Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

O objetivo geral do seguinte experimento é observar alterações na carga da membrana celular após a adesão a diferentes substratos de material. Isso é conseguido cultivando os microrganismos em meio rico em nutrientes para aumentar seu número. Em seguida, as superfícies de material às quais os microrganismos aderirão são limpas e funcionalizadas para obter taxas ideais de fixação microbiana.

Em seguida, os microrganismos são cultivados em diversos substratos materiais para permitir a microscopia de força com sonda Kelvin ou a imagem por KPFM. Os resultados mostram que o tipo de substrato material e sua carga inerente afetam a atividade celular, conforme observado por alterações na carga da membrana celular e na aderência celular. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como eletroforese, espalhamento de luz e determinação do ponto isoelétrico, é que a KPFM permite examinar a carga de células individuais e biofilmes, em vez de culturas ou colônias inteiras.

Isso é benéfico ao desejar comparar célula a célula, bem como características elétricas de biofilmes, com alta precisão e exatidão. Para começar, prepare placas de ágar sangue de ovelha a 5%, estrie as bactérias MRSA nas placas preparadas e incube por 24 horas a 37 graus Celsius para gerar colônias únicas bem isoladas. Prepare 500 mililitros de caldo triptica de soja, suplementado com 1% de glicose e 0,1% de cloreto de sódio, autoclave, juntamente com dois tubos de ensaio de vidro limpos e uma caixa de pipetas de um mililitro.

Após deixar o meio e os tubos de ensaio esfriarem sob uma cabine de segurança biológica ou próximo a uma chama de bico de Bunsen, pipete seis mililitros do TSB para cada tubo de ensaio. Utilizando uma das placas de ágar sangue de ovino previamente preparadas, inocular uma única colônia de MRSA em um dos tubos. Utilize o segundo tubo como controle negativo para garantir a esterilidade e incubar os tubos em um incubador reciprocante por 24 horas a 37 graus Celsius e 200 rpm.

O tubo de MRSA deve apresentar crescimento ou nada deve ter crescido no tubo de controle. Em seguida, crie uma subcultura utilizando um mililitro da cultura de 24 horas para inocular seis mililitros de caldo tripticaseína soja fresco e incube a 37 graus Celsius e 200 rpm por mais seis horas. Em seguida, pipete um mililitro da cultura para um tubo afus e centrifugue a 850 vezes G durante três minutos.

Remova o sobrenadante e use água desionizada para lavar o pellet duas vezes com pinça na mão dominante. Segure um disco de amostra FM de aço inoxidável de 20 milímetros e use cinco mililitros de água desionizada para limpar cada lado. Coloque os discos limpos em um béquer com água desionizada e sonique por um minuto após a sonicação.

Use a pinça para remover os discos de amostra do béquer e apoie-os em um ângulo aproximado de 60 graus contra a borda de uma placa de Petri aberta sobre uma toalha de papel para secar completamente. Use a tampa da placa para cobrir os discos durante a secagem. Após a secagem, transfira o disco para uma placa de Petri para funcionalizar a superfície do disco. Pipete de 200 a 400 microlitros de poliol lisina 0,1% sobre os discos em uma cabine de segurança biológica e incube à temperatura ambiente por uma hora, utilizando a pinça para segurar os discos.

Utilize água desionizada para lavá-los conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, plaque de 200 a 400 microlitros de células re-suspensas, previamente lavadas duas vezes, sobre os discos de amostra revestidos. Após incubação à temperatura ambiente por 30 minutos, lave suavemente os discos com um mililitro de água desionizada.

Deixe os discos secarem durante a noite antes da obtenção de imagens para realizar a microscopia de força com sonda Kelvin. Ligue o computador juntamente com o microscópio de força atômica ou AFMs, o HEB e o controlador MAC três. Abra um software de imageamento de AFM, como o Ulence P ovu overview.

Selecione A-C-A-F-M ou a designação correta para imagem em modo de contato intermitente. Usando uma pinça FM na mão dominante e mantendo o suporte de clipe com mola aberto na outra mão, coloque cuidadosamente a alavanca A-K-P-F-M na peça cabeçote. Carregue cuidadosamente a peça cabeçote no A FM e conecte os fios da luz laser e do motor de elevação da platina.

