Name: Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a criar géis de poliacrilamida para ensaios de invadopódia e força de tração em células cancerosas. Este método permite analisar como a rigidez da matriz afeta a atividade invasiva e a contratilidade celular.

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1. Preparação de lamelas de vidro para PAAs <ol><li> Limpos 12 lamelas mm com toalhetes baixos fiapos. </li><li> Chama as lamelas 12 milímetros e 14 milímetros a lamela na microplaca de cada 35 milímetros prato de vidro de fundo, passando-os através de uma chama do queimador de Bunsen, usando uma pinça. </li><li> Tratar os micropoços com 200 uL de NaOH 0,1 N durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar e secar os micropoços para 30 min. </li><li> Tratar os micropoços com 50-100 ul de 3-aminopropiltrimetoxisilano, durante 10 min à temperatura ambiente, na hotte. Este produto químico reage com plástico; portanto, use pipetas de vidro e não preencher os micropoços completamente para evitar contato com o plástico prato. </li><li> Lave os micropoços com água ultrapura para cerca de 10 min até que o 3-aminopropiltrimetoxisilano se torna claro. </li><li> Lave os micropoços com água ultrapura duas vezes utilizando uma garrafa squeeze. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura umtemperatura ambiente t em um balancim fixado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min. </li><li> Aspirar e secar os micropoços para 30 min. </li><li> Tratar os micropoços com 2 ml de solução de glutaraldeído a 0,5% à temperatura ambiente num agitador rotativo ajustado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 30 min. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura à temperatura ambiente num agitador rotativo à velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min. Repita duas vezes mais para um total de 30 min. </li><li> Micropoços seco a um ângulo inclinado (60º ou superior) por 30 min. Nota: Os pratos pode ser armazenada durante 2 meses num exsicador. </li></ol> 2. Preparação de PAAs para Invadopodia Ensaios <ol><li> Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 574 ul de água ultrapura (Tabela 1). </li><li> Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 &amp; #181; l de 2% BIS, e 409 ul de água ultrapura (Tabela 1). </li><li> Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 169 ul de água ultrapura (Tabela 1). </li><li> Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano em água ultrapura com as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Para todas as soluções, adicionar 1 ml de 10 mg / ml de ácido acrílico N-hidroxissuccinimida (NHS), éster de 5 uL de um / ml de persulfato de amónio, 100 mg e 2 ul de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina (TEMED ; Tabela 1). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (L) </td><td> 2% (L) </td><td> Ultrapura Água (L) </td><td> 1 mg / ml FN (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Éster (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / mL APS (L) </td><td> TEMED (L) </td><td> Elástico Módulo (Pa) </td></tr><tr><td> Macio </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rígido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAAs macios, duros e rígidos utilizados nos ensaios invadopodia. AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio. <ol start="5"><li> Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço. Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura. </li><li> Com cuidado, abaixe o lado inflamado da lamela 12 milímetros para a gota na microplaca, usando uma pinça. </li><li> Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando a solução restante. </li><li> Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça. Nota: 10x PBS é feita em laboratório e composto de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, e 0,056 M de Na 2 HPO 4. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li></ol> 3. Preparação de PAAs para TRACCÇÃO Ensaios <ol><li> Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 566 ul de água ultrapura (Tabela 2). </li><li> Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 ul de 2% BIS, e 401 ul de água ultrapura (Tabela 2). </li><li> Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 161 ul de água ultrapura (Tabela 2). </li><li> Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina do plasma humano para as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Sonicate 8 l de 200 nm microesferas vermelhas fluorescentes (excitação / emissão de 580/605 nm) para 30 seg. Para cada solução, adicionar 8 l de 200 microesferas fluorescentes vermelhas nm,1 uL de 10 mg / ml de ácido acrílico, éster NHS 5 ul de um / ml de persulfato de amónio a 100 mg, e 2 ul de TEMED (Tabela 2). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (L) </td><td> 2% BIS (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapura Água (L) </td><td> 1 mg / ml FN (L) </td><td> As micro-esferas (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Éster (L) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / mL APS (L) </td><td> TEMED (L) </td><td> Elástico Módulo (Pa) </td></tr><tr><td> Macio </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rígido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabela 2:. Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAA macios, duros, rígidos e utilizados nos ensaios de força de tracção AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio. <ol start="5"><li> Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço. Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura. </li><li> Com cuidado, abaixe o lado inflamado de the 12 milímetros lamela sobre a gota na microplaca, usando uma pinça. </li><li> Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando solução restante. </li><li> Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li></ol> 4. Preparação de ECM para Invadopodia Ensaios <ol><li> Aquece-se a solução de gelatina (gelatina a 1% e 1% de sacarose) a 37 ° C. </li><li> Tratar o SAP com 150 ul da solução de gelatina, durante 1 min, em seguida, cuidadosamente aspirado a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo num ângulo de 45 °. </li><li> Seca-se a camada fina remanescente de gelatina sobre o SAP nos micropoços em um ângulo agudo (60 ° ou maior) para optimizar a secagem durante 60 minutos. </li><li> Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de glutaraldeído a 0,5% refrigerado em ice durante 15 minutos, seguido por temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li><li> Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de boro-hidreto de sódio durante 1 min. Bater levemente pratos na bancada para remover as bolhas que se formam sobre a superfície da gelatina. </li><li> Aspirar e lavar os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li><li> Dilui-se uma solução de fibronectina de plasma humano marcada com FITC a 50 ug / ml com um 1x PBS e centrifugar a 175.000 x g a 4 ° C durante 15 min. Ou comprar comercialmente disponível fibronectina rotulados ou rotulá-la da seguinte forma: <ol><li> Dissolve-se 5 mg de fibronectina em 10 ml de tampão borato (170 mM de tetra-hidrato de metaborato de sódio e 40 mM de NaCl) e o lugar em tubagem de diálise. </li><li> Rotular a fibronectina, colocando o tubo em 200 ml de tampão de borato contendo 6 mg de FITC dissolvido à temperatura ambiente num agitador magnéticodefinido na configuração mais baixa para 1,5 horas no escuro. </li><li> Dialisar com 500 ml de uma 1x PBS num agitador magnético definido no nível mais baixo durante 3 dias num quarto escuro frio (4 ° C) com dois volumes muda de um dia. </li><li> Calcular a concentração de fibronectina marcada com FITC com base na densidade óptica de aliquotas diluídas (1: 200) a 280 nm e 493 nm como [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 vezes o factor de diluição de 2 vezes 200 (que corresponde para a concentração de glicerol a fibronectina no passo seguinte), resultando em unidades de mg / ml. </li><li> Dialisar durante a noite numa solução de glicerol a 50% num agitador magnético definido no nível mais baixo durante a noite numa câmara fria a 4 ° C). </li></ol></li><li> Tratar os micropoços com 150 ul de solução de fibronectina marcada com FITC à temperatura ambiente durante 60 min no escuro. </li><li> Aspirar cuidadosamente a solução de fibronectina marcada com FITC a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo emum ângulo de 45 ° e, em seguida, encher os pratos de vidro de fundo com solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante 10 min, a uma capa de cultura de células para a esterilização escuro. Preencha também tampas de vidro prato fundo ou limpar com lenços lint baixa embebido em álcool 70%. </li><li> Lavar pratos com fundo de vidro, preenchendo-os com 1x PBS por 5 min. Repita duas vezes mais com 2 ml de PBS 1x para um total de 15 min. </li></ol> 5. Preparação e imagem das Invadopodia Ensaios <ol><li> Adicionar 25.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia (1: 1 de DMEM e meio RPMI 1640 com 5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico adicionada de fresco) para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite. </li><li> Aspirar e tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de paraformaldeído a 3,7% à temperatura ambiente no escuro durante 20 minutos para fixar as células. </li><li> Após duas lavagens rápidas com 2 ml de PBS 1x, tratar os micropoços com 2 ml de Triton X-100 a 0,1% na solução tempe quartoratura no escuro durante 5 min para permeabilizar as células. </li><li> Depois de uma lavagem rápida com 2 mL de PBS 1x, tratar os micropoços com 3% de albumina de soro bovino solução à temperatura ambiente de bloqueio no escuro durante 60 min para bloquear as células. </li><li> Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de ratinho anti-cortactina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li><li> Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de cabra anti-rato de anticorpo 633 (1: 500) e 546 faloidina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio. </li><li> Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min. </li><li> Adicione seis gotas de meio de montagem para preencher cada micro e cubra com 22 x 22 lamelas. </li><li> Cortactina Imagem e actina para identificar invadopodia usando filtros de excitação e emissão de 632/647 nm e556/570 nm, respectivamente, utilizando uma lente de imersão em óleo de elevada NA, 40X sobre uma ampla microscópio de campo invertido. Da mesma forma, a fibronectina imagem para identificar a degradação de ECM utilizando um filtro de excitação e de emissão de 492/518 nm. </li></ol> 6. Preparação e imagem das TRACCÇÃO Ensaios <ol><li> Adicionar 15.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite. </li><li> Aspirar o meio em pratos de vidro de fundo e substituir com 2 ml de meio L-15, com os mesmos suplementos (5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico) adicionado de fresco, pré -warmed a 37 ° C. </li><li> Incubar as placas de fundo de vidro em uma câmara ambiental em um microscópio invertido pré-equilibrado a 37 ° C, com humidade elevada durante 1 h. </li><li> Tome quatro conjuntos de imagens usando uma NA alta, 40X lente em um microscópio de campo amplo invertido com um estágio automatizado para marcar posições celulares: <ol><li> Células de imagens sobre ap dos PAAs usando contraste de fase (imagem de &quot;fase&quot;). </li><li> Imagem microesferas fluorescentes de excitação e emissão filtros de 560/645 nm, concentrando-se ligeiramente sob as células até a primeira camada de microesferas no topo dos AAP entra em foco (&quot;estressado&quot; imagem). </li><li> Além disso, o foco para o fundo do PAA (usando as microesferas como marcadores) e tomar uma imagem (imagem de &quot;fundo&quot;). Nota: A finalidade desta imagem é para registrar a posição z para obter a espessura PAA real em cada posição para cálculos de força de tração, conforme descrito em Resultados representativos. </li><li> Depois dessas imagens foram adquiridas em múltiplas posições, misturar suavemente em 220 ul de solução a 10% de Triton-X para remover as células. Microesferas de imagem no topo do SAP em cada posição conforme anteriormente descrito (imagem &quot;nula&quot;). </li></ol></li></ol>

