Name: Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a preparar e caracterizar nanopartículas de SDF-1α com quitosana e sulfato de dextrano para terapias com células-tronco. Este método avalia tamanho, potencial zeta e atividade biológica do fator de homing.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções: HL671795, HL048743 e HL108630.

1. Preparação de SDF-1α Glicano Nanopartículas Devido ao efeito da administração in vivo, esterilizar todos os recipientes, pipetas, e pontas usadas na preparação. <ol><li> Prepare as seguintes soluções de em água ultrapura: 1% de sulfato de dextrano; NaOH 1 M (esterilizado por filtração com uma membrana PES); Quitosano a 0,1% em 0,2% de ácido acético glacial (0,8 e filtra-se através de filtros de 0,22 um, consecutivamente e ajustar o pH para 5,5 com NaOH depois); 0,1 M ZnSO4; 15% de manitol; e 0,92 mg / ml de SDF-1α (armazenado em alíquotas a 80 ° C, e mantida a 4 ° C uma vez descongelado). </li><li> Esteriliza-se através de soluções de estoque 0,22 mM membranas de filtro. Avaliar os níveis de endotoxina na solução preparada com ensaio limulus amebócito lisado (LAL) coágulo de gel. Certifique-se que os níveis são &lt;0,06 EU / ml. </li><li> Adicionar 0,18 ml de água ultrapura para um frasco de vidro de 1,5 ml contendo uma barra de agitação magnética. Defina a velocidade de agitação a 800 rpm. Adicionar 0,1 ml de 1%sulfato de dextrano e agita-se durante 2 min. Adicionar 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml de SDF-1α solução) e agitar durante 20 min. </li><li> Adicionar 0,33 ml de 0,1% de quitosano, gota a gota e agita-se durante 5 min. Alterar a velocidade de agitação para o máximo e adicionar 0,1 ml de 0,1 M ZnSO4 lentamente com uma seringa de 0,1 mL (ao longo de 1 min). </li><li> Retorno velocidade de agitação para 800 rpm e mexa por 30 min. Adicionar 0,4 ml de 15% de manitol e agita-se durante 5 min. Transferir a mistura reaccional para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Nota: A presença de manitol facilita a ressuspensão das partículas após centrifugação. Dependendo da compactação do sedimento, a concentração de manitol pode variar de 0% a 5%. Ressuspensão completa das partículas após cada centrifugação é crítico para evitar agregados na suspensão final. </li><li> Aspirar o sobrenadante e utilizar uma pipeta para remover a última gota do líquido lentamente. Adicionar 0,2 ml de 5% de manitol. Suspender o pellet com 0,5 ml, 29 G needle seringa. Adicionar 1 ml de 5% de manitol. Centrifuga-se a 16000 xg durante 15 min. </li><li> Repita o passo 1.6. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 0,2 ml de 5% de manitol. Armazenar a suspensão de partículas a 4 ° C. Nota: A suspensão de partículas também pode ser armazenado congelado a -80 ° C ou liofilizado. Incluindo 5% de manitol em suspensão é essencial para evitar a agregação das partículas após congelação e descongelação ou após liofilização e re-hidratação. O manitol pode ser removido por centrifugação da suspensão, após o armazenamento. </li></ol> 2. A medição do tamanho de partícula e Potencial Zeta O tamanho de partícula e potencial zeta são analisados ​​por dispersão de luz dinâmica e electroforético da dispersão de luz, respectivamente, com um analisador de partículas indicada na lista de materiais. <ol><li> Configure os seguintes parâmetros para medição do tamanho de partícula: tempos de Capitalização: 70; Repita vezes: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto. </li><li> Dilui-se a amostra SDF-1α-DS-CS com água (diluição de 10 vezes). Carregar 100 ul da amostra a uma cuvete descartável de UV, tais como numa cuvete de Eppendorf. Coloque a célula no suporte da célula. Aguarde até que o ajuste de intensidade para chegar a &quot;Optimum&quot; (~ 10.000 cps). Iniciar a aquisição de dados. </li><li> Após a medição está completa, gravar os resultados cumulantes de diâmetro (nm) e índice de polidispersão. Calcular a média dos resultados obtidos a partir de cada uma das quatro leituras repetidas e calcular o desvio padrão. </li><li> Carga de 500 ul de 10 vezes a amostra diluída partícula a uma célula de fluxo para medição do potencial zeta. Configure os seguintes parâmetros para a medição: tempos de Capitalização: 10; Repita vezes: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto. Registam-se os resultados do potencial zeta (mV). Média, o resultado de cada um dos 5 leituras repetidas, e calcular o deviatio padrãon. </li></ol> 3. Quantificação de SDF-1α nas Partículas <ol><li> Dilui-se em forma livre SDF-1α a concentrações de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml em tampão de amostra