Em seguida, alinhe o laser sobre a ponta do cantiléver. Para alinhar o laser sobre a ponta do cantiléver, gire o botão de frente para trás no sentido horário algumas vezes para mover o laser para cima do chip do cantiléver.

Quando o laser atingir o chip, ele será bloqueado e não será mais visível. Em seguida, gire o botão da frente para trás no sentido anti-horário até que o ponto do laser reapareça. O laser está agora na borda do chip.

Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser sobre o cantiléver. À medida que o laser passa sobre o cantiléver, ele desaparecerá e reaparecerá em rápida sucessão. O ponto do laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade do fotodiodo será posicionada posteriormente.

Gire o botão frontal para traseiro no sentido anti-horário para mover o ponto ao longo da alavanca em direção à ponta, até que o ponto no vidro fosco desapareça. Agora, gire o botão frontal para traseiro ligeiramente no sentido horário para posicionar o laser de modo que fique exatamente na ponta da alavanca; o ponto do laser reaparecerá no vidro fosco. Uma vez que o laser esteja alinhado, mantenha o motor de elevação da platina na posição aberta por 10 segundos para garantir espaço suficiente entre a alavanca e a amostra.

Ao fixar a amostra no MFA, coloque agora a amostra no estágio de MFPK. Use um fio de cobre para aterrar a amostra e conecte os fios apropriados do MFA ao estágio da amostra. Em seguida, conecte o estágio ao MFA no software do MFA.

Certifique-se de que o tempo de estabilização seja de no máximo 10 milissegundos e que as velocidades de aproximação não excedam dois mícrons por segundo. Para evitar danos à ponta, sintonize o cantiléver e comece a mover a ponta do cantiléver em direção à amostra. Uma vez que a ponta do cantiléver atinja a superfície da amostra, selecione um tamanho de janela de imagem e uma área de imagem ideal, e otimize os ganhos do olho e do P, juntamente com o ponto de ajuste do cantiléver, de modo a otimizar a imagem topográfica.

Quando a imagem topográfica estiver otimizada, ligue o módulo KPFM no modo FM. Defina a janela de imagem como cinco mícrons por cinco mícrons com resolução de 12 por 12 ou velocidades de varredura lentas. Para as configurações KPFM em FM, ajuste a amplitude entre 5 e 10%. Defina a frequência de excitação entre um e cinco quilohertz, com uma largura de banda de dois quilohertz.

Defina os ganhos das NP de ferro para F-M-K-P-F-M em 0,3%. Após adquirir as imagens de KPFM, utilize um software de processamento pós-imagem para analisar as imagens e coletar os dados de SP usando as configurações descritas neste vídeo de demonstração. As imagens de KPFM foram obtidas em 15 células de MRSA, em superfícies de aço inoxidável e de ouro. São mostrados aqui os tipos de imagens coletadas.

Como a KPFM opera utilizando duas frequências, imagens topográficas e dados elétricos da superfície celular foram coletados simultaneamente. Filtros térmicos foram aplicados aos mapas de potencial de superfície para facilitar a identificação de pequenas alterações no potencial de superfície. Neste gráfico, as imagens foram analisadas para determinar o potencial de superfície da membrana microbiana e, em seguida, utilizadas para comparação entre o crescimento em diferentes substratos.

As varreduras de potencial superficial dos substratos de aço inoxidável e ouro nus mostraram potenciais superficiais negativos. Discos de aço inoxidável e ouro revestidos com lisina poliol exibiram ambos uma mudança para potenciais superficiais positivos. Os potenciais da membrana celular de MRSA variaram entre as superfícies de aço inoxidável e ouro.

Com o aço inoxidável exibindo um potencial de superfície da membrana significativamente mais positivo para as células em comparação com as células de MRSA sobre o substrato de ouro, que apresentaram potenciais superficiais negativos. Para demonstrar as capacidades completas da KPFM, um exemplo de gráfico de altura de degrau de MRSA sobre aço inoxidável é mostrado aqui. Isso mostra a diferença no potencial de superfície entre a superfície do substrato e a membrana microbiana.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a microscopia de força com sonda Kelvin para examinar os efeitos da carga elétrica na adesão e atividade de células microbianas em diferentes superfícies de substratos materiais.