Name: Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprenda a identificar interações químico-genéticas em Saccharomyces cerevisiae usando ensaios de dose-resposta e mutantes hipersensíveis. Este método econômico revela processos biológicos alvo de compostos químicos.

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Pesquisa no laboratório CJN é apoiado por subsídios operacionais de NSERC, o Instituto Sociedade Canadense do Câncer Research (CCSRI), eo Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

NOTA: O fluxo de trabalho geral deste procedimento é descrito na Figura 2. 1. Determinação da dose de inibição de crescimento <ol><li> Preparação da cultura de levedura durante a noite NOTA: Os meios de crescimento de levedura-extract-peptone dextrose (YEPD) utilizados neste protocolo é uma receita padrão 13. <ol><li> Expelido BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) as células em uma placa de agar de YEPD e incubar durante 48 horas a 30 ° C ou até formar colónias visíveis. </li><li> Prepare a culturas de uma noite inoculando 5 ml de meio líquido YEPD num vaso de cultura estéril com uma única colónia. Incubar durante a noite a 30 ° C com rotação contínua ou agitação. A cultura será tipicamente atingir a saturação da manhã (2 x 10 ~ 8 células / ml). </li></ol></li><li> Preparação ágar sólido contendo doses químicas diferentes <ol><li> Prepare diversas unidades populacionais deo produto químico a ser testado em 100x a concentração final desejada em um solvente apropriado. NOTA: As concentrações eficazes irão depender da natureza da substância, e deve ser determinada empiricamente. Por isso, é aconselhável testar inicialmente uma ampla gama de concentração final, ou seja, a partir de baixo ï¿½ a alta mM. </li><li> Para cada concentração de produto químico a ser testado, alíquota de 3 ml de agar de YEPD fundido a um tubo de cultura em vários estéril. Lugar no 55 ° C banho de água para manter-se de solidificação. </li><li> Para cada concentração de produto químico a ser testado adicionar 30 ul do composto a 100x meios fundidos, vortex 2-3 segundos para misturar, e pipeta de 1 ml em cada par de cavidades em duplicado de uma placa de 12 poços. Certifique-se de incluir um veículo único controle. Permitir placas para definir durante a noite à temperatura ambiente. Descarte qualquer mídia extra. </li></ol></li><li> Células se espalham chapeamento <ol><li> Inocular 10 ml de meio líquido YEPD com 2 ul de uma cultura saturada de levedura, cultivada durante a noite, como no Passo 1.1.2. </li><li> Placa de 25 ul de cultura de levedura diluída por poço, espalhe uniformemente com esferas de vidro estéreis ou vara, e permitir que o prato para secar sob uma chama. Incubar a placa a 30 ° C durante 48 h. </li><li> Avaliar o crescimento de leveduras (tanto o número total e tamanho de colónias) nas placas. Escolher a uma concentração sub-letal de composto que não iniba o crescimento em mais de 10% -15% para realizar a tela. </li></ol></li></ol> 2. Systematic Tela Chemical Genetic <ol><li> Manutenção de supressão-mutante-array (DMA) e Preparação de Fonte Placa <ol><li> Para uma descrição detalhada sobre a construção de matrizes de mutantes de deleção de stocks de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Uma vez que os mutantes de deleção foram dispostas a uma densidade de 384 colónias por placa, o DMA podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C. Replicar em agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418, como necessário para prevenir crescimento de colónias em cadaoutro. NOTA: múltipla repetições em série deve ser evitada para evitar a perda de estirpes de crescimento lento e minimizar o aparecimento de mutantes supressores. Isto é particularmente relevante se a manutenção das coleções como haplóides. </li><li> Execute todas as etapas replica-chapeamento usando um microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colônias utilizando ferramentas manuais vestiu de aprisionamento. NOTA: A coleção de levedura eliminação está disponível como haplóides e diplóides de várias fontes comerciais e geralmente é enviado como stocks de glicerol em placas de 96 poços. </li></ol></li><li> Condensação da matriz mutante de deleção <ol><li> Preparar 250 ml de caldo YEPD meios de agar contendo 200 ug / ml de G418. A concentração eficaz de G418 pode variar e cada lote deve ser testada empiricamente. </li><li> Preparar cinco placas de agar de YEPD vertendo 50 ml de agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418 por placa. Faça isso um dia antes da condensação da matriz e permitir que as placas para esfriar à temperatura ambienteratura durante a noite em uma superfície lisa. NOTA: Quatro placas serão necessários para a recolha de densidade 1536-deformação, o quinto placa é derramado como um extra. </li><li> Remover os pratos de Petri contendo 16 a recolha mutante de deleção, a uma densidade de 384 colónias por placa e deixar vir à temperatura ambiente (~ 1 hora). </li><li> Limpe qualquer condensação que se formou sobre a tampa de cada placa usando uma tarefa delicada wipe. Não fazer isso pode resultar em gotas de água que está sendo depositado sobre a matriz e contaminação cruzada de mutantes dispostas. </li><li> Usando uma matriz fixando robô microbiana, condensar o DMA de uma densidade de 384 colônias por placa (16 placas de Petri) a 1.536 colônias por placa (4 placas de Petri). Realizar isso para que a 1ª colônia de placa 1 pins para a linha 1 coluna 1 