de Laemmli 1,3x. Diluir 6 ul amostras SDF-1α-DS-CS com tampão de amostra de 40 ul 1,3x Laemmli. (Preparar tampão de Laemmli 4x estoque contendo 0,25 M de Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, e 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir a solução estoque em pequenas alíquotas a -20 e manter ° C para uso individual.) </li><li> Aquecer as amostras a 100 ° C durante 10 min. Agitar as amostras duas vezes (cada uma de 10 segundos à velocidade máxima) durante o tempo de aquecimento de 10 min de modo a dissociar as partículas completamente. Arrefecer as amostras até à TA durante 2 min. Centrífuga a 10.000 xg por 0,5-1 min para derrubar o condensado de água. Vortex novamente para misturar bem. Nota: Neste ponto, a solução da amostra deve ser límpida sem precipitados visíveis presentes. </li><li> Carga 10 &amp;# 181; l sample / bem a um gel SDS 4-20%. Executar electroforese a 200 V durante 20 min. Manchar o gel com Coomassie mancha azul proteína. </li><li> Examinar a densidade de banda de proteína de SDF-1α usando um gerador de imagens e análise de densitometria software molecular. Calcular a quantidade de SDF-1α nas partículas contra uma curva padrão construída com padrões SDF-1α livres. </li></ol> 4. Ensaio de Libertação In Vitro <ol><li> Misturar partículas de glicano SDF-1α com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS) a uma proporção de 1: 1 (v / v). </li><li> Dividir a suspensão de partículas em 0,05 ml de partes alíquotas em tubos de 1,5 ml. Coloque as amostras para o fundo dos tubos. Evitar a introdução de bolhas de ar ou perturbar a superfície do líquido. Selar o topo dos tubos com parafilme. NOTA: Ao fazer isso, o líquido irá permanecer na parte inferior durante a rotação de cima para baixo subsequente sobre o misturador tubo. </li><li> Gire os tubos a 37 &amp;# 176; C em um giro Micro-Tube Mixer. Retirar as alíquotas de nos tempos designados, e imediatamente centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Separa-se os sobrenadantes e peletes, e reconstituir o sedimento com 0,05 ml de D-PBS. Armazenar as amostras a -20 ° C. Depois de todas as amostras são recolhidas, examinar-se os sobrenadantes e peletes sobre um gel de SDS como descrito acima. </li></ol> 5. Migration Assay Este ensaio mede a actividade quimiotáctica de SDF-1α. Interacção de SDF-1α com o seu receptor (CXCR4) na superfície da célula causa a migração da célula no sentido do gradiente de SDF-1α. Neste ensaio, as células são carregadas para um bem superior (separados por uma membrana semi-permeável, a partir de um poço inferior) e SDF-1α solução em um tubo inferior. <ol><li> Diluir SDF-1α (forma livre ou ligado a partículas) com tampão de migração (meio RPMI-1640 contendo 0,5% de albumina de soro de bovino) na proporção de 3-FOld diluição em série para as concentrações finais de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml. </li><li> Adicionar 0,6 ml de solução a SDF-1α diluída ou tampão de migração apenas (controlo negativo) a uma cavidade da placa de 24 poços. Adicionar tampão migração 0,57 ml a um bem (controle de célula de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque uma inserção de cultura de célula Transwell permeável tal como (tamanho de poro de 5 um, 6,5 mm de diâmetro) na parte superior do poço inferior. Carregar 0,1 ml de células de Jurkat (5 x 10 5) para inserir o Transwell. Coloque 0,03 ml de células directamente para a célula de entrada de controlo bem. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> Remova as inserções Transwell. Transferem-se as células que migraram para os poços inferiores a um tubo de poliestireno de 4 ml. Contar as células migraram com um citômetro de fluxo. </li><li> Calcular a migração como uma percentagem do número de células de entrada (o número de células no controlo de célula de entrada bem x 100/30) após subtracção dos números em negative controles (células migraram para os poços contendo tampão migração só). </li></ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
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<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como mencionado acima, as nanopartículas DS-CS são formados através de neutralização de cargas entre polianião (DS) e policatião (CS) moléculas. Uma vez que a interacção de cargas ocorre prontamente durante a colisão molecular, a concentração das soluções de polímero e a velocidade de agitação durante a mistura é crítica para o tamanho das partículas resultantes. A tendência geral é que DS e CS 15 soluções e maior resultado velocidade de agitação em partículas menores mais diluído. <p class="jove_content"...