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número K25CA143412 (Parekh). Gostaríamos de reconhecer que o apoio adicional foi fornecido pelo Departamento de Otorrinolaringologia. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

Apresenta-se um método para a fabricação de PAA que podem ser usados ​​como a base para invadopodia força de tracção e ensaios para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrácteis. Enquanto PAAs têm sido muito utilizados para analisar os efeitos da rigidez nas células e calcular forças de tração 18,24,27, este protocolo é o primeiro a desenvolver ensaios paralelos baseados em PAAs com os mesmos factores de rigidez para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contráteis em resposta a ...

A rigidez da ECM associado a tumor tem sido identificada como um factor significativo na condução comportamento maligno, aumentando a contractilidade actomiosina 1-3. Embora este efeito principalmente tem sido demonstrado com células de cancro da mama, a rigidez da matriz foi encontrado para alterar as propriedades invasivas das células derivadas de uma variedade de cancros o que sugere que 4-8 rigidez tumoral podem desempenhar um papel em outros tipos de cancros. Para penetrar tecidos reticulados durante a migração invasiva, as células cancerosas utilizam saliências adesivas ricas em actina conhecidos como invadopodia que localizar proteinases para degradar focally o ECM 9. Invadopodia são consideradas uma característica de células invasivas e têm sido implicados na invasão de células de tumores e metástases 10,11. Os trabalhos anteriores mostraram que a rigidez da matriz pode regular números invadopodia e associado ECM degradação 4,12 através da atividade da miosina II e proteínas mechanosensitive 12. Considerando acorrelação entre a densidade e a agressividade do tumor do cancro 13,14, estes resultados sugerem um mecanismo pelo qual as células cancerígenas podem responder aos tecidos rígidos de tumor para dirigir a invasão e metástases através de actomiosina contractilidade. Em rigidez MEC in vitro e em densidade do tecido vivo têm sido mostrados para regular o comportamento invasivo das células cancerosas 1,15-17. Enquanto actomiosina contractilidade parece ser importante neste processo, estudos actual conflito a respeito de se a capacidade metastática está correlacionada com o aumento ou a diminuição da força contráctil 6,18-20. Além disso, não se sabe se essas forças mediar diretamente a atividade invadopodia 21. Recentemente, descobriu que forças contráteis da célula cancerosa eram dependentes de rigidez da matriz e foram preditivos de degradação ECM por invadopodia 5. Estes resultados sugerem que as forças celulares podem desempenhar um papel importante na progressão do cancro pela mediação invadopodia acdade em resposta às propriedades mecânicas do microambiente do tumor. Para correlacionar propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas, 5, modificamos um protocolo para a criação de PAAs com diferentes rigidez que anteriormente foi usado para investigar a atividade invadopodia dependente da rigidez 4,12,22. Por reticulação química fibronectina do plasma humano ao longo do PAA, estes hidrogéis modificadas podem ser utilizadas como a base para ambas invadopodia e ensaios de força de tracção para assegurar que as células experimentado as mesmas em ambas as experiências rigidez 5. Nos ensaios invadopodia, a fibronectina fornece um domínio de ligação natural para gelatina para ligar o ECM sobreposta para o SAP para detectar a degradação da matriz. Nos ensaios de força de tração, a fibronectina fornece um ligando para adesão celular direto para detectar deslocamentos de microesferas utilizadas para calcular as forças de tração celulares. Este método resulta em o que temos chamado macio, duro,e PAAs rígidas que são obrigados a pratos com fundo de vidro e têm módulos elásticos, E, de 1023, 7307 e 22692 Pa 5, que abrange a gama de propriedades mecânicas reportados para os tecidos normais e cancerosos 23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropiltrimetoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>preparar fresco em capela de exaustão 10 mg/ml em DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>também pode usar rodamina</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>prepare uma solução fresca a 10% em 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>use 