantagem de usar uma estação de trabalho automatizada de manuseio de líquidos para dispensar os vermes nas placas de RNAi R é que isso reduz muito a variabilidade e o número de vermes por poço. Para realizar um ensaio de motilidade em placas sólidas e validar clones de RNAi candidatos, cultive bactérias de RNAi durante a noite de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use um IPTG milimolar para induzir a expressão do RNA DS por três horas.Use 150 microlitros de cada clone bacteriano de RNAi para semear placas NGM previamente preparadas, espalhando-se em uma camada fina. Deixe as bactérias secarem por dois dias em temperatura ambiente no escuro sob um microscópio estéreo. Determine a quantidade de vermes sincronizados e suspensão conforme descrito anteriormente e adicione 25 a 30 L de uma larva em cada placa experimental.Incube os nematóides a 20 graus Celsius por quatro dias até que os vermes cheguem. Segundo dia da idade adulta para quantificar a motilidade do verme, ligue a câmera e o software de imagem PCI simples. Clique no ícone da câmera para ativar o ajuste das condições de imagem.Em seguida, configure a condição de imagem da seguinte maneira. Defina o ganho para zero, o modo de luz para alta velocidade, o índice para um e o binning para dois. Em seguida, clique em expor ao vivo e automaticamente e ajuste as condições de iluminação movendo os espelhos do microscópio e os mostradores de brilho e contraste.Clique no tempo, digitalize e digite uma pasta e um nome de arquivo, defina o atraso do campo para 20 milissegundos e pare no tempo para 30 segundos. Pressione revisão ao vivo para escolher a área da placa a ser gravada. Em seguida, bata no prato três ou quatro vezes no palco.Confirme rapidamente a sua posição no campo de visão e prima iniciar após a gravação do filme terminar de gravar, clique com o botão direito do rato na imagem e escolha exportar sequência de montagem para exportar o filme de um formato CXD para um ficheiro A VI. Para analisar os vídeos de motilidade, abra a imagem J, escolha a guia de plug-ins, escolha o rastreador de worm e selecione o lote do Worm Tracker e selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados na janela de entrada principal do Worm Tracker, carregue em lote os valores de entrada conforme detalhado aqui. Uma explicação para cada um dos parâmetros pode ser encontrada nas instruções que acompanham o plugin.Clique em OK e permita que a análise de movimento seja executada. Finalmente, para selecionar os resultados, confirme se todas as pegadas detectadas são da elegância real do mar e elimine os artefatos. Abra os arquivos TXT criados para cada filme e copie as informações para um arquivo de software de análise de dados.Abra os arquivos zip de rótulos criados e execute os rótulos TIFF resultantes para verificar e eliminar manualmente os rastros de worms falsos. Yesper Peterson, um ex-pós-doutorado no laboratório, teve a ideia do rastreador de vermes como um substituto para nossa avaliação manual do CL Elegance motil, que é uma leitura de toxicidade. O rastreador de worms nos permite fazer esses experimentos de maneira automatizada, sem viés do usuário, enquanto avaliamos mais condições em um período de tempo mais curto usando imagens de lapso de tempo.A RFP marcada com R dois E dois, que se acumula em vesículas tubulares foi vista transportada dentro e entre as células por coex expressando um sensor dobrável ou repórter de estresse. Juntamente com a célula proteica PreOn, os efeitos autônomos e não celulares podem ser avaliados. A expressão de R dois E dois nas células musculares leva a um início mais precoce da agregação de Q 44 no intestino, revelando que R dois E dois tem efeitos autônomos não celulares na co-expressão de proteostase de R dois E dois Com o SOD três PGFP Repórter de estresse oxidativo transcricional leva à regulação positiva do repórter em diferentes tecidos, demonstrando que o domínio PreOn induz uma resposta ao estresse oxidativo não celular de forma autônoma seguindo toda a triagem do genoma.Este filme demonstra que a imagem e a visualização de alta resolução na tela do computador permitem a triagem de um quarto de uma placa simultaneamente Uma vez dominado, esse protocolo de triagem pode ser feito em 12 rodadas de 25 placas por sessão. Se duas sessões forem realizadas por semana, toda a biblioteca de RNAi pode ser rastreada em seis semanas. O rastreador de minhocas foi usado para quantificar a motilidade da elegância C, como visto aqui.O Worm Tracker converte um vídeo original em um formato binário e cada worm recebe uma faixa. Os vídeos processados podem ser visualizados com faixas sobrepostas para eliminar manualmente quaisquer artefatos. O parâmetro de comprimentos de corpo por segundo é normalizado para possíveis diferenças de tamanho. Nematóides.Este método identificou 35 supressores de toxicidade induzida por PreOn que aumentaram o fenótipo de motilidade para pelo menos 133% e até 256% em comparação com vermes tratados com controle. Ao alugar o rastreador de worms, é importante lembrar de verificar manualmente os rastros de worms obtidos. O software faz um ótimo trabalho na identificação dos vermes, mas às vezes o fundo ainda pode ser identificado erroneamente como um animal.Portanto, lembre-se de verificar seus vídeos depois de executar o rastreador de worms neles. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas, como se uma determinada proteína de ligação à doença é capaz de se espalhar de célula para célula, prença semelhante, ou se existe uma ligação entre a transmissão intercelular e a toxicidade complexa dessas proteínas. Garotada.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Este vídeo demonstra o procedimento para imagens in vivo de C. elegans expressando proteínas semelhantes a príons marcadas com proteína fluorescente vermelha. O protocolo envolve a imobilização de nematóides em uma almofada de agarose para microscopia confocal de lapso de tempo, revelando agregação e transporte de proteínas dentro e entre as células. Essa técnica é crucial para o estudo da agregação de proteínas relacionadas a doenças neurodegenerativas.

Imagens de lapso de tempo para monitorar a disseminação transcelular de proteínas semelhantes a príons em nematóides transgênicos

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as atividades neuroprotetoras de compostos de teste em Caenorhabditis elegans, incluindo agregação de poliglutamina, morte neuronal e comportamento de quimioavoidance, bem como uma integração exemplar de fenômenos múltiplos.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

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Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Aprenda a investigar a propagação e toxicidade de proteínas prion-like usando o organismo modelo C. elegans. Este método emprega microscopia de fluorescência time-lapse e triagem RNAi para identificar modificadores da toxicidade celular.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo

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