O sulfato de dextrano (DS) e quitosana (CS) são polissacarídeos com múltiplas substituídos grupos sulfato carregados negativamente (em DS), ou grupos amina carregados positivamente (desacetilados CS). Quando misturado numa solução aquosa, os dois polissacáridos formar complexos de polielectrólitos através de interacções electrostáticas. Os complexos resultantes podem formar grandes agregados que irá ser progressivamente-separado da solução aquosa (ou precipitados), pequenas partículas que são dispersíveis em água (colóides). As condições específicas que contribuem para esses resultados têm sido extensivamente estudada, e foram resumidos e ilustrado em pormenor numa publicação recente 1. Entre essas condições, dois requisitos básicos para a produção de partículas dispersíveis em água são os polímeros de carga oposta deve 1) têm massa molar significativamente diferente; e 2) ser misturado numa relação não estequiométrica. Estas condições permitirão que os segmentos poliméricos complexados carga neutra gerados pela carganeutralização para segregar e formar o núcleo da partícula, e o excesso de polímero para formar o invólucro exterior 1. As partículas de glicanos descritos neste protocolo são destinados para a administração pulmonar, e são projetados para serem net carregado negativamente, e de dimensões nanométricas. A carga de superfície negativa reduz a probabilidade de absorção celular das partículas de 2,3. Partículas de dimensão nanométrica facilitar a passagem através das vias aéreas distais. Para atingir este objectivo, a quantidade de DS utilizado nesta preparação é em excesso de CS (proporção em peso de 3: 1); e alta massa molecular DS (peso-médio MW 500.000) e de baixo peso molecular, CS (MW gama 50-190 kDa, 75-85% desacetilada) são usadas. SDF-1α é um factor homing células estaminais, que exerce a função de homing através da sua actividade quimiotáctica. SDF-1α desempenha um papel importante no retorno e manutenção de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e no recrutamento de ProgeNitor células no tecido periférico para a reparação de lesão 4,5. SDF-1α tem um local de ligação à heparina na sequência da proteína, o que permite que a proteína se liga à heparina / sulfato de heparano, formam dímeros, ser protegido contra a protease (CD26 / DPPIV) inactivação, e interagem com células alvo através dos receptores de superfície celular 6-8. DS tem propriedades estruturais semelhantes às da heparina / sulfato de heparano; assim, a ligação de SDF-1α para DS seria semelhante à dos seus ligantes poliméricos naturais. No protocolo seguinte, descreve-se a preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS. Os procedimentos representam uma das formulações que foram previamente estudadas 9. O protocolo é originalmente adaptado de uma investigação do VEGF-DS-CS nanopartículas 10. Uma preparação em pequena escala é descrito, o qual pode ser facilmente dimensionado para cima com as mesmas soluções de reserva e as condições de preparação. Após a preparação, as partículas são caracterizadas by examinar seu tamanho, potencial zeta, a extensão da incorporação SDF-1α, in vitro tempo de liberação e atividade do incorporada SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosana, baixo peso molecular&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinco heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure water&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>Preparado de acordo com a referência 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa, membrana PES 0.22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Barras de Agitação Micro Magnéticas (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Kit de frasco de vidro; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano C Analisador de Partículas&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Protein Stain</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Imageador Molecular VersaDoc MP 4000 System</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Permeável Suporta</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus kit</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e caracterização de sdf-1α-quitosana as nanopartículas de sulfato de dextrano

