Name: Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a isolar monócitos de medula óssea murina para pesquisa cardiovascular usando camundongos. Este método reduz custos e o número de animais sacrificados, gerando grandes quantidades de células para estudos de crescimento vascular.

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Este trabalho foi apoiado pela DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação Alemã de Pesquisa) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). 
Obrigado a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Alemanha, pelo suporte técnico.

Este estudo foi realizado com autorização do Estado da Saxônia e Saxônia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acordo com a Seção 8 da lei alemã de protecção dos animais (24D-9168,11-1 / 2008-24). 1 Isolamento celular 1.1 Preparação do fémur e da tíbia <ol><li> Anestesiar o mouse usando uma concentração de isoflurano 5% vaporizando isoflurano em uma lixeira fechada. Após o mouse parou de se mover por 3 s, realizar o deslocamento cervical. </li><li> Desinfectar os membros posteriores com etanol (96%). Retire a pele e os músculos e os ossos separar com um bisturi estéril. <ol><li> Comece com uma incisão na pele inguinal, e estender a incisão em direção ao maléolo medial e realizar uma dissecação circular da pele ao redor do bezerro inferior. Remover a pele das pernas completamente por descascar proximalmente. </li><li> Retire o músculo quadríceps do fêmur com um bisturi afiado, remova ambos os peroneus anteriore os grupos e músculo gastrocnêmio desarticular a perna na articulação do quadril, localizando e dissecando os ligamentos. </li><li> Comece anterior e proceder ao redor da articulação, girando cuidadosamente a perna e cortando transversalmente os ligamentos, desarticulando, assim, a articulação. </li></ol></li><li> Lavar fémur e da tíbia com etanol a 96% durante um período mínimo de 90 segundos para garantir a preparação de células asséptica. Continuar o processo de lavagem com PBS estéril para enxaguar restante etanol. Nota: Todos os passos subsequentes devem ser estéreis para evitar contaminação. </li></ol> 1.2 Colheita de Medula Óssea <ol><li> Cortar a extremidade proximal e distal de cada osso com um par de tesouras finas para obter acesso aos veios femorais e tibiais. Tenha cuidado com este passo, uma vez que estes ossos se quebram com muita facilidade. </li><li> Lave os ossos com meio quente (M199 + 10% de soro fetal de vitelo (FCS), + 1% de Penicilina / Estreptomicina). Use uma agulha estéril de 28-G, uma seringa de 1 ml, e entre 10-15 ml por meio deosso para enxaguar. </li><li> Segure o osso com uma pinça fina e lavar um por um até que fique semi-translúcido. Cuidadosamente aplicar pressão para a extremidade do êmbolo da seringa, a fim de minimizar o stress celular. </li><li> Filtrar a medula óssea através de um 70 um nylon web e recolher o filtrado. Para extrair a quantidade máxima de medula óssea, lavar repetidamente a partir das extremidades distais e proximais. </li><li> Enxaguar a peneira com PBS e recolher o filtrado. Desalojar cuidadosamente detritos e conglomerados celulares por agitação suave e pipetagem. </li></ol> 1.3 Cultivo <ol><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células com aproximadamente 25 ml de meio. Repetir uma vez. </li><li> Ressuspender as células em 6 ml de meio depois do segundo passo de lavagem. Misturar 50 ul da solução de células com 50 uL de azul de tripano. Contar as células numa câmara de contagem sob um microscópio de luz. Calcula-se o número de cvaras na solução usando esta fórmula: <img alt="Equação 1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> Semear as células em placas de superfície de ultra-low-fixação de 6 poços para evitar a aderência permanente para o fundo da placa. Usar uma concentração de 10 6 células por ml, com até 6 ml por poço. </li><li> Complementar a suspensão com 20 ng / ml de M-CSF para promover a diferenciação de células. </li><li> Cultura das células durante 5 dias a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono e observar diariamente. </li></ol> 1.4 colheita de células Nota: Estes passos devem ser realizados em gelo. Prossiga com ou 1.4.1 ou 1.4.2 em conformidade. <ol><li> Neste ponto, efectuar a totalidade da cultura, incluindo os macrófagos diferenciados que aderem às placas de cultura, mesmo que sejam placas de superfície de ultra-baixo de