Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar e caracterizar nanopartículas de sulfato de dextrano SD F1 Alpha Chias. A preparação das nanopartículas é obtida misturando primeiro o fator de homing de células-tronco derivado de células estromais um alfa ou S df um alfa com sulfato de dextrano para permitir a ligação ao glicano carregado negativamente. Como um ozan de segunda etapa, um glicano carregado positivamente é adicionado à mistura formando um complexo polieletrolítico com sulfato de dextrano.

Em seguida, o sulfato de zinco é adicionado para estabilizar os complexos com pontes de zinco. A partícula resultante tem um núcleo denso cercado por uma concha carregada negativamente. As partículas são posteriormente medidas quanto ao seu tamanho e potencial zeta, bem como o conteúdo e a atividade de S df um alfa nas nanopartículas A principal vantagem das nanopartículas de SDF um alfa glicano é que o SDF incorporado um alfa é totalmente ativo sem ser liberado das partículas.

Portanto, as partículas podem ser úteis para servir como um sinal estacionário de hermina na terapia com células-tronco. Para começar, prepare as soluções de estoque conforme descrito no protocolo de texto e esterilize-as através de membranas de filtro de 0,22 mícron. Avalie os níveis de endotoxina na solução preparada com o ensaio de coágulo em gel de lisado de ameba ulu.

Certifique-se de que os níveis sejam inferiores a 0,06 unidades de endotoxina por mililitro. Em seguida, com 0,18 mililitros de água ultrapura para um frasco de vidro de 1,5 mililitro contendo uma barra de agitação magnética. Defina a velocidade de agitação em 800 RPM, adicione 0,1 mililitros de sulfato de dextrano a 1% e mexa após dois minutos.

Adicione 0,08 miligramas de SD F1 alfa e mexa por 20 minutos. Adicione 0,33 mililitros de 0,1% de tizen e mexa por cinco minutos. Altere a velocidade de agitação para o máximo e adicione lentamente 0,1 mililitros de sulfato de zinco com uma seringa estanque ao gás.

Retorne a velocidade de agitação para 800 RPM e mexa por 30 minutos. Em seguida, adicione 0,4 mililitros de 15% de manitol e mexa após cinco minutos. Transferir a mistura de reacção para um tubo de fuga de 1,5 mililitros e centrifugar a 16 000 Gs e quatro graus Celsius durante 10 minutos.

Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e remover a última gota de líquido com uma pipeta. Adicione lentamente 0,2 mililitros de manitol a 5% e suspenda o pellet com uma seringa de agulha de calibre 29 de 0,5 mililitro. Em seguida, adicione mais um mililitro de 5% de manitol antes de centrifugar.

Uma segunda vez a 16.000 GS por 15 minutos. Após repetir o processo de centrifugação em suspensão Resus, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 0,2 mililitros de manitol a 5%. O tamanho da partícula e o potencial zeta são analisados por espalhamento de luz dinâmico e espalhamento de luz eletroforético, respectivamente.

Para começar, selecione um procedimento de operação na lista SOP, que contém parâmetros para medição do tamanho das partículas por meio de dispersão dinâmica de luz. Conforme listado no protocolo de texto, dilua a amostra de partícula alfa SD F1 com água. Em seguida, carregue 100 microlitros da amostra em um UV Q Vet descartável, como um Einor Q Vet.

Insira o Q vet no suporte da célula e aguarde que o ajuste de intensidade atinja o ideal antes de iniciar a aquisição de dados. Após a conclusão da medição, registre os resultados cumulativos do diâmetro e do índice de polidispersão. Calcule a média dos resultados obtidos de cada uma das quatro leituras repetidas e calcule o desvio padrão para medição do potencial zeta por meio de espalhamento de luz eletroforético.

Carregue 500 microlitros da amostra de partícula diluída dez vezes na célula de fluxo. Selecione um procedimento de operação na lista de SOP de potencial Zeta, que contém parâmetros para a medição conforme listado no protocolo de texto. Registre os resultados do potencial zeta.

Em seguida, calcule a média dos resultados obtidos em cada uma das cinco leituras repetidas e calcule o desvio padrão. Aqueça as amostras diluídas de SD F1 alfa livre e ligado a partículas em tampão de amostra laly a 100 graus Celsius por 10 minutos. Vortex as amostras duas vezes durante o aquecimento de 10 minutos, a fim de dissociar as partículas completamente após resfriar as amostras à temperatura ambiente por dois minutos, a centrífuga tinha 10.000 Gs por 0,5 a um minuto para derrubar o vórtice de condensado de água novamente para misturar bem.