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

A quitosana (CS) e o sulfato de dextrana (DS) são polissacarídeos carregados (glicanos), que formam nanopartículas à base de complexos polieletrolíticos quando misturados sob condições apropriadas. As nanopartículas de glicano são transportadores úteis para fatores proteicos, que facilitam a entrega in vivo das proteínas e sustentam sua retenção no tecido-alvo. Os complexos polieletrolíticos de glicano também são ideais para a entrega de proteínas, pois a incorporação é realizada em solução aquosa, o que reduz a probabilidade de inativação das proteínas. As proteínas com um local de ligação à heparina aderem prontamente ao sulfato de dextrana e são, por sua vez, estabilizadas pela ligação. Essas partículas também são menos inflamatórias e tóxicas quando entregues in vivo. No protocolo descrito abaixo, o SDF-1α (fator derivado de células estromais-1α), um fator de homing de células-tronco, é primeiro misturado e incubado com sulfato de dextrana. A quitosana é adicionada à mistura para formar complexos polieletrolíticos, seguida de sulfato de zinco para estabilizar os complexos com pontes de zinco. As partículas SDF-1α-DS-CS resultantes são medidas quanto ao tamanho (diâmetro) e carga superficial (potencial zeta). A quantidade do SDF-1α incorporado é determinada, seguida por medições de sua taxa de liberação in vitro e sua atividade quimiotática em uma forma ligada a partículas.

O tamanho e potencial zeta das partículas preparadas SDF-1α-DS-CS são determinadas com um analisador de partículas. A Figura 1 mostra a análise da medição do tamanho. A partir dos resultados obtidos a partir de quatro cumulantes medições repetidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas SDF-1α-DS-CS é 661 ± 8,2 (nm) e a polidispersidade é de 0,23 ± 0,02. O resultado da medição do potencial zeta é mostrado na Figura 2. A partir das cinco medições repetidas, o potencial zeta das pa...

O objetivo deste protocolo é incorporar SDF-1α, um fator de homing de células-tronco, em nanopartículas de sulfato de dextrano-quitosana. As partículas resultantes são medidas quanto ao seu tamanho e potencial zeta, bem como o conteúdo, atividade e taxa de liberação in vitro de SDF-1α das nanopartículas.

Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar e caracterizar partículas de SD F1 Alpha Chias e sulfato de dextrana. A preparação das nanopartículas é realizada primeiramente misturando o fator de direcionamento de células-tronco, fator estromal derivado um alfa ou S df um alfa, com sulfato de dextrana, permitindo a ligação ao glicano com carga negativa. Em um segundo passo, ozan, um glicano com carga positiva, é adicionado à mistura, formando um complexo polieletrolítico com o sulfato de dextrana.Em seguida, sulfato de zinco é adicionado para estabilizar os complexos com pontes de zinco. A partícula resultante possui um núcleo denso cercado por uma camada negativamente carregada. As partículas são subsequentemente analisadas quanto ao seu tamanho e potencial zeta, bem como quanto ao teor e atividade de S df um alfa nas nanopartículas. A principal vantagem das nanopartículas de glicano SDF um alfa é que o SDF um alfa incorporado permanece totalmente ativo sem ser liberado das partículas.Portanto, as partículas podem ser úteis para atuar como um sinal estacionário de hermina na terapia com células-tronco. Para começar, prepare soluções estoque conforme descrito no protocolo textual e esterilize-as por meio de membranas de filtro de 0,22 mícrons. Avalie os níveis de endotoxinas na solução preparada com o ensaio de coagulação em gel de lisado de ameba ulu.Garanta que os níveis sejam inferiores a 0,06 unidades de