fixação. <ol><li> Efectuar a totalidade da cultura por pipetagem suave e desprender com uma solução de 4 ° C PBS, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA. Repita até que as placas são claras dos restantes células aderentes - confirmar sob um microscópio se não tiver certeza. </li></ol></li><li> Alternativamente, descartar macrófagos aderentes por meio da colheita com o sobrenadante as células em suspensão, que contêm predominantemente monócitos. <ol><li> Colheita das células não aderentes com uma solução de PBS livre de EDTA e 0,5% de BSA. Não aplique muita força, a fim de evitar a retirada macrófagos levemente aderentes. </li></ol></li></ol> 1,5 FACS-análise (Opcional) Nota: É possível a esgotar a suspensão de células de CD117 + e células progenitoras de haste pelo uso de MACS. Use protocolos fabricante para este procedimento. <ol><li> Colher as células de acordo com os passos ou 1.4.1 ou 1.4.2. </li><li> Centrifuga-se as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e repetir este passo novamente. </li><li> Ressuspender pelo menos 250.000 células em 300 ul de FACS buffer por sonda. </li><li> Transferir a solução para uma célula de 96 poços de placa (30 uL por poço). </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 25 uL de anticorpo a cada poço (diluição utilizar fabricante). </li><li> Corar as células com anticorpos (seguintes protocolos do fabricante para fenotipagem de células após os passos 1.5.1-1.5.6. Marcadores vulgarmente utilizados para a identificação de monócitos / macrófagos incluem CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), e GR- 1. Nota: Para uma descrição mais detalhada de soluções de celulares, é recomendado o uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G e CD192. Características celulares foram previamente descritos 12. </li><li> Incubar as sondas de 20 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar as sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender com 200 ul de tampão de FACS. Repita thé entrar duas vezes. </li><li> Transfira as sondas em tubos de FACS e realizar a análise FACS 12. </li><li> Realizar a análise de FACS 12 no dia 0, 3 e 5 para analisar a diferenciação celular. </li></ol> 2. Cauda Vein Injection 2.1 Preparação <ol><li> Aquecer os animais sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante cerca de 10 min. Observar os animais durante o aquecimento para reconhecer sinais de superaquecimento. </li><li> Ressuspender as monócitos isolados em etapas 1.1- 1.4, em 150 ul de NaCl, e carregar as células para uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 30G. Vortex levemente a solução antes de carregar a seringa para garantir que todos os monócitos são injectados. Sempre lidar com as células em gelo para evitar penhora mediada pelo calor e ativação de monócitos. </li></ol> 2.2 Prender <ol><li> Evitar perturbar outros ratos na gaiola na escolha de um rato por injecção intravenosa. </li><li> Posicione o mouse para o limitador. Evite muito prEssure e ter cuidado com os membros posteriores. (Figura 4) Nota: Como alternativa, usar anestesia geral para garantir estresse livre movimentação dos animais. </li><li> Certifique-se de que o rato tem espaço para respirar antes de fechar o limitador. </li></ol> 2.3 Injeção <ol><li> Desinfetar o local da injecção com agente de desinfecção. Pulverizar na cauda do rato e deixar em repouso durante pelo menos 1 min. </li><li> Interrompa o fluxo de sangue venoso da cauda, ​​aplicando uma leve pressão para o lado lateral da cauda acima do local da injeção, para uma melhor visibilidade das veias. </li><li> Vire a cauda 90 graus, antes da injeção. (Figura 5) </li><li> Injetar em um ângulo de 45 graus. Injetar lentamente e não mais de 5 mL por grama para evitar animais prejudicando. </li><li> Se houver uma bolha, que é um sinal de uma injecção falhou, interromper imediatamente e repetir a injecção mais proximalmente. </li><li> Parar o sangramento no lado da injeção através da aplicação suave pressure por cerca de 1 min. </li><li> No final do procedimento, o afastador de abrir e colocar o rato na sua gaiola. </li><li> Observar o rato durante 20 minutos para assegurar que o animal não foi prejudicada por injecção e decúbito esternal é mantida. Aumentar o tempo de observação até que o mouse recupera a consciência suficiente. Retorne o mouse para a companhia de outros animais somente depois que ele se recuperou totalmente. </li></ol>

