Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

O objetivo geral dos procedimentos a seguir é fornecer um meio de permitir investigações sobre a causa e o efeito da magaly ventricular e destacar técnicas que permitem o estudo da saúde do sistema ventricular e suas importantes funções de barreira e filtração no cérebro. Isso é conseguido coletando seções coronais do cérebro de camundongo ou exames de ressonância magnética do cérebro humano para gerar reconstruções 3D dos ventrículos e calcular os volumes dos ventrículos como uma segunda etapa do tecido post-mortem que inclui preparações en foss da superfície apical dos ventrículos é corado com anticorpos específicos da célula para revelar a integridade celular do revestimento do ventrículo. Em seguida, uma montagem da organização celular em toda a superfície do ventrículo é preparada e renderizada sobre o modelo 3D do ventrículo para demonstrar regiões de gliose versus células de apêndice intactas.

Os resultados mostram regiões de expansão ventricular com base na modelagem 3D longitudinal dos ventrículos e áreas onde a camada de células do apêndice do revestimento ventricular não está mais intacta, mas substituída por cicatrizes gliais. Ao combinar os dados de modelagem 3D com os dados imuno-histoquímicos, um mapa específico da região 3D da composição celular do revestimento do ventrículo pode ser gerado. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de lesão cerebral, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer e envelhecimento normal, todas as quais normalmente mostram algum nível de expansão ventricular e, portanto, provavelmente escoliose da superfície do ventrículo.

Demonstrando os procedimentos em camundongos estará Richard Wolffer e o aluno de graduação de nossos procedimentos de laboratório realizados usando dados de ressonância magnética humana e tecido humano post-mortem será demonstrado por yeun. Atualmente estudante de medicina e Rebecca Chu, estudante de pós-graduação no laboratório. Prepare as lâminas a serem visualizadas fixando, seccionando, imunocoloração e montando o cérebro do camundongo, conforme descrito na parte escrita do protocolo. Para iniciar o procedimento, para rastrear os ventrículos laterais do camundongo, ligue o microscópio de fluorescência vertical e o computador, o microscópio deve ser equipado com um estágio automatizado e uma câmera digital CCD.

Inicie o software de mapeamento no modo de fluorescência, abra as opções de exibição para carregar as barras de ferramentas e os painéis da piscina de encaixe necessários para o rastreamento. Em seguida, clique em opções, exibir acessórios de opções e selecione as barras de ferramentas principal e de marcador no mesmo menu. Em painéis do pool de encaixe, selecione histograma da câmera, controle multicanal, configurações da câmera e aquisição de imagem.

Identifique o primeiro pedaço de tecido contendo os ventrículos laterais com base na forte fluorescência S 100 beta que rotula as células do apêndice. Revestindo o ventrículo lateral. Oriente os hemisférios esquerdo e direito identificando a pequena incisão feita durante o seccionamento.

Agora crie um novo arquivo de dados e designe um ponto de referência para o movimento do estágio clicando na janela de imagem acima do ventrículo lateral esquerdo. Mantenha esse ponto de referência em um local consistente em relação aos ventrículos laterais nos arquivos de rastreamento. Para ajudar na importação de contornos para reconstrução serial, selecione o tipo de contorno predefinido apropriado no menu suspenso de contorno.

Use uma cor única para cada um dos traçados do ventrículo lateral esquerdo e direito. Agora clique ao longo de toda a superfície apical do revestimento do anexo para traçar o contorno do ventrículo. Mova a janela de rastreamento usando as teclas de seta.

Depois de traçar o contorno, clique com o botão direito do mouse e selecione fechar contorno. Repita o traçado para o ventrículo direito usando uma cor diferente. Em seguida, selecione o marcador apropriado na barra de ferramentas de marcadores à esquerda e clique para soltar um marcador na tela de rastreamento ao longo da linha média para ajudar a alinhar os contornos seriais para reconstrução 3D.

Repita este procedimento para fazer uma segunda marca. Salve os traços de tecido selecionando o arquivo Salvar arquivo de dados como e crie uma nova pasta e nome de arquivo, número dos traçados de acordo com o número do slide da convenção, número do tecido do traço para facilitar a identificação de traços de seções seriais. Em seguida, repita o procedimento que acabamos de mostrar para todas as seções que contêm um ventrículo.