da matriz condensado, o 1º colônia de placa 2 para a linha 1 coluna 2, o 1º colônia de placa 3 a linha 2 e coluna 1, e a colônia 1º de placa 4 a linha 2coluna 2. </li><li> Incubar a matriz consolidada a 30 ° C durante a noite. </li><li> Examine a matriz para assegurar a transferência uniforme de colônias a partir de placas de origem. Haverá várias posições em branco, propositadamente incorporados na matriz, que servem como guia para assegurar o DMA foi condensada correctamente (Figura 4A). NOTA: Estas serão as placas de base para a réplica de placas em meios contendo o composto de teste. A chapa única fonte pode ser usado para várias pinnings. Além disso, muitos robôs terão um recurso de compensação, o que irá garantir um número semelhante de levedura estão sendo transferidos de cada vez. </li></ol></li><li> Placa Replica variedade mutante de deleção <ol><li> Prepare 700 ml de controle (veículo só) e 700 ml de mídia experimental (contendo química). Isto é suficiente para realizar o ensaio em triplicado (12 placas por condição, além de dois extras). </li><li> Despeje 50 ml de agar YEPD contendo substância química de ensaio ou de controlo por placa. Permitir que as placas to esfriar à temperatura ambiente durante a noite em uma superfície lisa. </li><li> Usando o robô para placa réplica, o DMA para inocular três conjuntos de placas que contêm produtos químicos com a concentração determinada experimentalmente, bem como três conjuntos de placas contendo o controlo do veículo. Incubar as placas à temperatura ambiente, durante 24-48 h. </li></ol></li></ol> 3. As placas de imagem e análise de dados <ol><li> Retirar as placas da incubadora e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (~ 1 hora) antes da imagem. Isso vai evitar a formação de condensação enquanto a imagem das placas. </li><li> Placas de imagem em 24 e 48 horas por remover a tampa e colocar o rosto para baixo em um scanner de mesa. Capturar imagens com uma resolução de pelo menos 300 dpi. Como alternativa, use uma câmera digital para capturar imagens. Se fazê-lo, placas lugar enfrentam-se em um fundo escuro e remover as tampas para a imagem. NOTA: O formato de arquivo e de posicionamento das placas dependerá do programa de quantificação utilizados. </li&gt; <li> Execute quantificação e comparação dos tamanhos colônia matriz usando um dos vários programas de código aberto, incluindo Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validação de Tela NOTA: Nesta fase, várias exclusões de leveduras mutantes vai marcar como hipersensibilidade à substância química de interesse. Essas interações químicas-genético deve ser validado junto de duas maneiras. Primeiro a identidade de cepas sensíveis devem ser confirmados por PCR. Em segundo lugar, a sensibilidade química deve ser marcado de forma independente. Descritos abaixo é um breve protocolo para realização de ensaios mancha para validar hipersensibilidade tensão, uma técnica comum em biologia levedura. <ol><li> Streak fora desejado (hipersensibilidade) mutantes da coleção eliminação fermento em agar YEPD contendo 200 ug / ml de G418. Incubar a 30 ° C até formar colónias. Verifique se o genótipo da estirpe por PCR com primers de diagnóstico de acordo com ao protocolo do fabricante. </li><li> Inocular 5 ml de líquido YEPD para cada estirpe e incubar durante a noite a 30 ° C com rotação ou agitação. </li><li> Meça OD 600 e diluir cada cepa de DO600 = 1 em dH estéril 2 O. Estes são agora as culturas de levedura normalizados. </li><li> Dispensar 100 ul de normalizada levedura do tipo selvagem (BY4741) a cultura bem A1 de uma placa de 96 poços. Dispensar 100 l de até sete estirpes adicionais para poços B1-H1. </li><li> Use uma pipeta multicanal para dispensar 90 ul de dH 2 O estéril para poços A2-H2 através A6-H6. Finalmente, preparar uma série de diluições 1:10 de culturas de levedura normalizados. Comece serialmente pipetando 10 ul de coluna 1 para a coluna 2 com um pipetador multicanal, e continuar ao longo da placa de 96 poços até seis diluições são feitas (isto é, 10 0 a 10 -5). </li><li> Transferir 2-5 ul de culturas de levedura diluídos em uma grade usando um multicanalpipettor em meios sólidos YEPD contendo controle químico e do veículo. Incubar as placas à temperatura apropriada, durante 24-48 h. </li><li> Inspeccionar placas e comparar a sensibilidade de escolha para mutantes química (em relação ao controle BY4741). Placas de imagem às 24 e 48 horas como no passo 3.2. NOTA: Embora a identificação de várias cepas de hipersensibilidade com ontologias ou funções de genes relacionados empresta confiança para a validade da tela, a transformação de uma estirpe eliminação hipersensibilidade com um plasmídeo contendo uma cópia do tipo selvagem do gene é necessário para estabelecer formalmente que um gene eliminação de interesse (e não escondidos segundo mutações no local) faz com que a sensibilidade de drogas. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Esboçado aqui é uma abordagem para a geração de perfis de interação química-genética. O método é simples: comparando dimensões das colónias de cada estirpe em colecções de deleção de genes completos, na presença e ausência de uma substância química, todos os genes necessários para tolerar uma agressão química são identificados. Análise anotação enriquecimento da lista resultante de estirpes sensíveis pode então ser usada para fornecer uma visão sobre o modo de acção de produtos químicos. Enquanto este protocolo foi otim...