<ol><li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+monocytes%3A+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).</li>
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<li>Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+clinical+arteriogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A critical review of clinical arteriogenesis research.</a> J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+peripheral+arterial+disease+using+stem+and+progenitor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy.</a> J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um método simples e de baixo custo para isolar grandes quantidades de monócitos murino de medula óssea. Em comparação com outros protocolos utilizando sangue periférico, que obtêm rendimentos de monócitos 5 de 1,4 x10 6, somos capazes de obter rendimentos mais elevados, de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monócitos a partir de um único rato doador. Ao considerar os desafios com este método, é importante mencionar o potencial de contaminação qua...

O isolamento de monócitos é importante e crítico para muitos estudos in vitro e in vivo. Essas células são alvos de doenças como doença arterial periférica, doença cardíaca coronária ou outras doenças isquêmicas, uma vez que o crescimento dos vasos colaterais é fortemente impulsionado pela inflamação local. As respostas inflamatórias incluem ativação endotelial e recrutamento local de leucócitos, principalmente monócitos, que então amadurecem em macrófagos e criam um ambiente altamente arteriogênico secretando múltiplos fatores de crescimento para induzir a remodelação de uma arteríola em uma artéria colateral funcional1-3. Os monócitos também amadurecem em células dendríticas, que são freqüentemente usadas para estudos imunológicos4,5 e pesquisas sobre câncer6,7.
Problemático na abordagem para isolamento de monócitos do sangue periférico8 é o alto número de animais doadores necessários para produzir uma quantidade suficiente de monócitos para a maioria das análises. Os protocolos anteriores descrevem métodos como centrifugação com gradiente de densidade e depleção celular via MACS9 ao isolar monócitos; no entanto, essas técnicas podem alterar as características e a funcionalidade dos monócitos, o que pode levar a dificuldades de interpretação10,11. Além disso, esses métodos são difíceis e podem reduzir a reprodutibilidade experimental.
Nosso objetivo com este protocolo é fornecer um método simples e econômico para gerar grandes quantidades de monócitos derivados da medula óssea. Devido ao alto rendimento celular de 11 x 106 ± 3 x 106 células obtidas por este protocolo, podemos reduzir substancialmente o número de camundongos necessários durante o isolamento de monócitos derivados da medula óssea. O procedimento pode ser concluído em um período mínimo de tempo e sem usar técnicas caras e complicadas, conforme mencionado acima. Aqui, extraímos monócitos da suspensão nativa da medula óssea de camundongos doadores, cultivamos a suspensão em placas de fixação ultrabaixa e complementamos a solução com 20 ng/ml de M-CFS. No dia 5 de incubação, as células são colhidas e caracterizadas para confirmar as propriedades funcionais e fenotípicas.
Para experimentos no campo da arteriogênese, o transplante intravenoso desses monócitos derivados da medula óssea em camundongos é um método eficaz de administração sistêmica de medicamentos, que pode ser combinado com ligadura da artéria femoral em modelos comuns de doença arterial periférica.