endotoxina por mililitro. Em seguida, adicione 0,18 mililitros de água ultrapura a um frasco de vidro de 1,5 mililitro contendo uma barra de agitação magnética. Ajuste a velocidade de agitação em 800 RPM e, em seguida, adicione 0,1 mililitros de sulfato de dextrana 1% e agite por dois minutos.Adicione 0,08 miligramas de SD F1 alfa e agite por 20 minutos. Adicione gota a gota 0,33 mililitros de 0,1% tizen e agite por cinco minutos. Altere a velocidade de agitação para o máximo e adicione lentamente 0,1 mililitros de sulfato de zinco com uma seringa estanque ao gás.Retorne a velocidade de agitação para 800 RPM e agite por 30 minutos. Em seguida, adicione 0,4 mililitros de manitol a 15% e agite após cinco minutos. Transfira a mistura reacional para um tubo fuge de 1,5 mililitro e centrifugue a 16.000 Gs e quatro graus Celsius por 10 minutos.Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e use uma pipeta para remover a última gota de líquido. Adicione lentamente 0,2 mililitros de manitol 5% e suspenda o pellet com uma seringa de agulha 29 gauge de 0,5 mililitro. Em seguida, adicione mais um mililitro de manitol 5% antes de centrifugar.Uma segunda vez a 16.000 ×g por 15 minutos. Após repetir o processo de centrifugação de suspensão de ressuspensão, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 0,2 mililitros de manitol 5%. O tamanho das partículas e o potencial zeta são analisados por espalhamento dinâmico de luz e espalhamento eletroforético de luz, respectivamente.Para começar, selecione um procedimento operacional da lista de POPs, que contém parâmetros para a medição do tamanho de partículas por espalhamento dinâmico de luz. Conforme descrito no protocolo textual, dilua a amostra de partículas alfa do SD F1 com água. Em seguida, carregue 100 microlitros da amostra em uma cubeta descartável UV Q Vet, como uma Einor Q Vet.Insira o Q vet no suporte da cubeta e aguarde até que o ajuste de intensidade alcance o valor ótimo antes de iniciar a aquisição de dados. Após a conclusão da medição, registre os resultados cumulativos de diâmetro e índice de polidispersidade. Faça a média dos resultados obtidos nas quatro leituras repetidas e calcule o desvio padrão para a medição do potencial zeta por espalhamento de luz eletroforético.Carregue 500 microlitros da amostra de partículas diluída dez vezes na célula de fluxo. Selecione um procedimento operacional na lista de POP para potencial zeta, que contém os parâmetros para a medição conforme listado no protocolo textual. Registre os resultados do potencial zeta.Em seguida, faça a média dos resultados obtidos a partir das cinco leituras repetidas e calcule o desvio padrão. Aqueça as amostras diluídas de SD F1 alfa livre e ligado a partículas em tampão amostral laly a 100 graus Celsius por 10 minutos. Vortexe as amostras duas vezes durante o aquecimento de 10 minutos para dissociar completamente as partículas. Após resfriar as amostras à temperatura ambiente por dois minutos, centrifugue a 10.000 G por 0,5 a um minuto para remover o condensado de água e vortexe novamente para homogeneizar bem.Neste ponto, a solução da amostra deve estar límpida, sem precipitado visível. Em seguida, aplique 10 microlitros da amostra por poço em um gel de SDS-PAGE de 4 a 20%. Realize a eletroforese a 200 volts durante 20 minutos antes de corar o gel com corante proteico azul de kumasi.Examine a densidade da banda proteica de SDF1α utilizando um sistema de imagem molecular e um software de análise de densitometria. Calcule a quantidade de SDF1α nas partículas em relação a uma curva padrão construída com padrões livres de SDF1α para realizar o ensaio de liberação in vitro. Misture as partículas de glicano de SDF1α com solução salina tampão fosfato com docos, sem cálcio e magnésio, ou DPBS, na proporção de um para um. Divida a suspensão de partículas em alíquotas de 0,05 mililitros em tubos de 1,5 mililitro.Carregue as amostras até o fundo dos tubos. Evite introduzir bolhas de