Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo

O objetivo geral dos experimentos a seguir é examinar a disseminação e a toxicidade complexa de proteínas semelhantes a PreOn usando o organismo modelo Metazoário C elegance. Isso é obtido monitorando o transporte intra e intracelular de vesículas contendo a proteína do tipo PreOn, usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Em seguida, sensores de dobramento específicos do tecido e estresse expresso de forma onipresente.

Os repórteres são usados para avaliar os efeitos autônomos e não celulares na aptidão celular. Em seguida, uma triagem de RNAi em todo o genoma é realizada para identificar novos modificadores da toxicidade induzida por PreOn. A triagem é realizada em cultura líquida usando thrashing como leitura de toxicidade.

Finalmente, rastreador de worm, Um plugin para a imagem J é usado para quantificar o movimento da elegância C em combinação. Esses métodos permitem separar as vias genéticas envolvidas no movimento intercelular de proteínas semelhantes a PreOn e sua toxicidade autônoma não celular. Depois de preparar o controle sincronizado de elegância do mar e as linhas transgênicas de domínio PreOn e almofadas 10% agros, de acordo com o protocolo de texto que acompanha, pipete três microlitros de 100 nanogramas de esferas de poliestireno e três microlitros de quatro limassol milimolares na almofada agros.

Usando um fio de platina, transfira vermes na idade desejada de uma placa para a solução e use uma lamínula para cobrir a imagem dos vermes no nível subcelular. Coloque uma lâmina no suporte da lâmina do microscópio de um microscópio confocal e use uma objetiva de óleo de 63 x ou 100 x 1.4 NA. Em seguida, abra METAMORPH e selecione aquisição multidimensional.

E na guia principal, marque as caixas para lapso de tempo e executar diários. Na guia de salvamento, selecione ou crie a pasta de diretório para salvar files e atribua um nome ao file Na guia de comprimento de onda, use Yoko quad red ou uma iluminação equivalente de imagem MRFP e ajuste a exposição entre 100 e 300 milissegundos e o ganho da câmera para entre 100 e 300. Em seguida, na guia de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para um segundo, a duração para cinco minutos e o número de pontos de tempo para 301.

Na guia diários. Para o diário, selecione Um conjunto de FC, Z hold e A FC retornam ao Z hold para o tipo select special duas vezes e, para o ponto inicial, selecione o início do ponto de tempo e o fim do ponto de tempo. Quando a configuração estiver concluída, pressione adquirir Seguindo este procedimento, outros métodos, como aplicativos de rastreamento de partículas, podem ser usados para medir as propriedades dinâmicas do debate.

Depois de sincronizar o domínio do príon transgênico e enquanto nematóides do tipo e copiar as placas da biblioteca de RNAI inger de acordo com o protocolo de texto, incubar placas de RNAi duplicadas a 37 graus Celsius e 300 RPM para usar HT uma bactéria 15 E coli que abriga o vetor vazio L 4 4 4 0 como controle. Cultive-o separadamente em um tubo de cultura e, em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir 65 microlitros da cultura para um quarto dos poços de 2 96. Placas de poço com uma estação de trabalho automatizada contendo uma cabeça multicanal dispensada.

10 microlitros de cinco, milimolar de IPTG diluído em cada poço das bactérias RNAi e placas de controle. Feche novamente antes de incubá-los por três horas enquanto as bactérias estão incubando. Misture o controle sincronizado do tipo selvagem e as larvas transgênicas de L um e M nove tamponam bem e pipetem de cinco a 10 microlitros em um microscópio de vidro.

Deslize a contagem dos vermes e calcule o número de vermes por microlitro. Após a incubação bacteriana de três horas, remova as placas da incubadora e deixe-as atingir a temperatura ambiente para evitar que o calor estresse os vermes. Em seguida, suplemente o tampão M nove com colesterol IPTG e antibióticos de acordo com o protocolo de texto.

E adicione o volume apropriado de solução de verme transgênico de domínio PreOn a uma concentração final de 15 vermes por mistura de microlitro para distribuir uniformemente. Em seguida, dispense 50 microlitros em cada poço das placas de RNAi e nos poços de uma das placas de controle de vetores vazias. Dispense a solução de verme do tipo selvagem na segunda placa de controle.

Em seguida, deixe todas as placas sem lacre para permitir a aeração e evitar que a cultura líquida evapore, empilhando quatro a cinco placas juntas, envolvendo-as com uma toalha de papel úmida seguida de papel alumínio. Incube as placas a 20 graus Celsius e 200 RPM por quatro dias. Para as placas, use uma câmera Falcon four M 60 conectada a um computador com um monitor para rastrear visualmente o aumento da surra em comparação com animais transgênicos de domínio PreOn tratados com controle.

A principal vantagem de usar uma estação de trabalho automatizada de manuseio de líquidos para dispensar os vermes nas placas de RNAi R é que isso reduz muito a variabilidade e o número de vermes por poço. Para realizar um ensaio de motilidade em placas sólidas e validar clones de RNAi candidatos, cultive bactérias de RNAi durante a noite de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use um IPTG milimolar para induzir a expressão do RNA DS por três horas.