6 gotas para encher micropoços</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>faça 3% para solução de bloqueio em 1x PBS e armazene em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Lamínulas (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>tubo de diálise</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>pré-equilíbrio em tampão borato por 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>uso para fazer meio invadopódios</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>uso para fazer solução de éster NHS de ácido acrílico</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>Vida útil Tecnologias</td><td>PHG0311</td><td>uso para fazer invadopodia meio</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>diluir com água ultrapura para 70%</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>usar para fazer invadopódios meio</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>proteger da luz</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 &deg; C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente)</td></tr> <tr><td>Pratos com fundo de vidro (lamínulas de 35 mm)</td> As <td>lamínulas</td> <td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td> são</tr><tr><td>glutaraldeído não revestido (25%)</td> <td>Polysciences</td><td>01909</td><td>diluído com 1x PBS para 0,5%</td></tr> <tr><td>Anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 633</td> Life <td>Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasmática humana</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>adicione 5 ml de água ultrapura para fazer 1 mg/ml; alíquota em volumes com base no uso para evitar ciclos excessivos de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>use para fazer 10x estoque PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-cortactina 4F11 anticorpo</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>use para fazer 10x estoque PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>use para fazer 10x estoque PBS e tampão de borato</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>diluir com água ultrapura para 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (soro de baixa proteína)</td> <td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>use para fazer meio invadopódio</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>normalmente fazem 10% de estoque em 1x PBS, preparam em capela de exaustão e adicionam alguns ml de NaOH forte para dissolver o paraformaldeído facilmente e, em seguida, trazem de volta ao pH 7,4 com HCl forte)</td></tr><tr><td>PBS (estéril)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>uso para cultura de células</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>uso para fazer meio invadopódio</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>preparar fresco em capela de exaustão 1 mg/ml em 1x PBS</td></tr><tr><td>Metaborato de sódio tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>use para fazer tampão borato</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>normalmente faça 10 ml de solução de sacarose a 1% / gelatina a 1% em PBS e armazene a 4 &deg; C (pré-aqueça PBS para dissolver a gelatina facilmente)</td></tr> <tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>faça 10% de estoque em 1x PBS e use como está para remoção de células em ensaio de força de tração ou dilua com 1x PBS para coloração</td></tr></tbody></table>

géis de poliacrilamida para invadopodia e tração força ensaios sobre as células cancerosas

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Tecidos tumorais rígidas têm sido fortemente implicado na regulação da migração e invasão de células de cancro. Migração invasivo através de tecidos de ligação cruzada é facilitada por saliências ricos em actina chamados invadopodia proteoliticamente que degradam a matriz extracelular (ECM). Atividade Invadopodia demonstrou ser dependente de rigidez ECM e contráteis da célula cancerosa forças sugerindo que sinais de rigidez pode regular estas estruturas subcelulares através actomiosina contratilidade. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Enquanto existem algumas variações entre os dois ensaios, o protocolo aqui apresentado fornece um método para a criação de PAA thno pode ser usado em ambos os ensaios e são facilmente adaptáveis ​​às necessidades biológicas e técnicas específicas do usuário.

