Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em

O objetivo geral deste procedimento é usar células de levedura para encontrar os processos biológicos visados por um produto químico de interesse. Isso é feito determinando primeiro o perfil de resposta à dose de um produto químico para levedura. O segundo passo é cultivar uma coleção completa de cepas nocaute de genes de levedura em uma dose subletal de produto químico e em uma placa de controle.

Em seguida, mutantes de levedura que são hipersensíveis ao produto químico são identificados. Esta lista é analisada bioinformaticamente para revelar todos os genes necessários para tolerar o produto químico. A etapa final é realizar uma réplica biológica do experimento em baixo rendimento.

Isso valida quaisquer interações químicas de genes encontradas. Em última análise, esse método de triagem genética química de alto rendimento é usado para mostrar quais produtos gênicos e vias biológicas são usados para tolerar o produto químico de interesse. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o crescimento competitivo de mutantes com código de barras em cultura líquida, é que nenhuma técnica de biologia molecular é necessária.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química, como como uma nova molécula pequena pode inibir o crescimento de células eucarióticas. Para começar, prepare uma cultura de levedura durante a noite listrando BY 4 7 4 1 células em uma placa A-Y-E-P-D e incube por 48 horas a 30 graus Celsius ou até que se formem colônias visíveis. Quando as colônias estiverem prontas.

Prepare culturas líquidas durante a noite escolhendo uma única colônia e inoculando cinco mililitros de meio líquido YEPD em um recipiente estéril. Em seguida, incube durante a noite a 30 graus Celsius com rotação contínua ou agitação. Em seguida, prepare um meio de ágar sólido contendo várias doses do produto químico a ser testado.

Para fazer isso. Primeiro, prepare várias soluções de estoque do produto químico de interesse a 100 vezes a concentração final em um solvente apropriado. Em seguida, para cada concentração a ser testada, alíquota de três mililitros de ágar YEPD fundido em vários tubos de cultura estéreis.

Baseie os tubos que contêm o ágar em um banho-maria a 55 graus Celsius para evitar a solidificação do ágar. Agora, para cada concentração de produto químico a ser testada em 13, liberação branca do composto 100 x para uma alíquota de ágar tex fundido, o tubo por dois a três segundos para misturar e, em seguida, pipetar um mililitro de cada tubo em poços duplicados em uma placa de 12 mundos, deixe a placa endurecer durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, inocule 10 mililitros de meio líquido YEPD com dois microlitros da cultura de levedura saturada durante a noite.

Em seguida, pipete 25 microlitros dessa cultura no produto químico contendo ágar nos poços da placa de 12 baleias e espalhe uniformemente usando contas de vidro estéreis ou uma haste estéril. Deixe a placa secar sob uma chama e, em seguida, incube a placa a 30 graus Celsius por 48 horas. Após o tempo de incubação, avalie o número total e o tamanho das colônias nos poços.

Identifique uma concentração subletal de composto que não iniba o crescimento em mais de 10 a 15% para usar na tela. Manter a taxa mutante de deleção em uma densidade de 384 colônias por placa, replicando em 16 placas de ágar YEPD, contendo 200 microlitros por mililitro de G quatro 18. Usando um sistema robótico de matriz microbiana ou ferramentas manuais de fixação a cada três meses.

Armazene as placas a quatro graus Celsius até que seja necessário. Em seguida, prepare 250 mililitros de meio de ágar YEPD com a mesma concentração de G, quatro placas de ágar 18 ou cinco e deixe-os esfriar durante a noite em temperatura ambiente em uma superfície plana e plana. Remover as placas que contêm a colecção de mutantes de deleção do armazenamento a quatro graus Celsius e deixar que as placas atinjam a temperatura ambiente.

Use um lenço de tarefas delicadas para remover qualquer condensação que tenha se formado na tampa de cada placa para evitar que gotículas de água sejam depositadas na matriz e contaminação cruzada dos mutantes da matriz. Faça com que o robô de fixação de matriz microbiana condense a matriz mutante de deleção de uma densidade de 384 colônias por placa em 16 placas de Petri para 1.536 colônias por placa em quatro placas de Petri. Depois de incubar a matriz a 30 graus Celsius durante a noite, examine a matriz para garantir a transferência uniforme de colônias das placas de origem.

Haverá várias posições em branco incorporadas à matriz, que servem como um guia de que a matriz mutante de deleção foi condensada corretamente. Estas serão as placas de origem usadas para replicar na mídia contendo seu composto de interesse. Uma única placa de origem pode ser usada para vários pinnings.

Além disso, muitos robôs têm recursos de deslocamento que permitirão, o que garantirá um número semelhante de leveduras transferidas a cada vez. Para configurar o reparo da matriz mutante de exclusão de placa de réplica, 700 mililitros de veículo de controle apenas e ágar YEPD experimental contendo o produto químico de interesse. Isso é suficiente para realizar o ensaio em triplicata.