<table><tbody><tr><td>Placa de 6 poços de ultra-baixa fixação</td><td>Corning Incorporated, NY, EUA</td><td></td><td>Placa de 6 poços de ultra-baixa-fixação, com tampa, estéril</td></tr><tr><td>8- 12 semanas de idade, macho, camundongos balb/c&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mancha de células mortas azuis</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>GE Healthcare, Freiburg, Alemanha</td><td></td><td>Fração V, pH 7,0</td></tr><tr><td>Cânulas</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, EUA</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, EUA</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>Com tampa, centrífuga estéril</td></tr><tr><td>Beckman</td><td>Coulter GmbH, Krefeld, Alemanha</td><td></td><td>Allegra&reg; Centrífuga X-15R</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet, Mannheim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de desinfecção</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemanha</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>Bisturi descartável No.10&nbsp;</td><td>Navalha de segurança de penas Co.Ltd, Osaka, Japão&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%&nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade de extração Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml; sseldorf, Alemanha</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>Buffer FACS&nbsp;</td><td>Fabricado pelo nosso grupo com componentes</td><td></td> únicos <td>PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3</td></tr><tr><td>FACS dispositivo</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, EUA</td><td></td><td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>Tubos FACS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Falcon&reg; Becton</td><td>Dickenson Labware, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerros</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Rubis, Stabio, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, EUA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td>Placa Quente 062</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemanha</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg; C</td></tr><tr><td>Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp; região=DE">SRP3110&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Agitador mecânico</td><td>IKA, Staufen, Alemanha</td><td></td><td>ms2 minishaker</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria</td><td></td><td>Warm in 37 &deg; C banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Micro tubos de ensaio</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bancada de trabalho microbiológica</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemanha</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de monócitos&nbsp;</td><td>Fabricado pelo nosso grupo com componentes</td><td></td> únicos <td>PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (ácido de sódio)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de nylon</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nova Jersey, EUA</td><td></td><td>Filtro de células, 70 &micro; m tamanho da malha</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado salina</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>pH 7.4, pipetas estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td>10&micro; l/100&micro; l/200&micro; l/1.000&micro; l</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Greiner</td><td></td>Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha <td></td> Cellstar 5 ml, 10 ml</tr><tr><td>Unidade de sucção</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Alemanha</td><td></td><td>Conforto Vacusafe</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Seringa <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td>Seringa de insulina Omnifix&reg; -F de 1 ml</td></tr><tr><td>Tubos com tampa</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>Tubos Cellstar de 15 ml/50 ml Banho-maria</td></tr><tr><td>morno</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemanha</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

isolamento e injecção intravenosa de murino de medula Óssea derivado monócitos

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Como um subtipo de leucócitos e progenitores de macrófagos, os monócitos estão envolvidos em muitos processos importantes dos organismos e são frequentemente objeto de vários campos da ciência biomédica. O método descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar monócitos murinos da medula óssea heterogênea.
A medula óssea do fêmur e da tíbia de camundongos Balb/c é colhida por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A suspensão celular é suplementada com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e cultivada em superfícies de fixação ultrabaixa para evitar a diferenciação de monócitos desencadeada pela adesão. As propriedades e diferenciação dos monócitos são caracterizadas em vários intervalos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), com marcadores como CD11b, CD115 e F4/80, é usada para fenotipagem. No final do cultivo, a suspensão é composta por 45%± 12% de monócitos. Ao remover macrófagos adesivos, a pureza pode ser aumentada em até 86%± 6%. Após o isolamento, os monócitos podem ser utilizados de várias maneiras, e um dos métodos mais eficazes e comuns para entrega in vivo é a injeção intravenosa da veia da cauda. 
Esta técnica de isolamento e aplicação é importante para estudos de modelos de camundongos, especialmente nas áreas de inflamação ou imunologia. Os monócitos também podem ser usados terapeuticamente em modelos de doenças de camundongos.

A solução de células extraídas da medula óssea de murídeo consiste em vários tipos de células. Os principais tipos de células são linfócitos, granulócitos e monócitos. Os tipos de célula pode ser estimado pelo tamanho e granularidade, que é mostrado na Figura 1, tanto para as suspensões nativas e as células colhidas depois de 5 dias de diferenciação. Observe a composição celular mudando durante o cultivo. No entanto, a classificação exata das populações deve contar com expressão distintiva de marcadores...