Realizar a reconstrução 3D do ventrículo lateral. Abra o programa de reconstrução 3D. Em seguida, clique em arquivo Abrir e selecione o arquivo de contorno da primeira seção serial de rastreamento.

Importe todos os traçados de contorno do ventrículo esquerdo e direito, bem como quaisquer marcadores adicionados. Alinhe os contornos de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo. Em seguida, selecione todos os contornos no painel esquerdo e clique no botão de visualização 3D para exibir a reconstrução 3D final.

Esta imagem mostra a seção coronal do cérebro de camundongos, incluindo ventrículos laterais delineados por células de apêndice imunorreativas S 100 beta. O asterisco indica os ventrículos laterais. Os suportes delineiam a adesão e a barra de escala representa 500 mícrons.

Os ventrículos laterais do camundongo são traçados como contornos e organizados como seções de subsegmento. As regiões intraventriculares são eliminadas de interferir na análise volumétrica. Esta imagem mostra a reconstrução 3D final dos contornos do ventrículo lateral.

A cor amarela representa o contorno de volumes cerebrais inteiros abrangendo a região de interesse que contém os ventrículos laterais. Você deve ter uma boa compreensão de como criar reconstruções de ventrículo 3D de tecido cerebral fatiado em Corona Os protocolos são listados para criar reconstrução de imagem 3D e quantificação volumétrica de ventrículos laterais e para avaliar mudanças volumétricas ao longo do tempo usando análise de sobreposição longitudinal, é importante observar que a consistência na RM. A coleta de dados R e o processamento pós-aquisição são critérios extremamente importantes para a inclusão de conjuntos de dados Para realizar a segmentação ventricular, o ITK SNAP é usado para segmentar os ventrículos a partir de imagens de RM ponderadas em T um de alta resolução. Depois de iniciar o programa, abra a imagem em tons de cinza, selecione o arquivo desejado e abra-o como um arquivo bacana.

Em seguida, percorra cada plano anatômico e observe anormalidades ventriculares, como regiões do nariz, cornos temporais grandes ou pequenos ou similares. Em seguida, na caixa de ferramentas principal, clique em cobra, ferramenta ROI. Em seguida, segmente 3D e selecione a opção de região de intensidade.

Agora clique em pré-processar imagem e selecione acima. Registre a intensidade máxima usando a barra deslizante. Em seguida, defina o limite para 15% da intensidade máxima e registre esse valor.

Isso deve destacar o ROI em branco. Defina o parâmetro de suavidade como 10. Clique em OK.

Então em seguida. Em seguida, adicione 10 a 12 bolhas pequenas a cada ventrículo. Dois no corno frontal anterior, sete espaçados uniformemente ao longo da superfície superior do corpo do ventrículo lateral, um no corno occipital e um no corno temporal do ventrículo lateral.

Em seguida, selecione os parâmetros e defina a força de curvatura para 0,4. Em seguida, clique no símbolo de reprodução para iniciar a evolução ativa do contorno. Agora clique em atualizar malha para visualizar a superfície.

Em seguida, verifique a atualização automática. Interrompa o processo de segmentação quando todas as áreas do ventrículo lateral estiverem incluídas na região de interesse. Evite a inclusão do terceiro ventrículo.

Por fim, clique em concluir e salve os resultados da segmentação como um formato de arquivo bacana. Para obter o volume total do ventrículo, selecione segmentação, volume e estatísticas obtenha o volume total do ventrículo usando o rótulo de cor definido. Neste segmento, as ROIs longitudinais são sobrepostas usando o software mango para demonstrar qualitativa e quantitativamente as mudanças no volume ventricular dentro dos indivíduos ao longo do tempo.

Depois de abrir o software, clique em abrir, abra o arquivo carregue o arquivo bacana salvo anteriormente. Depois que o arquivo de imagem for carregado, clique em ROI de carregamento de arquivo e carregue o ROI do ponto de tempo do ROI de linha de base como verde. Clique em ROI de carregamento de arquivo e carregue o segundo ponto de tempo de ROI em vermelho.