No ensaio invadopodia, invadopodia são tipicamente identificadas por uma co-localização de marcadores como actina e cortactina em estruturas puntiformes dentro do corpo celular (Figura 1). Ambos degradar de forma activa e não-degradante invadopodia pode ser contado e são diferenciados por se estas estruturas são co-localizada com as áreas pretas falta de sinal fluorescente no fibronectina marcada com FITC (Figura 1). Invadopodia são contadas manualmente, e a degradação de ECM por célula...

Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

O objetivo geral deste procedimento é criar géis de poliacrilamida que possam ser utilizados em ensaios de invasão, podia e força de tração para estudar as propriedades invasivas e contráteis de células cancerígenas. Isso é realizado primeiramente ativando as lamínulas de 14 milímetros nas placas de vidro para garantir que os géis de poliacrilamida fiquem ligados ao vidro. Em seguida, preparam-se soluções de poliacrilamida para ambos os ensaios, a fim de obter géis com diferentes rigidezes ou propriedades mecânicas.Em seguida, os ensaios de podia invadida são preparados com uma fina camada de matriz extracelular marcada com fluoróforo para detectar a degradação. Por fim, os ensaios são semeados com células cancerígenas para incubação durante a noite, seguida de fixação e coloração do invasor, das placas de podia e de imagem de células vivas nas placas de força de tração. Em última instância, a microscopia de fluorescência é utilizada para imagens do invasor, da podia e da degradação da matriz extracelular.Embora a microscopia de fluorescência e de campo amplo seja usada para imagens de microesferas e células, respectivamente, para cálculos de força de tração, demonstrará o procedim

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste vídeo, demonstramos as técnicas experimentais usadas para fabricar compliant, matriz extracelular (ECM) substratos revestidos adequado para cultura de células, e que são passíveis de microscopia de força de tração e observando os efeitos da rigidez ECM no comportamento de células.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Este vídeo descreve o ensaio de microscopia de força de tração. O ensaio determina a tração celular das células cancerígenas do cólon humano na matriz extracelular presente no hidrogel elástico macio com esferas fluorescentes incorporadas. O deslocamento resultante de grânulos fluorescentes é medido usando um software apropriado.

Ensaio de citometria de tração: um método para quantificar a força de tração exercida por células cancerígenas na ECM

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

O nosso laboratório desenvolveu hidrogéis de poliacrilamida reticulada-ADN, um sistema dinâmico de hidrogel, para compreender melhor os efeitos da modulação da rigidez do tecido sobre a função das células. Aqui, nós fornecemos esquemas, descrições e protocolos para preparar estes hidrogéis.

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Um protocolo é descrito para extrair células humanas primárias de tumores cirúrgicos de cólon e tecidos normais. As células isoladas são então cultivadas em substratos elásticos macios (hidrogéis de poliacrilamida) funcionalizados por uma proteína de matriz extracelular e incorporados com microesferas fluorescentes. A citometria de tração é realizada para avaliar os estresses contráteis celulares.

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

Aqui, é descrito um método que permite a preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. O método não requer nenhum equipamento especializado e pode ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa. Seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Para avançar, os cones de crescimento devem exercer forças de tração contra o ambiente externo. A geração de forças de tração depende da dinâmica actin e do acoplamento da embreagem. O presente estudo descreve métodos para analisar a dinâmica do actin, acoplamento de embreagem e forças de tração para o avanço do cone de crescimento.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Aprenda a criar géis de poliacrilamida para ensaios de invadopódia e força de tração em células cancerosas. Este método permite analisar como a rigidez da matriz afeta a atividade invasiva e a contratilidade celular.

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

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