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Olá, meu nome é Helen Kuster e trabalho no grupo de pesquisa cardiovascular do Dr. Harold e sou professora na Universidade Auto Vica em MacBook. Estamos interessados no isolamento e caracterização de monócitos marinhos com o objetivo de utilizá-los como veículos no crescimento de vasos colaterais. Os seguintes passos principais são necessários para o cultivo de monócitos derivados da medula óssea: primeiro, anestesia do camundongo e dislocação cervical; segundo, extração e lavagem do fêmur.Terceira filtração da medula óssea. Quarta à quinta etapa de lavagem com meio, sexta etapa de cultivo das células em placas com aderência ultrabaixa. Sétima citometria de fluxo.Para extrair monócitos da medula óssea, o camundongo será anestesiado utilizando ISO fluoreno e eutanasiado por dislocação cervical. O camundongo será fixado e ambas as patas traseiras serão separadas com um bisturi estéril. Ambos o fêmur e a tíbia serão coletados e lavados com etanol 96% por um mínimo de 90 segundos.Após isso, todos os passos devem ser estritamente estéreis para evitar contaminação. Os músculos ou tendões serão removidos do osso. O fêmur e a tíbia são enxaguados com PBS morno várias vezes.Para a coleta da medula óssea, as extremidades proximal e distal de cada osso são cortadas com uma tesoura fina. Para lavar o osso, é necessário uma agulha esteróide de 28 G, uma seringa de um mililitro e entre 10 a 15 mililitros de meio por osso. Posteriormente, a medula óssea é filtrada através de uma peneira de 70 micrômetros, segurando o osso com uma pinça fina.Lave os ossos um a um até que fiquem iluminados. Para minimizar o estresse celular, aplique cuidadosamente pressão sobre o êmbolo da seringa. Lave o conjunto com PBS.Em seguida, as células são centrifugadas a 250 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. E são ressuspendidas novamente com meio? Após este passo, repita a etapa mais uma vez.Para monócitos derivados da medula óssea a partir da medula óssea nativa, utilizamos M 199 com 1% de penicilina e estreptomicina e 10% de soro fetal bovino. Adicionalmente, adicionamos 20 nanogramas por mililitro de INE MCSF no primeiro dia. Oito nanogramas por mililitro de interferon gama são adicionados no último dia de cultivo ao meio.Se desejar a upregulação do MHC classe II, as células são semeadas em placas de adesão ultra-baixa com poços profundos para evitar a adesão permanente ao fundo. Utilizamos uma concentração de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro, com até seis mililitros por poço. O período de cultivo é de cinco dias a uma temperatura de 37 graus e 5% de dióxido de carbono.As células são verificadas diariamente após cinco dias, entre 60 e 80% das células são monócitos. Meu nome é Martin Bachner e sou estudante de medicina aqui na Auto Fungi University, no Departamento de Cardiologia, anologia e cronologia. E quando você realiza a injeção intravenosa, é importante praticar muito antes de fazê-la, pois, caso contrário, não será capaz de aplicar os monócitos de maneira adequada.Experimentos demonstraram que os monócitos são mais eficazes na melhoria da agenesia articular quando aplicados sistemicamente. Uma forma comum de aplicação sistêmica de fármacos é a injeção na cauda. No nosso caso, injetamos 2,5 milhões de monócitos, que são ressuspendidos em cloreto de sódio.Há quatro vasos na cauda das artérias do camundongo na face ventral e dorsal, e duas veias na face lateral. Portanto, para a injeção na veia caudal, é necessário girar a cauda em aproximadamente 90 graus. Para facilitar o procedimento, o camundongo deve ser aquecido usando uma bolsa de aquecimento por cerca de 10 minutos.Os animais devem ser observados durante o aquecimento. Isso é importante para reconhecer sinais de superaquecimento. Além disso, precisamos desse agente infeccioso e de um conjunto de agulhas de 30 genes em uma seringa de insulina de um mililitro.Fixe cuidadosamente o animal em um dispositivo de contenção, o que facilita muito a injeção na cauda. Certifique-se de que o camundongo tenha espaço suficiente para respirar antes de carregar a solução na seringa. Vortexe a solução de monócitos para garantir que todos os monócitos possam ser injetados.Desinfete o local da injeção para evitar infecção, segure a cauda entre o polegar e o indicador. No ponto mais distal, a agulha é inserida em um ângulo rasante. Se for colocada na veia, é muito fácil injetar a solução de monócitos.Se houver uma bolha, isso é um sinal de injeção incorreta. Você deve parar imediatamente e tentar novamente. Proximalmente, sempre tente injetar lentamente e não mais do que cinco microlitros por grama.Se a injeção foi bem-sucedida, interrompa o sangramento no local da injeção aplicando pressão suave por cerca de um minuto. Ao final do procedimento, abra o retrator e coloque o camundongo em sua gaiola para caracterizar monócitos. Utilizamos os efeitos com uma combinação de antígenos, a saber, CD 11 B, F quatro 80, CD 115 e GL um.A expressão desses antígenos correlaciona-se com um estágio de desenvolvimento para análise dos monócitos. Coletamos os dados no dia 0, 3, 5 e 7; a pureza dos monócitos aumenta até 90% no dia 5. Para atingir essa pureza, é importante esgotar fortemente os macrófagos tecidualmente residentes.Células terrine são esgotadas utilizando um tampão de lavagem livre de EDTA. Para esgotar células terrine, estamos utilizando um tampão de lavagem contendo EDTA e pipetagem suave. Este diagrama mostra os principais tipos celulares para sua cultura de extremidade única.Os diferentes tipos celulares mostrados são: um linfócitos, dois monócitos, três granulócitos, com aumento da pureza de monócitos após o quinto dia. E cultura. Observe a alteração na composição celular durante o cultivo: a população celular inclui um monócitos e dois macrófagos.Figura dois, linha do tempo da expressão de CD115 durante a diferenciação. Observe que mais de 95% de todas as células são positivas para CD115 após cinco dias de diferenciação, indicando que a grande maioria das células são monócitos ou macrófagos. A classificação pode ser baseada no tamanho e granularidade celular, mas marcadores celulares específicos são mais confiáveis.Figura três, aumento da expressão de maturidade de monócito-macrófago. Marcador F quatro 80, dia cinco, observe o surgimento de uma população com expressão intermediária de F quatro 80, o que é compatível com fenótipo de monócito. Dia sete, observe o deslocamento para a direita da expressão de F quatro 80, compatível com a maturação do macrófago.O isolamento de monócitos é importante e essencial para muitos estudos in vitro e in vivo. Essas células são um alvo interessante, por exemplo, em relação a doenças como doença arterial periférica ou doença cardíaca coronariana, que estão relacionadas à isquemia. A medula óssea do fêmur e da tíbia de camundongos de biópsia é coletada por meio da lavagem dos ossos com meio aquecido; a suspensão celular é suplementada com M-CSF e cultivada em superfícies com aderência ultra baixa para evitar a diferenciação induzida por adesão dos monócitos. As propriedades e a diferenciação dos monócitos são verificadas em diferentes momentos e estágios com marcadores como CD11b, CD115 e F4/80, utilizados para fenotipar as células.Se for desejada a administração sistêmica do fármaco, a injeção intravenosa é uma maneira fácil e eficaz de realizá-la. Descrevemos o método para isolar grandes quantidades de monócitos MI da medula óssea de forma simples e economicamente viável. Com este novo método, somos capazes de gerar cerca de 11 milhões de monócitos por camundongo.