Despeje as placas usando o ágar controle e experimental. Adicionando 50 mililitros a cada prato. Deixe os pratos esfriarem em temperatura ambiente durante a noite em uma superfície plana e plana, usando o robô para replicar um prato.

Inocular a matriz de mutantes duplos em três conjuntos de placas contendo produtos químicos na concentração determinada experimentalmente, bem como reinicializações de placas contendo o controle do veículo. Incube as placas na bancada em temperatura ambiente por um total de 24 a 48 horas de imagem. As placas são de 24 e 48 horas de incubação, removendo a tampa e colocando a face para baixo em um scanner de mesa.

Capture imagens com uma resolução de pelo menos 300 DPI. Como alternativa, use uma câmera digital para capturar imagens. Se fizer isso, coloque os pratos voltados para cima em um fundo escuro e remova as tampas para a imagem.

Em seguida, execute a quantificação e comparação dos tamanhos das colônias de matrizes usando um dos vários programas de código aberto, incluindo ferramentas SGA de esferas e fresadora de telas. Nesta fase, vários mutantes de deleção de levedura serão pontuados como hipersensíveis ao produto químico de interesse riscar os mutantes hipersensíveis desejados da coleção de deleção de levedura para YEPD. Ager contendo 200 microgramas por microlitro de G quatro 18 incubam a 30 graus Celsius até que as colônias se formem.

Após verificar o genótipo da cepa por PCR diagnóstica e eletroforese de Agel, inocular cinco mililitros do líquido YPD com cada cepa e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com rotação ou agitação. Meça o OD 600 de cada cultura e dilua cada cepa para um OD 600 de um em água destilada estéril. Estas são agora as culturas de levedura normalizadas.

Em seguida, dispense 100 microlitros de tipo selvagem normalizado por 4 7 4 1 cultura de levedura para o poço A, uma de uma placa de 96 poços, dispense 100 microlitros de até sete cepas adicionais para os poços, B um para H um. Em seguida, dispense 90 microlitros de água estéril aos poços, de A dois a H dois a seis a H seis. Finalmente, prepare uma série de diluições de um a 10 de esculturas G normalizadas.

Comece pipetando em série 10 microlitros da coluna um para a coluna dois com uma pipeta multicanal e continue pela placa de 96 poços até que seis diluições sejam feitas. Em seguida, use a pipeta multicanal para dois a cinco microlitros das culturas de levedura diluídas em uma grade em YEP D's, meios sólidos contendo controle químico e veículo. Incubar as placas à temperatura adequada durante 24 a 48 horas após a incubação.

Inspecionar as placas e comparar a sensibilidade de mutantes selecionados ao produto químico em relação às placas de imagem de controle BY 47 41 em 24 e 48 horas. Como antes, as imagens a seguir mostram os resultados do procedimento para determinar a concentração inibitória da subin do produto químico. A primeira imagem mostra o crescimento de uma cultura saturada de BY 4 7 4 1 diluída de um a 5.000 e plaqueada em concentrações crescentes de cinco fluoro uracil.

A concentração de 10 micromolares é selecionada como uma dose inibitória sub-in. Esta imagem mostra a curva de crescimento de células BY 4 7 41 em meio líquido contendo cinco fluro uracil. Aproximadamente quatro vezes 10 para as quatro células foram depositadas em triplicata e concentrações crescentes de cinco fluoro uracil e densidades ópticas foram medidas a cada 10 minutos por 22 horas.

Novamente, pode-se ver que a dose de 10 micromolares é a dose inibitória da subína. As próximas imagens mostram os resultados de uma genética química verde de cinco fluoro uracila. Aqui, uma matriz mutante de deleção de S sachar visier replicada em ágar YPD contendo 10 micromolares cinco uracila de flúor à direita e controle DMSO à esquerda é mostrada.

Este gráfico mostra os resultados da genética química verde, o crescimento relativo de mutantes em 10 micromolar. Cinco uracilas de flúor em comparação com o controle DMSO são ordenadas por uma posição de raio aqui. O crescimento relativo de mutantes em 10 micromolares, cinco flora uracil em comparação com o controle DMSO é ordenado pela razão de tamanho da colônia.

Um limite de proporção inferior a 0,8 é indicado em ambos os gráficos. Esta imagem final mostra os resultados de três ensaios de validação. Diluições seriadas de várias cepas mutantes isoladas foram cultivadas no controle DMSO à esquerda, 10 micromolares, cinco fluoro UIL no centro e 0,015% de metil metano sulfonato à direita.

Ao tentar este procedimento, é importante garantir que você esteja trabalhando com uma cópia confiável da matriz mutante de deleção, bem como para validar quaisquer resultados usando uma metodologia independente, como ensaios de detecção de levedura ou dissecção de tétrade de levedura. Essa técnica fornece um meio eficiente para os cientistas no campo da pesquisa de pequenas moléculas explorarem o modo de ação de um composto usando abordagens de nível de sistema em leveduras em brotamento.