ar ou perturbar a superfície do líquido. Selle a extremidade dos tubos com paraform.Em seguida, gire os tubos a 37 graus Celsius em um misturador rotativo de microtubos. Retire alíquotas dos tubos nos tempos designados e imediatamente centrifugue as amostras a 16.000 Gs durante 10 minutos a quatro graus Celsius após a centrifugação. Separe os sobrenadantes e os pellets.Em seguida, reconstitua o pellet com 0,05 mililitros de DPBS. Após a coleta de todas as amostras, examine os sobrenadantes e os pellets em um gel de SDS. Como antes, este ensaio mede a atividade quimiotática de S df.Uma interação alfa de S df um alfa com seu receptor causa a migração da célula em direção ao gradiente de SD F1 alfa. Para começar, dilua a forma livre ou ligada a partículas de SD F1 alfa com o tampão de migração em diluições seriadas triplicadas até as concentrações finais listadas no protocolo do texto. Adicione 0,6 mililitros da solução diluída de SD F1 alfa a um poço na placa de 24 poços para o controle negativo.Repita o mesmo procedimento para o tampão de migração, adicionando então 0,57 mililitros de tampão de migração a um poço para o controle de células de entrada. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, posicione um inserto de cultura celular permeável, como um transwell, sobre o poço inferior e adicione 0,1 mililitro de células jerk hat no inserto do transwell.Em seguida, carregue 0,03 mililitros de células diretamente no controle de entrada celular. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas horas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, remova os insertos de cultivo celular.Transfira as células que migraram para os poços inferiores para um tubo de poliestireno de quatro mililitros. Conte as células migradas com um citômetro de fluxo. Finalmente, calcule a migração como uma porcentagem do número inicial de células, após a subtração dos valores dos controles negativos.É mostrada aqui a análise da medição do tamanho das partículas de dextrana sulfato SD F1 alfa ozan. O resultado CUMUL mostra que o diâmetro hidrodinâmico da partícula é de 671 nanômetros e a polidispersidade é de 0,24. Esta captura de tela mostra uma das cinco medições repetidas do potencial zeta das partículas de dextrana sulfato SD F1 alfa ozan.O potencial zeta é de menos 24,7 milivolts. A quantidade de S df um alfa nas partículas de dextrana sulfato ozan S df um alfa é estimada por eletroforese em gel SDS. É mostrado aqui um gel SDS corado com kumasi com padrões de SD F1 alfa, nanopartícula controle de dextrana sulfato kaizan e amostras de nanopartículas de SD F1 alfa dextrana sulfato kaizan carregadas.Uma curva padrão é construída a partir da análise de densidade dos cálculos das bandas do padrão SD F1 Alpha. O cálculo a partir da curva padrão indica que a concentração de SDF um alpha na amostra de nanopartículas de SDF um alpha é de 0,03 miligramas por mililitro. Para determinar a taxa de liberação in vitro de SDF um alpha a partir das nanopartículas, a quantidade de SDF um alpha liberado no sobrenadante e a quantidade de SDF um alpha ligado às partículas nos pellets foi determinada por coloração com kumasi em gel de SDS seguida de análise por citometria. A atividade do SDF um alpha ligado às partículas é medida por um ensaio de migração e comparada à do SDF um alpha livre, conforme mostrado aqui.O SDF-1α ligado às partículas induziu o mesmo grau de migração que o SDF-1α livre em todas as concentrações medidas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a formulação das partículas de glicoproteína pode ser alterada. Dependendo da aplicação específica, outras proteínas podem ser incorporadas e diferentes formulações podem ser utilizadas para variar o tamanho das partículas.Esperamos que este vídeo tenha demonstrado as técnicas básicas para a preparação do isolamento de nanopartículas e, posteriormente, a análise funcional da SDF-1α incorporada.

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