Neste ponto, a solução da amostra deve ser límpida, sem precipitado visível presente. Em seguida, carregue 10 microlitros de amostra por poço em um sulfato ESAL de quatro a 20% de sódio ou gel SDS. Execute a eletroforese a 200 volts por 20 minutos antes de corar o gel com a coloração de proteína azul de kumasi.

Examine a densidade da banda de proteína do SD F1 alfa usando um gerador de imagens moleculares e um software de análise de densitometria. Calcular a quantidade de S DF um alfa nas partículas em relação a uma curva-padrão construída com padrões SDF one alpha livres para realizar o ensaio de libertação in vitro misturar partículas de SD-F1 alfa-glicano com tampão fosfato docos solução salina sem cálcio e magnésio ou DPBS numa proporção de um para um. Divida a suspensão de partículas em alíquotas de 0,05 mililitro em tubos de 1,5 mililitro.

Carregue as amostras no fundo dos tubos. Evite introduzir bolhas de ar ou perturbar a superfície do líquido. Sele a parte superior dos tubos com paraform.

Em seguida, gire os tubos a 37 graus Celsius em um misturador de microtubos rotativo. Remover alíquotas dos tubos nos horários designados e centrifugar imediatamente as amostras a 16 000 Gs durante 10 minutos a quatro graus Celsius após centrifugação. Separe os sobrenadantes e os pellets.

Em seguida, reconstitua o pellet com 0,05 mililitros de DPBS. Depois de todas as amostras terem sido recolhidas, examinar os sobrenadantes e os pellets num gel SDS. Como antes, este ensaio mede a atividade quimiotática de S df.

Uma interação alfa de S df um alfa com seu receptor causa migração da célula em direção ao gradiente alfa SD F1. Para iniciar a forma de SD, F1 alfa livre de diluição ou ligada a partículas, com tampão de migração numa diluição tripla em série até às concentrações finais indicadas no protocolo de texto. Adicione 0,6 mililitros da solução SD F1 alfa diluída a um poço na placa de 24 poços para o controle negativo.

Faça o mesmo para o buffer de migração apenas e, em seguida, adicione 0,57 mililitros de buffer de migração a um poço para o controle da célula de entrada. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, coloque uma inserção de cultura de células permeáveis, como transwell, em cima do poço inferior, carregue 0,1 mililitros de células jerk hat na inserção transwell.

Em seguida, carregue 0,03 mililitros de células diretamente no controle da célula de entrada. Bem, incube a placa a 37 graus Celsius por duas horas em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, remova as inserções de cultura de células.

Transfira as células que migraram para os poços inferiores para um tubo de poliestireno de quatro mililitros. Conte as células migradas com um citômetro de fluxo. Por fim, calcule a migração como uma porcentagem do número da célula de entrada após a subtração dos números nos controles negativos.

Aqui é mostrada a análise da medição do tamanho de partícula de ozan de sulfato alfa dextrano SD F1. O resultado do CUMUL mostra que o diâmetro hidrodinâmico da partícula é de 671 nanômetros e a polidispersidade é de 0,24. Esta captura de tela mostra uma das cinco medições repetidas do potencial zeta das partículas de sulfato ozano de fita SD F1 alfa DExT.

O potencial zeta é de menos 24,7 milivolts. A quantidade de S df um alfa nas partículas de sulfato de dextrano ozan S df um alfa é estimada por eletroforese em gel SDS. Aqui é mostrado um gel SDS corado com kumasi com nanopartículas de controle de kaizan de sulfato de dextrano de padrões alfa SD F1 e amostras de nanopartículas de kaizan de sulfato de dextrano alfa SD F1 carregadas.

Uma curva padrão é construída a partir da análise de densidade do SD F1 Alpha O cálculo das bandas padrão da curva padrão indica que a concentração de S DF um alfa na amostra de nanopartículas SDF um alfa é de 0,03 miligramas por mililitro. Para determinar a taxa de liberação in vitro de S DF um alfa das nanopartículas, a quantidade de S DF um alfa liberado no supernat e a quantidade de sdf ligado a partículas um alfa nos pellets foi determinada pela coloração kumasi de um gel SDS seguida de análise citométrica. A atividade do S DF one alpha ligado à partícula é medida por um ensaio de migração e, em comparação com isso, um SDF one alpha livre, como mostrado aqui.

O SDF ligado à partícula um alfa induziu a mesma extensão de migração que um s DF livre um alfa em todas as concentrações medidas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a formulação das partículas de proteína glicana pode ser alterada. Dependendo da aplicação específica, outras proteínas podem ser incorporadas e diferentes formulações podem ser usadas para variar o tamanho das partículas.

Esperamos que este vídeo demonstre as técnicas básicas na preparação da coleta de nanopartículas e, em seguida, a análise funcional do SDF one alpha incorporado.