Uma perspectiva técnica em Modern Tree-anel Research - Como superar dendroecologia e Madeira anatômicas Desafios

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar madeira bem replicada e altamente resolvida. Um conjunto de dados anatômicos para estudar os efeitos do tempo e dos fatores ambientais no crescimento de árvores e arbustos. Isso é conseguido usando um fluido não newtoniano para estabilizar as células vegetais durante o seccionamento do micrótomo, permitindo uma análise microscópica detalhada das amostras como uma segunda etapa.

As microseções são duplamente coradas para facilitar a diferenciação das células lignificadas e não lignificadas e, em seguida, são tiradas imagens digitais das amostras. Em última análise, análises automatizadas baseadas em células do crescimento da planta e análises de séries temporais relacionadas podem ser realizadas para permitir a avaliação dos parâmetros anatômicos da madeira de interesse. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o envio da pontuação da amostra, é que, com nossas técnicas, as células não são preenchidas com serragem, resultando em amostras de qualidade muito clara para análise de imagem.

Além disso, a adição de um fluido não Newton às células durante a seccionamento permite evitar a técnica demorada de incorporar a amostra em parafina. Os novos micrótomos que veremos no vídeo foram desenvolvidos em nosso laboratório de incorporação do centro de Lu Netti de Shang Dubs e Zurique. Destacam-se pela alta estabilidade da guia, que permite o corte de corpos de prova grandes e densos.

Para amostragem de núcleo de caules de árvores. Comece colocando um núcleo de incremento afiado perpendicular ao eixo de crescimento do caule da árvore. Em seguida, vire o núcleo e use um extrator para remover a amostra de núcleo resultante da árvore.

Rotule o núcleo com um ID específico marcado com lápis macio na superfície do núcleo e repita o procedimento no lado oposto do caule quando todas as amostras tiverem sido coletadas. Armazene os núcleos rotulados em um recipiente apropriado para protegê-los contra danos durante o transporte. Em seguida, uma vez de volta ao laboratório, monte as amostras de núcleo na direção da fibra, na vertical em vigas de suporte de madeira com cola de madeira resistente à água e deixe-as secar para micro amostragem de núcleo.

Primeiro, use um cinzel para remover uma parte da casca conforme necessário. Em seguida, coloque um dispositivo de perfuração especial perpendicular ao eixo de crescimento no caule que acabou de demonstrar e use um martelo para penetrar no xilema do caule a cerca de dois centímetros de profundidade. Gire o dispositivo de perfuração para quebrar o micro núcleo resultante dentro da ferramenta.

Em seguida, remova o núcleo da haste e armazene-o em um tubo de microcentrífuga rotulado. Para cortar uma superfície plana em uma amostra de núcleo, comece fixando o núcleo de incremento de interesse no suporte do núcleo de um micrótomo de núcleo recém-desenvolvido para cortar superfícies planas em núcleos em toda a sua extensão. Em seguida, levante o núcleo até que ele toque levemente a lâmina, que é fixada em uma orientação de rolamento de esferas sobre a extensão do núcleo, e puxe a lâmina para cortar a primeira parte da parte superior do núcleo.

Em seguida, empurre a faca atrás do núcleo. Levante o porta-amostras cerca de 10 mícrons e repita o procedimento de corte até aproximadamente um terço do núcleo. O diâmetro é reduzido resultando em uma superfície plana contínua.

Para uma análise detalhada da imagem da estrutura anatômica das amostras, micro cortes devem ser preparados com outro tipo de micrótomo. Primeiro, fixe a amostra central de interesse no suporte do micrótomo do micrótomo. Em seguida, posicione a lâmina do micrótomo guiada pela orientação do rolamento de esferas e puxe a lâmina sobre o núcleo.

Empurre a lâmina para trás para levantar a amostra em 20 a 30 mícrons. Em seguida, puxe a lâmina sobre a amostra. Novamente, repetindo esse processo até que uma superfície contínua seja criada no topo da amostra.

Agora, usando um pincel, cubra a superfície resultante com uma solução de amido de milho. Em seguida, levante a amostra em 15 mícrons e coloque o pincel na superfície da amostra. Puxe as lâminas lentamente em direção à amostra, começando um corte fino abaixo da escova e usando a escova para guiar a seção na superfície da lâmina quando toda a seção tiver sido cortada.