isolation-intravenous-injection-murine-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O transplante de medula óssea oferece uma maneira de alterar o genótipo de células derivadas de medula óssea. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados, transplante de medula óssea pode mudar as células de medula óssea derivadas de um genótipo diferente sem alterar a non-bone marrow genótipo celular derivada.

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

Neste vídeo, demonstramos a ativação de macrófagos derivados da medula óssea em resposta ao lipopolissacarídeo bacteriano e imunoglobulina intravenosa.

Ativação de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo em resposta a anticorpos

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Este protocolo foi estabelecido para cultivar tetrahidrobiopterina (BH4)- e sintetizador de óxido nítrico indutível (iNOS)-deficiente macrófagos murinos para estudar biologia no-redox. O estudo tem como foco a redução da contaminação potencial do BH4 e de outros artefatos encontrados em métodos tradicionais de isolamento e cultura que podem confundir desfechos experimentais e interpretação dos resultados.

Isolamento e Cultura In vitro de Macrófagos Derivados da Medula Óssea para o Estudo da Biologia NO-Redox

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.

Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Aprenda a isolar monócitos de medula óssea murina para pesquisa cardiovascular usando camundongos. Este método reduz custos e o número de animais sacrificados, gerando grandes quantidades de células para estudos de crescimento vascular.

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

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