As ferramentas e os recursos disponíveis no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae genéticas permitiram grande escala genômica funcional estudos que fornecem coletivamente uma nova visão sobre como os genes funcionam como redes de cumprir os requisitos de sistemas biológicos. A pedra angular dessas ferramentas foi a criação colaborativa de um conjunto completo de deleções de genes não essenciais de todos os quadros de leitura aberta em levedura 1,2. Uma observação interessante foi que apenas ~ 20% dos genes de levedura são necessários para a viabilidade, quando cultivada como haplóides, sob condições laboratoriais padrão. Isto realça a capacidade de uma célula para o tampão contra perturbações genómicas, através da utilização de vias alternativas biológicas. Mutantes genéticos que sejam viáveis ​​individualmente, mas em combinação letal, sinalizar caminhos biológicos paralelas ligadas ou convergentes e formam redes de interação genéticas que descrevem a função biológica. Com o desenvolvimento do te condicionalalelos mperatura-sensíveis e hipomórfico de genes essenciais da tecnologia não tem sido limitada para o estudo dos genes não essenciais 3,4. Este conceito foi aplicado em escala genômica produzindo um mapa imparcial interação genética que ilustra como os genes envolvidos em processos celulares similares agrupam 5. Perturbações químicos de redes genéticas deleções de genes imitam (Figura 1) 6. Consultando os compostos inibidores do crescimento contra uma matriz de alta densidade de estirpes de deleção de hipersensibilidade identifica um perfil de interacção química-genético, isto é, uma lista de genes que são necessários para tolerar o stress químico. Como interacções genéticas, telas em larga escala de bibliotecas químicas têm mostrado que os compostos com um modo semelhante de acção de cluster em conjunto 7. Portanto, ao estabelecer o perfil de interação química, genética de um composto o modo de ação pode ser deduzida por comparação com larinteração genética genética e química sintética ge-escala conjuntos de dados de 8,9. Telas químico-genética em larga escala, onde dezenas de compostos são interrogados, foram realizados ensaios de competição por código de barras. Nesta abordagem, o conjunto reunido de estirpes de deleção é cultivado em massa por várias gerações em um pequeno volume de um meio contendo uma substância química. Uma vez que cada mutante de deleção abriga um código de barras genético único, a viabilidade / crescimento de mutantes individuais dentro da piscina de estirpes de deleção é rastreado por microarray ou de alto rendimento seqüenciamento 10. Deduzir aptidão monitorando tamanho da colônia de mutantes fisicamente vestiu cultivadas em agar sólido contendo um composto bioativo também é um método eficaz para identificar as interações químicas genético 11,12. Esta abordagem fornece uma alternativa de baixo custo para triagem baseado na competição e é bem adequado para ensaiar pequenas bibliotecas de produtos químicos.Esboçado aqui é uma metodologia simples para a produção de uma lista de interações químicas-genética em S. cerevisiae que não confia em molecular manipulações de biologia ou de infra-estrutura. Ela exige apenas uma coleção de levedura eliminação, um aparelho de pinagem robótico ou manual e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente.