Salve a sobreposição longitudinal selecionando o ROI de salvamento de arquivo, atribua a cada imagem um nome de arquivo de acordo com a convenção agora mostrada na tela. Em seguida, abra o snap do ITK. Em seguida, reabra o ROI combinado como um ROI combinado de carregamento de imagem em escala de cinza selecionando a carga de segmentação do arquivo de ROI combinado de imagem para obter dados de volume longitudinal, execute o volume e as estatísticas de segmentação a seguir.

Rótulo um vermelho é igual a rótulo de volume de expansão dois verde é igual a rótulo de volume de estenose três azul é igual a volume base, começando com um hemisfério intacto que foi fixado em 10% Formina por no máximo seis semanas e enxaguado abundantemente com fatia de PBS de 0,1 molar, cortes coronais de 1,5 centímetro de espessura em todo o hemisfério usando uma faca grande usando um bisturi microcirúrgico. Disseque a parede do ventrículo com um centímetro de profundidade, mantendo uma seção contínua para toda a parede lateral, subdivida a parede conforme necessário para criar seções de tamanho apropriado para coloração. Bem, entalhe a seção no lado oposto da parede do ventrículo.

Para identificar a orientação superior inferior, realizar imuno-histoquímica e montar os cortes de acordo com o protocolo escrito. Sob um escopo de dissecação, prenda o tecido usando pinos com uma faca microcirúrgica, crie uma seção uniformemente fina da parede do ventrículo lateral e monte um penem de lado em uma lâmina Quando as lâminas estiverem totalmente secas, examine as seções por microscopia confocal de imunofluorescência. Defina o plano focal de imagem na superfície do ventrículo conforme determinado pelo uso de beta-catenina, um marcador para aderência apical.

Proteínas de junção de células anexadas. Em seguida, delineie as regiões de cobertura celular anexada e astrogliose de superfície de acordo com a coloração GFAP na superfície do ventrículo para documentar e montar toda a superfície do ventrículo. Use imagens sobrepostas de toda a superfície para criar uma montagem de imagens seriais.

Abra o Adobe Photoshop e use o layout interativo de emergência automática de arquivos para selecionar imagens a serem sobrepostas, fazendo ajustes manuais, se necessário. Crie uma nova camada para traçar a montagem para gerar uma representação de desenho animado intacta. Dependendo da cobertura celular ou da escoliose G da superfície do ventrículo, compile todas as seções para reconstruir o mapa da parede do ventrículo e vincule à região correspondente na reconstrução da ressonância magnética.

Esta é a montagem de imagens de RM humana aqui. O ventrículo lateral foi definido como a região de interesse em vermelho. A reconstrução da imagem 3D, como mostrado aqui, permite a quantificação volumétrica e a visualização qualitativa do ventrículo lateral.

Esta imagem mostra a avaliação da expansão longitudinal do ventrículo em um paciente idoso. As ressonâncias magnéticas longitudinais de vários pontos podem ser alinhadas e sobrepostas para visualizar e quantificar a expansão do volume do ventrículo dentro dos indivíduos ao longo do tempo. Essas três últimas imagens mostram avaliação imuno-histoquímica e mapeamento regional da superfície do ventrículo lateral humano. Aqui.

As áreas de células do apêndice intactas delineadas por beta-catina e coloração mostram uma aparência de paralelepípedo conforme indicado pelo asterisco e são demarcadas por uma linha pontilhada de regiões de astrogliose na superfície do ventrículo delineadas pela coloração GFAP. Imagens confocais seriais são sobrepostas para gerar uma montagem regional e traçadas usando o Adobe Photoshop ou uma representação de desenho animado da organização celular na superfície do ventrículo. Esta imagem de desenho animado da montagem é mapeada para a superfície do ventrículo na reconstrução ventricular 3D baseada em ressonância magnética correspondente.

Como mostrado, a cor verde indica apêndice intacto e as áreas vermelhas da gliose. Ao realizar este procedimento, é importante manter uma documentação cuidadosa de cada amostra de tecido para realizar a reconstrução seriada e o mapeamento da integridade celular. Após este procedimento, outros métodos, como a subsegmentação dos ventrículos laterais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expansão específica da região ao longo do tempo.