Use 150 microlitros de cada clone bacteriano de RNAi para semear placas NGM previamente preparadas, espalhando-se em uma camada fina. Deixe as bactérias secarem por dois dias em temperatura ambiente no escuro sob um microscópio estéreo. Determine a quantidade de vermes sincronizados e suspensão conforme descrito anteriormente e adicione 25 a 30 L de uma larva em cada placa experimental.

Incube os nematóides a 20 graus Celsius por quatro dias até que os vermes cheguem. Segundo dia da idade adulta para quantificar a motilidade do verme, ligue a câmera e o software de imagem PCI simples. Clique no ícone da câmera para ativar o ajuste das condições de imagem.

Em seguida, configure a condição de imagem da seguinte maneira. Defina o ganho para zero, o modo de luz para alta velocidade, o índice para um e o binning para dois. Em seguida, clique em expor ao vivo e automaticamente e ajuste as condições de iluminação movendo os espelhos do microscópio e os mostradores de brilho e contraste.

Clique no tempo, digitalize e digite uma pasta e um nome de arquivo, defina o atraso do campo para 20 milissegundos e pare no tempo para 30 segundos. Pressione revisão ao vivo para escolher a área da placa a ser gravada. Em seguida, bata no prato três ou quatro vezes no palco.

Confirme rapidamente a sua posição no campo de visão e prima iniciar após a gravação do filme terminar de gravar, clique com o botão direito do rato na imagem e escolha exportar sequência de montagem para exportar o filme de um formato CXD para um ficheiro A VI. Para analisar os vídeos de motilidade, abra a imagem J, escolha a guia de plug-ins, escolha o rastreador de worm e selecione o lote do Worm Tracker e selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados na janela de entrada principal do Worm Tracker, carregue em lote os valores de entrada conforme detalhado aqui. Uma explicação para cada um dos parâmetros pode ser encontrada nas instruções que acompanham o plugin.

Clique em OK e permita que a análise de movimento seja executada. Finalmente, para selecionar os resultados, confirme se todas as pegadas detectadas são da elegância real do mar e elimine os artefatos. Abra os arquivos TXT criados para cada filme e copie as informações para um arquivo de software de análise de dados.

Abra os arquivos zip de rótulos criados e execute os rótulos TIFF resultantes para verificar e eliminar manualmente os rastros de worms falsos. Yesper Peterson, um ex-pós-doutorado no laboratório, teve a ideia do rastreador de vermes como um substituto para nossa avaliação manual do CL Elegance motil, que é uma leitura de toxicidade. O rastreador de worms nos permite fazer esses experimentos de maneira automatizada, sem viés do usuário, enquanto avaliamos mais condições em um período de tempo mais curto usando imagens de lapso de tempo.

A RFP marcada com R dois E dois, que se acumula em vesículas tubulares foi vista transportada dentro e entre as células por coex expressando um sensor dobrável ou repórter de estresse. Juntamente com a célula proteica PreOn, os efeitos autônomos e não celulares podem ser avaliados. A expressão de R dois E dois nas células musculares leva a um início mais precoce da agregação de Q 44 no intestino, revelando que R dois E dois tem efeitos autônomos não celulares na co-expressão de proteostase de R dois E dois Com o SOD três PGFP Repórter de estresse oxidativo transcricional leva à regulação positiva do repórter em diferentes tecidos, demonstrando que o domínio PreOn induz uma resposta ao estresse oxidativo não celular de forma autônoma seguindo toda a triagem do genoma.

Este filme demonstra que a imagem e a visualização de alta resolução na tela do computador permitem a triagem de um quarto de uma placa simultaneamente Uma vez dominado, esse protocolo de triagem pode ser feito em 12 rodadas de 25 placas por sessão. Se duas sessões forem realizadas por semana, toda a biblioteca de RNAi pode ser rastreada em seis semanas. O rastreador de minhocas foi usado para quantificar a motilidade da elegância C, como visto aqui.

O Worm Tracker converte um vídeo original em um formato binário e cada worm recebe uma faixa. Os vídeos processados podem ser visualizados com faixas sobrepostas para eliminar manualmente quaisquer artefatos. O parâmetro de comprimentos de corpo por segundo é normalizado para possíveis diferenças de tamanho. Nematóides.

Este método identificou 35 supressores de toxicidade induzida por PreOn que aumentaram o fenótipo de motilidade para pelo menos 133% e até 256% em comparação com vermes tratados com controle. Ao alugar o rastreador de worms, é importante lembrar de verificar manualmente os rastros de worms obtidos. O software faz um ótimo trabalho na identificação dos vermes, mas às vezes o fundo ainda pode ser identificado erroneamente como um animal.

Portanto, lembre-se de verificar seus vídeos depois de executar o rastreador de worms neles. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas, como se uma determinada proteína de ligação à doença é capaz de se espalhar de célula para célula, prença semelhante, ou se existe uma ligação entre a transmissão intercelular e a toxicidade complexa dessas proteínas. Garotada.