<table><tbody><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Para meios líquidos / sólidos YEPD, adicione a 1% de concentração final (p / v)</td></tr> <tr><td>Pó de Tirptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Para meios líquidos / sólidos YEPD, adicione a 2% de concentração final (p / v)</td></tr> <tr><td>Anachemia</td> <td>dextrose</td><td>31096-380</td><td>Para meios líquidos/sólidos YEPD, adicione até 2% de concentração final (p/v) &#8212; Não autoclave. Prepare a solução estoque a 20%, esterilize com filtro e adicione à mídia após a autoclavagem.</td></tr><tr><td>Ágar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Para meios sólidos YEPD adicionar a 2% de concentração final (p / v)</td></tr> <tr><td>G418</td><td>AG Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepare 1.000x estoque a 200&nbsp; mg/ml em dH2O e esterilizar com filtro.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de 5 ml</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>robô de fixação de matriz microbiana de alto rendimento</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Instrumentos de Cantor de Placa de Petri</td><td>&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Caixa de 200 pratos</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Caixa de 1.000 almofadas</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Caixa de 1.000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">Ferramentas alternativas de fixação:</td></tr><tr><td>Sistemas Robtic totalmente</td><td>automatizados S& P robótica</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Vários sistemas automatizados de manuseio de colônias robíticos e de imaginação disponíveis.</td></tr><tr><td>Ferramentas de fixação manual</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Ferramentas e acessórios de replicação portáteis.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identificação rápida de químicos genéticos interações em<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determinando o modo de acção de produtos químicos bioactivos é de interesse para uma larga gama de académico, farmacêuticos, industriais e cientistas. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de brotamento, é um modelo eucariota para que um conjunto completo de ~ 6000 mutantes de deleção do gene e gene essencial hipomórfico mutantes estão disponíveis comercialmente. Estas colecções de mutantes pode ser usado para detectar interacções químicas sistematicamente-gene, isto é, genes necessários para tolerar um produto químico. Esta informação, por sua vez, comunica com o modo provável de acção do composto. Aqui nós descrevemos um protocolo para a rápida identificação de interações químicas-genética em brotamento da levedura. Demonstramos o método usando o agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tem um mecanismo bem definido de acção. Os nossos resultados mostram que o TRAMP nuclear RNA e de exossoma enzimas de reparação de ADN são necessários para a proliferação na presença de 5-FU, o que é consistente com m anterioricroarray abordagens genéticas baseadas em códigos de barras de produtos químicos e o conhecimento de que 5-FU afeta adversamente o metabolismo de RNA e DNA. Os protocolos de validação necessárias dessas telas de alto rendimento são também descritos.

Como uma validação desta abordagem foi realizado um rastreio genético química representativa interacção do agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), seguindo o protocolo descrito acima. 5-FU é conhecido por perturbar a timidilato-sintase, assim como o metabolismo do ADN e ARN 18. As interações químicas genéticos de 5-FU são bem estudados e foram investigados por meio de técnicas de levedura de código de barras de microarranjos utilizando ambas as coleções de deleção heterozigotos e homozigotos 8,1...