Use outra escova e água para remover o tecido da lâmina e coloque-o em uma lâmina de vidro para permitir a distinção entre as estruturas lignificadas e não lignificadas. Lave o glicerol com água usando uma pipeta. Em seguida, cubra a seção úmida com algumas gotas de uma mistura de açafrão e azul astro.

Após cinco minutos, lave os corantes com água e desidrate imediatamente a seção com sucessivos tratamentos com etanol. Após o tratamento com etanol desidratado, enxágue a seção repetidamente em 100% xol. Assim que o xol ficar claro.

Cubra o tecido com uma gota de bálsamo 100% Canadá e uma lamínula tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Em seguida, coloque a microlâmina resultante entre duas tiras de plástico resistente ao calor e coloque-a em uma placa de metal. Coloque um peso em cima da lâmina para manter a seção plana e, em seguida, coloque a lâmina em um forno a 60 graus Celsius.

Após 12 horas, deixe a lâmina esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, remova o peso e a tira de plástico. Finalmente, limpe a lâmina usando lâminas de barbear para remover qualquer excesso de bálsamo, seguindo os procedimentos de seccionamento e coloração apresentados antes de se preparar todos os tipos de amostras de diferentes tamanhos e formas, também usando suportes especiais para criar imagens digitais das superfícies do núcleo para análise do vaso. Primeiro, corte o plano da superfície do núcleo com o micrótomo do núcleo, conforme demonstrado, e use um marcador de feltro para manchar a superfície resultante de preto.

Assim que o corante secar, esfregue a superfície do núcleo com giz branco e pressione o giz nas células com um dedo. Remova qualquer excesso de giz e, em seguida, coloque o núcleo no palco de um microscópio binocular equipado com uma câmera digital começando em um lado do núcleo. Agora adquira uma sequência de imagens ligeiramente sobrepostas até que toda a superfície seja capturada.

Em seguida, junte as imagens individuais para criar uma imagem completa da superfície do núcleo para criar imagens digitais a partir das microlâminas. Coloque a lâmina na platina do microscópio e escolha a ampliação apropriada para as estruturas a serem analisadas. Por fim, adquira imagens sobrepostas das seções montadas nas microlâminas limpas, conforme demonstrado para a amostra da superfície do núcleo, e junte as imagens para criar uma imagem completa da seção.

A capacidade de ter células abertas é um primeiro passo importante para a adaptação de estruturas anatômicas dendroecológicas em uma análise de séries temporais. Para uma análise mais detalhada das traqueias de madeira precoce ou tardia em coníferas, são necessárias microsseções de alta qualidade aqui. Artefatos potenciais, como paredes celulares quebradas, precisam ser evitados.

A aplicação de um fluido não newtoniano à amostra, como a solução de amido de milho, como acabamos de demonstrar, suporta a estabilidade da estrutura celular. As micro seções permitem uma determinação mais segura das classificações anuais. Isso é especialmente verdadeiro para as coníferas que crescem em seus limites naturais.

Como visto aqui, anéis extremamente estreitos são frequentes, mas difíceis de detectar macroscopicamente. Em casos extremos, os anéis consistem em uma ou duas fileiras de células, que só podem ser visíveis ao usar micro seções. Ao analisar imagens em grandes ampliações, células únicas são visíveis.

O software de análise semiautomática permite que as alterações em parâmetros únicos, como a espessura da parede celular, sejam determinadas para todos os anéis visíveis na imagem, indicando a necessidade de uma análise de série temporal estendida. A dupla coloração das micro seções permite a visualização das diferentes etapas da lignificação. Essas informações podem então ser relacionadas aos dados ambientais do respectivo período de vegetação para determinar uma relação de crescimento climático mais detalhada após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da ecologia DRO explorarem os vários parâmetros anatômicos de árvores e arbustos. O uso desse método reduz drasticamente o tempo necessário para produzir seções grandes e de alta qualidade. Precauções como trabalhar abaixo de um exaustor e usar luvas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar conjuntos de dados anatômicos bem replicados e altamente resolvidos para dar suporte à análise de séries temporais.