Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Olá, meu nome é Helen Kuster e estou trabalhando no Grupo de Pesquisa Cardiovascular do Dr. Harold e professor da Auto Vica University em MacBook. Estamos interessados na caracterização do isolamento de monócitos marinhos para uso em veículos no crescimento de vasos colaterais. As seguintes etapas principais são necessárias para o cultivo de monócitos derivados da medula óssea, primeiro anestésico de camundongo e luxação cervical, segunda extração e enxágue do fêmur.

Terceira filtragem da medula óssea. Quarto para etapas de lavagem com quinto médio, cultivo das células em placas de fixação ultrabaixas. Sexta citometria de fluxo.

Para extrair monócitos da medula óssea, o camundongo será anestesiado com flúor ISO e eutanasiado por luxação cervical. O mouse será fixado e ambos os membros inferiores serão separados com um bisturi esteróide. Tanto o fêmur quanto a tíbia foram colhidos e lavados com etanol 96% de etano por um período mínimo de 90 segundos.

Depois disso, todas as etapas devem ser estritamente estéreis para evitar contaminação. Músculos ou tendões serão removidos do osso. O fêmur e a tíbia são enxaguados com PBS quente várias vezes.

Para a colheita da medula óssea, as extremidades proximal e distal de cada osso são cortadas com uma tesoura fina. Para enxaguar o osso, precisamos de uma agulha esteróide 28 G, uma seringa de um mililitro e entre 10 a 15 mililitros de meio por osso. Em seguida, a medula óssea é filtrada através de um S de 70 micrômetros enquanto segura o osso com uma pinça fina.

Enxágue os ossos um a um até que fiquem iludidos. Para minimizar o estresse celular, aplique pressão cuidadosamente no carimbo da seringa. Lave a sopa com PBS.

Em seguida, as células são centrifugadas a 250 G por 10 minutos à temperatura ambiente. E os reus são suspensos com médium? Após esta etapa, repita a etapa novamente.

Para monócitos derivados da medula óssea da medula óssea nativa, usamos M 199 com 1% de penicilina e estreptomicina e 10% de soro para tosse fetal. Além disso, adicionamos 20 nanogramas por mililitro INE MCSF no primeiro dia. Oito nanogramas por mililitro de interferência gama são adicionados ao meio no último dia de cultivo.

regulação positiva do MHC dois, as células são semeadas em placas de fixação ultrabaixas com poços grossos para evitar a adesão permanente no fundo. Usamos uma concentração de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro com até seis mililitros por poço. O período de cultivo é de cinco dias a uma temperatura de 37 graus e 5% de dióxido de carbono.

As células são verificadas diariamente após cinco dias entre 60 e 80% das células são monócitos. Meu nome é Martin Bachner e sou estudante de medicina aqui na Auto Fungi University no Departamento de Cardiologia, anologia e cronologia. E quando você faz a injeção intravenosa, é importante praticar muito antes de fazê-lo, caso contrário, você não conseguirá aplicar os monócitos de maneira adequada.

Experimentos mostraram que os monócitos são mais eficazes na melhoria da agenesia artística quando aplicados sistemicamente. Uma forma comum de aplicação sistêmica de medicamentos é uma injeção de WA de cauda. No nosso caso, injetamos 2,5 milhões de monócitos, que são ressuspensos e cloreto de sódio.

Existem quatro vasos na cauda das artérias do camundongo no lado ventral e dorsal, e dois diminui no lado lateral. Portanto, para a injeção de WA, temos que girar a cauda por cerca de 90 graus. Para facilitar o procedimento, o mouse deve ser aquecido usando uma almofada de aquecimento por cerca de 10 minutos.

Os animais devem ser observados por aquecimento. Isso é importante para reconhecer sinais de superaquecimento. Além disso, precisamos desse agente de infecção e de uma agulha de 30 genes colocada em uma seringa de insulina de um mililitro.

Fixe o animal cuidadosamente em uma contenção, o que torna muito mais fácil injetar na cauda. Certifique-se de que o mouse tenha espaço suficiente para respirar antes de carregar a solução na seringa. Vortex, a solução de monócitos para garantir que todos os monócitos possam ser injetados.

Desinfeta o local da injeção para evitar infecções, coloque a cauda entre o baque e o dedo indicador. No ponto mais distal, a agulha é inserida em um ângulo plano. Se for colocado na veia, é muito fácil injetar a solução de monócitos.

Se houver uma bolha, é um sinal de uma injeção errada. Você deve parar imediatamente e tentar mais. Proximal, tente sempre injetar devagar e não mais do que cinco microlitros por grama.

Se a injeção for bem-sucedida, pare o sangramento no local da injeção aplicando uma leve pressão por cerca de um minuto. Ao final do procedimento, abra o afastador e coloque o camundongo em sua gaiola para caracterizar os monócitos. Usamos os efeitos com uma combinação de antígenos, ou seja, CD 11 B, F quatro 80, CD 115 e GL um.

A expressão desses antígenos se correlaciona com um estágio de desenvolvimento para análise dos monócitos. Fizemos os fatos nos dias 0, 3, 5 e sete, a pureza dos monócitos aumenta até 90% no dia cinco. Para alcançar essa pureza, é importante esgotar fortemente o macrófago terrimina.

As células não terrinas são esgotadas usando tampão de lavagem livre de EDTA. Para esgotar as células da terrina, estamos usando EDTA contendo lavagem, tampão e carinho suave. Este diagrama mostra os principais tipos de células para sua cultura de uma extremidade.

Os diferentes tipos de células mostrados são um linfócito, dois monócitos, três granulócitos, aumentando a pureza dos monócitos após o quinto dia. E cultura. Observe que a mudança na composição celular durante a população de células de cultivo inclui um monócito e dois macrófagos.

Figura dois, linha do tempo da expressão do CD 115 durante a diferenciação. Observe que mais de 95% de todas as células são positivas para CD 115 após cinco dias de diferenciação, indicando que a grande maioria das células são monócitos ou macrófagos. A classificação pode ser baseada no tamanho e na granularidade da célula, mas marcadores celulares específicos são mais confiáveis.

Figura três, aumentando a expressão da maturidade dos macrófagos monócitos. O marcador F quatro 80, dia cinco, observa o aparecimento de uma população com expressão intermediária de F quatro 80, que é consistente com o fenótipo de monócitos. Dia sete, observe o deslocamento para a direita da expressão de F quatro 80 consistente com a maturação dos macrófagos.

O isolamento de monócitos é importante em muitos estudos in vitro e in vivo. Essas células são um alvo interessante, por exemplo, em conexão com doenças como doença arterial periférica ou doença cardíaca coronária, que estão relacionadas à isquemia. A medula óssea de FEMA e tíbia de camundongos com biópsia é colhida por lavagem de ossos com suspensão de células médias quentes é suplementada com MCSF e cultivada em superfícies de fixação ultra baixa para evitar a adesão desencadeada diferenciação das propriedades dos monócitos e a diferenciação dos monócitos é verificada em diferentes momentos e fatos com marcadores como CD 11 b, CD 115 e FO 80 são usados para fenotipar as células.

Se a administração sistêmica de medicamentos for desejada, a injeção intravenosa é uma maneira fácil e eficaz de fazê-lo. Descrevemos o método para isolar grandes quantidades de monócitos IM da medula óssea de maneira simples e econômica. Com este novo método, somos capazes de gerar cerca de 11 milhões de monócitos por camundongo.