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

O objetivo geral deste procedimento é usar células de levedura para encontrar os processos biológicos visados por um produto químico de interesse. Isso é feito determinando primeiro o perfil de resposta à dose de um produto químico para levedura. O segundo passo é cultivar uma coleção completa de cepas nocaute de genes de levedura em uma dose subletal de produto químico e em uma placa de controle.Em seguida, mutantes de levedura que são hipersensíveis ao produto químico são identificados. Esta lista é analisada bioinformaticamente para revelar todos os genes necessários para tolerar o produto químico. A etapa final é realizar uma réplica biológica do experimento em baixo rendimento.Isso valida quaisquer interações químicas de genes encontradas. Em última análise, esse método de triagem genética química de alto rendimento é usado para mostrar quais produtos gênicos e vias biológicas são usados para tolerar o produto químico de interesse. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o crescimento competitivo de mutantes com código de barras em cultura líquida, é que nenhuma técnica de biologia molecular é necessária.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química, como como uma nova molécula pequena pode inibir o crescimento de células eucarióticas. Para começar, prepare uma cultura de levedura durante a noite listrando BY 4 7 4 1 células em uma placa A-Y-E-P-D e incube por 48 horas a 30 graus Celsius ou até que se formem colônias visíveis. Quando as colônias estiverem prontas.Prepare culturas líquidas durante a noite escolhendo uma única colônia e inoculando cinco mililitros de meio líquido YEPD em um recipiente estéril. Em seguida, incube durante a noite a 30 graus Celsius com rotação contínua ou agitação. Em seguida, prepare um meio de ágar sólido contendo várias doses do produto químico a ser testado.Para fazer isso. Primeiro, prepare várias soluções de estoque do produto químico de interesse a 100 vezes a concentração final em um solvente apropriado. Em seguida, para cada concentração a ser testada, alíquota de três mililitros de ágar YEPD fundido em vários tubos de cultura estéreis.Baseie os tubos que contêm o ágar em um banho-maria a 55 graus Celsius para evitar a solidificação do ágar. Agora, para cada concentração de produto químico a ser testada em 13, liberação branca do composto 100 x para uma alíquota de ágar tex fundido, o tubo por dois a três segundos para misturar e, em seguida, pipetar um mililitro de cada tubo em poços duplicados em uma placa de 12 mundos, deixe a placa endurecer durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, inocule 10 mililitros de meio líquido YEPD com dois microlitros da cultura de levedura saturada durante a noite.Em seguida, pipete 25 microlitros dessa cultura no produto químico contendo ágar nos poços da placa de 12 baleias e espalhe uniformemente usando contas de vidro estéreis ou uma haste estéril. Deixe a placa secar sob uma chama e, em seguida, incube a placa a 30 graus Celsius por 48 horas. Após o tempo de incubação, avalie o número total e o tamanho das colônias nos poços.Identifique uma concentração subletal de composto que não iniba o crescimento em mais de 10 a 15% para usar na tela. Manter a taxa mutante de deleção em uma densidade de 384 colônias por placa, replicando em 16 placas de ágar YEPD, contendo 200 microlitros por mililitro de G quatro 18. Usando um sistema robótico de matriz microbiana ou ferramentas manuais de fixação a cada três meses.Armazene as placas a quatro graus Celsius até que seja necessário. Em seguida, prepare 250 mililitros de meio de ágar YEPD com a mesma concentração de G, quatro placas de ágar 18 ou cinco e deixe-os esfriar durante a noite em temperatura ambiente em uma superfície plana e plana. Remover as placas que contêm a colecção de mutantes de deleção do armazenamento a quatro graus Celsius e deixar que as placas atinjam a temperatura ambiente.Use um lenço de tarefas delicadas para remover qualquer condensação que tenha se formado na tampa de cada placa para evitar que gotículas de água sejam depositadas na matriz e contaminação cruzada dos mutantes da matriz. Faça com que o robô de fixação de matriz microbiana condense a matriz mutante de deleção de uma densidade de 384 colônias por placa em 16 placas de Petri para 1.536 colônias por placa em quatro placas de Petri. Depois de incubar a matriz a 30 graus Celsius durante a noite, examine a matriz para garantir a transferência uniforme de colônias das placas de origem.Haverá várias posições em branco incorporadas à matriz, que servem como um guia de que a matriz mutante de deleção foi condensada corretamente. Estas serão as placas de origem usadas para replicar na mídia contendo seu composto de interesse. Uma única placa de origem pode ser usada para vários pinnings.Além disso, muitos robôs têm recursos de deslocamento que permitirão, o que garantirá um número semelhante de leveduras transferidas a cada vez. Para configurar o reparo da matriz mutante de exclusão de placa de réplica, 700 mililitros de veículo de controle apenas e ágar YEPD experimental contendo o produto químico de interesse. Isso é suficiente para realizar o ensaio em triplicata.Despeje as placas usando o ágar controle e experimental. Adicionando 50 mililitros a cada prato. Deixe os pratos esfriarem em temperatura ambiente durante a noite em uma superfície plana e plana, usando o robô para replicar um prato.Inocular a matriz