Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

O objetivo geral do experimento a seguir é observar mudanças na carga da membrana celular após a adesão a diferentes substratos de materiais. Isso é conseguido cultivando os microrganismos em meio rico em nutrientes para aumentar seu número. Em seguida, as superfícies de materiais às quais os microrganismos aderirão são limpas e funcionalizadas para taxas ideais de fixação microbiana.

Em seguida, os microrganismos são revestidos nos vários substratos de materiais para permitir a microscopia de força da sonda Kelvin ou a imagem de KPFM. Os resultados mostram que o tipo de substrato do material e sua carga inerente têm um efeito na atividade celular, conforme visto por mudanças na carga da membrana celular e na adesão celular. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como eletroforético, espalhamento de luz e determinação de ponto isoelétrico, é que o KPFM permite o exame da carga de células e biofilmes individuais em vez de culturas ou colônias inteiras.

Isso é benéfico quando se deseja comparar célula a célula, bem como as características elétricas do biofilme com alta exatidão e precisão. Para começar, prepare placas de ágar sangue de ovelha a 5%, listre a bactéria MRSA nas placas preparadas e incube por 24 horas a 37 graus Celsius para gerar colônias isoladas de poço único. Faça 500 mililitros de caldo de soja tríptico, suplementado com autoclave de glicose a 1% e cloreto de sódio a 0,1%, junto com dois tubos de ensaio de vidro limpos e uma caixa de goles de pipeta de um mililitro.

Depois de permitir que o meio e os tubos de ensaio esfriem sob um gabinete de biossegurança ou perto de pães e queimador, pipete seis mililitros do TSB em cada tubo de ensaio. Usando uma das placas de ágar sangue de ovelha previamente preparadas, inocule uma única colônia de MRSA em um dos tubos. Use o segundo tubo como controle negativo para garantir a esterilidade, incube os tubos em uma incubadora recíproca por 24 horas a 37 graus Celsius e 200 RPM.

O tubo de MRSA deve mostrar crescimento ou nada deve ter crescido no tubo de ensaio de controle. Em seguida, crie uma subcultura usando um mililitro da cultura de 24 horas para inocular seis mililitros de caldo de soja tríptico fresco e incubar a 37 graus Celsius e 200 RPM por mais seis horas. Em seguida, pipetar um mililitro da cultura para o tubo afus e centrifugar a 850 vezes G durante três minutos.

Remova o supinato e use água deionizada para lavar o pellet duas vezes com uma pinça na mão dominante. Segure um disco de amostra FM de aço inoxidável de 20 milímetros e use cinco mililitros de água deionizada para limpar cada lado. Colocar os discos limpos num copo de água desionizada e sonicar durante um minuto após a sonicação.

Use a pinça para remover os discos de amostra do béquer e incline-os em um ângulo aproximado de 60 graus contra a borda de uma placa de Petri aberta em uma toalha de papel Para secar completamente, use a tampa do prato para cobrir os discos de secagem. Depois de seco, transfira o disco para uma placa de Petri para funcionalizar a superfície do disco. Pipete 200 a 400 microlitros de lisina de poliol 0,1% nos discos em um gabinete de biossegurança e temperatura ambiente incubada por uma hora usando uma pinça para segurar os discos.

Use água deionizada para lavá-los, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Próxima placa, 200 a 400 microlitros de células ressuspensas que foram lavadas duas vezes nos discos de amostra revestidos. Depois de incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, use suavemente um mililitro de água deionizada para lavar os discos.

Deixe os discos secarem durante a noite antes da imagem para realizar a imagem de microscopia Kelvin Probe Force. Ligue o computador junto com o microscópio de força atômica ou AFMs, HEB e controlador MAC três. Abra um software de imagem A FM, como o Ulence P ovu overview (Visão geral).

Selecione A-C-A-F-M ou a designação correta para imagens no modo de contato intermitente. Usando uma pinça FM na mão dominante e segurando o suporte do clipe com mola aberto, na outra mão coloque cuidadosamente o cantilever AKPFM no capacete. Carregue cuidadosamente o fone de ouvido no A FM e conecte a luz do laser e stage fios do motor de elevação.