de mutantes duplos em três conjuntos de placas contendo produtos químicos na concentração determinada experimentalmente, bem como reinicializações de placas contendo o controle do veículo. Incube as placas na bancada em temperatura ambiente por um total de 24 a 48 horas de imagem. As placas são de 24 e 48 horas de incubação, removendo a tampa e colocando a face para baixo em um scanner de mesa.Capture imagens com uma resolução de pelo menos 300 DPI. Como alternativa, use uma câmera digital para capturar imagens. Se fizer isso, coloque os pratos voltados para cima em um fundo escuro e remova as tampas para a imagem.Em seguida, execute a quantificação e comparação dos tamanhos das colônias de matrizes usando um dos vários programas de código aberto, incluindo ferramentas SGA de esferas e fresadora de telas. Nesta fase, vários mutantes de deleção de levedura serão pontuados como hipersensíveis ao produto químico de interesse riscar os mutantes hipersensíveis desejados da coleção de deleção de levedura para YEPD. Ager contendo 200 microgramas por microlitro de G quatro 18 incubam a 30 graus Celsius até que as colônias se formem.Após verificar o genótipo da cepa por PCR diagnóstica e eletroforese de Agel, inocular cinco mililitros do líquido YPD com cada cepa e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com rotação ou agitação. Meça o OD 600 de cada cultura e dilua cada cepa para um OD 600 de um em água destilada estéril. Estas são agora as culturas de levedura normalizadas.Em seguida, dispense 100 microlitros de tipo selvagem normalizado por 4 7 4 1 cultura de levedura para o poço A, uma de uma placa de 96 poços, dispense 100 microlitros de até sete cepas adicionais para os poços, B um para H um. Em seguida, dispense 90 microlitros de água estéril aos poços, de A dois a H dois a seis a H seis. Finalmente, prepare uma série de diluições de um a 10 de esculturas G normalizadas.Comece pipetando em série 10 microlitros da coluna um para a coluna dois com uma pipeta multicanal e continue pela placa de 96 poços até que seis diluições sejam feitas. Em seguida, use a pipeta multicanal para dois a cinco microlitros das culturas de levedura diluídas em uma grade em YEP D's, meios sólidos contendo controle químico e veículo. Incubar as placas à temperatura adequada durante 24 a 48 horas após a incubação.Inspecionar as placas e comparar a sensibilidade de mutantes selecionados ao produto químico em relação às placas de imagem de controle BY 47 41 em 24 e 48 horas. Como antes, as imagens a seguir mostram os resultados do procedimento para determinar a concentração inibitória da subin do produto químico. A primeira imagem mostra o crescimento de uma cultura saturada de BY 4 7 4 1 diluída de um a 5.000 e plaqueada em concentrações crescentes de cinco fluoro uracil.A concentração de 10 micromolares é selecionada como uma dose inibitória sub-in. Esta imagem mostra a curva de crescimento de células BY 4 7 41 em meio líquido contendo cinco fluro uracil. Aproximadamente quatro vezes 10 para as quatro células foram depositadas em triplicata e concentrações crescentes de cinco fluoro uracil e densidades ópticas foram medidas a cada 10 minutos por 22 horas.Novamente, pode-se ver que a dose de 10 micromolares é a dose inibitória da subína. As próximas imagens mostram os resultados de uma genética química verde de cinco fluoro uracila. Aqui, uma matriz mutante de deleção de S sachar visier replicada em ágar YPD contendo 10 micromolares cinco uracila de flúor à direita e controle DMSO à esquerda é mostrada.Este gráfico mostra os resultados da genética química verde, o crescimento relativo de mutantes em 10 micromolar. Cinco uracilas de flúor em comparação com o controle DMSO são ordenadas por uma posição de raio aqui. O crescimento relativo de mutantes em 10 micromolares, cinco flora uracil em comparação com o controle DMSO é ordenado pela razão de tamanho da colônia.Um limite de proporção inferior a 0,8 é indicado em ambos os gráficos. Esta imagem final mostra os resultados de três ensaios de validação. Diluições seriadas de várias cepas mutantes isoladas foram cultivadas no controle DMSO à esquerda, 10 micromolares, cinco fluoro UIL no centro e 0,015% de metil metano sulfonato à direita.Ao tentar este procedimento, é importante garantir que você esteja trabalhando com uma cópia confiável da matriz mutante de deleção, bem como para validar quaisquer resultados usando uma metodologia independente, como ensaios de detecção de levedura ou dissecção de tétrade de levedura. Essa técnica fornece um meio eficiente para os cientistas no campo da pesquisa de pequenas moléculas explorarem o modo de ação de um composto usando abordagens de nível de sistema em leveduras em brotamento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Patógenos bacterianos secretam proteínas no hospedeiro que têm como alvo processos biológicos cruciais. Identificar as vias hospedeiras alvo de proteínas efeteroras bacterianas é fundamental para abordar a patogênese molecular. Aqui, um método usando um supressor de levedura modificado e tela de toxicidade para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras tóxicas é descrito.

Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

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Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

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Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.

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