Em seguida, alinhe o laser na ponta do cantilever. Para alinhar o laser na ponta do cantilever. Gire o botão da frente para trás no sentido horário algumas vezes para mover o laser na parte superior do chip cantilever.

Quando o laser atingir o chip, ele será bloqueado e não será mais visível. Em seguida, gire o botão da frente para trás no sentido anti-horário até que o ponto do laser reapareça. O laser está agora na borda do chip.

Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser no balanço. À medida que o laser passa sobre o balanço, ele desaparece e reaparece em rápida sucessão. O ponto do laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade de fotodiodo ficará mais tarde.

Gire o botão da frente para trás no sentido anti-horário para mover o ponto para baixo no cantilever em direção à ponta até que o ponto no vidro fosco desapareça. Agora gire o botão da frente para trás apenas ligeiramente no sentido horário para posicionar o laser de forma que ele fique apenas na ponta do cantilever, o ponto do laser reaparecerá no vidro fosco. Uma vez que o laser esteja alinhado, segure o motor de elevação do estágio na posição aberta por 10 segundos para garantir espaço suficiente entre o cantilever e a amostra.

Ao anexar o sample ao A FM, agora coloque o sample no KPFM stage. Use fio de cobre para aterrar a amostra e conecte os fios apropriados do A FM ao estágio de amostra. Em seguida, conecte o stage ao A FM no software A FM.

Certifique-se de que o tempo de ajuste não seja superior a 10 milissegundos e que as velocidades de aproximação não excedam dois mícrons por segundo. Para evitar danos à ponta, ajuste o cantilever e comece a movê-la em direção à amostra. Quando a ponta do cantilever atingir uma superfície de amostra, selecione um tamanho de janela de imagem e uma área de imagem ideal, otimize os ganhos de olho e P junto com o ponto de ajuste do cantilever para que a imagem topográfica seja otimizada.

Quando a imagem topográfica estiver otimizada, ligue o módulo KPFM no modo FM. Defina a janela de imagem para cinco mícrons por cinco mícrons com resolução de cinco 12 por cinco 12 ou velocidades de varredura lentas. Para configurações FM KPFM, defina a unidade entre cinco e 10%Defina a frequência da unidade entre um e cinco kilohertz com uma largura de banda de dois kilohertz.

Defina os ganhos de NP de ferro para o F-M-K-P-F-M para 0,3%Depois de adquirir imagens KPFM, use o software de processamento de pós-imagem para analisar as imagens e coletar dados de SP usando as configurações descritas neste vídeo de demonstração. As imagens de KPFM foram tiradas em 15 células de MRSA em superfícies de aço inoxidável e ouro. Aqui são mostrados os tipos de imagens coletadas.

Como o KPFM opera usando frequências duplas, imagens topográficas e dados elétricos da superfície da célula foram coletados simultaneamente. Filtros térmicos foram aplicados aos mapas de potencial de superfície para discernir mais facilmente pequenas mudanças no potencial de superfície. Neste gráfico, as imagens foram analisadas para determinar o potencial da superfície da membrana microbiana e, em seguida, usadas para comparar o crescimento em diferentes substratos.

As varreduras de potencial de superfície dos substratos de aço inoxidável e ouro nu mostraram potenciais de superfície negativos gerais. Os discos de aço inoxidável revestidos com poliol lisina e ouro exibiram uma mudança para potenciais de superfície positivos. Os potenciais de membrana celular MRSA variaram entre as superfícies de aço inoxidável e ouro.

Com o aço inoxidável exibindo um potencial de superfície de membrana positiva significativamente maior para as células em comparação com as células MRSA no substrato de ouro que mostraram potenciais de superfície negativos. Para demonstrar todas as capacidades do KPFM, um exemplo de um gráfico de altura de degrau de MRSA em aço inoxidável é visto aqui. Isso mostra a diferença no potencial de superfície entre a superfície do substrato e a membrana microbiana.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microscopia de força da sonda Kelvin para examinar os efeitos da carga elétrica na fixação e atividade das células microbianas em diferentes superfícies de substrato de material.