Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os efeitos da preparação de produtos de tabaco na secreção de citocinas e na morte de células-alvo por P BMCs. Isso é feito primeiro tratando os BMCs de P cultivados com condição de fumaça total, meio ou nicotina e, em seguida, a coloração intracelular dos BMCs de p tratados é realizada para determinar sua produção de citocinas. Alternativamente, as células K 5 62 marcadas com CFSE são co-cultivadas com células efetoras PBMC tratadas com meio condicionado por fumaça e a viabilidade das células K 5 62 é qualificada por sete colorações A a d.

Em última análise, os efeitos das preparações de produtos combustíveis de tabaco nos BMCs P de ambos os ensaios são medidos por citometria de fluxo. As principais vantagens de nossas técnicas ou dos métodos existentes, como ensaio de liberação de cromo ou ponto ALI, são nossos métodos de alto rendimento, não radioativos e podemos medir a funcionalidade da célula. Embora esse método possa fornecer informações sobre os efeitos biológicos das preparações de produtos de tabaco.

Também pode ser aplicado à avaliação de outros compostos que afetam as funções mediadas por receptores semelhantes e STIC das células efetoras de PBMC Antes de iniciar o procedimento de coloração. Diluir a condição de fumaça total, meio e nicotina nas concentrações listadas. Em RPMI, o volume completo médio a total de 100 microlitros por poço em uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione 100 microlitros de P BMCs, suspensos em meio completo a uma concentração de um vezes 10 às seis células por poço para um volume total de 200 microlitros por poço. Em seguida, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após três horas, lave as células e aspire o sobrenadante.

Em seguida, cubra a placa novamente e vórtice para dissociar os pellets. Lave as células mais duas vezes, uma vez em tampão gelado e uma vez em meio completo após a segunda lavagem. Trate-os com 200 microlitros por poço de meio completo suplementado com plugue de Golgi e LPS por seis horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Em seguida, lave as células com tampão de corrida a frio e trate-as com 100 microlitros de cyto fix por poço a quatro graus Celsius após 20 minutos, lave as células três vezes com lavagem permanente gelada. Em seguida, adicione 45 microlitros de cyto perm a cada poço, seguidos por cinco microlitros de cada um dos anticorpos listados. Após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células três vezes e fixe-as em 200 microlitros de formaldeído gelado, 2% para formaldeído.

Em seguida, transfira as células para tubos de 12 por 75 milímetros e analise as amostras em um citômetro de fluxo. Depois de preparar um prato de produto de tabaco tratado com pbmc como acabamos de demonstrar, lave uma cultura de células K 5 62, colhidas a uma fluência de 80%co em 10 mililitros de DPBS. Resus. Suspenda o pellet em cinco mililitros de DPBS e conte as células.

Em seguida, adicione um mililitro de solução de trabalho CFSE recém-preparada a uma a duas vezes 10 elevado à sétima K 5 62 células em um mililitro de meio completo e disperse a coloração celular por vórtice. Incube as células em temperatura ambiente após exatamente dois minutos, adicione 200 microlitros de FBS e vortex as células novamente, incubando-as por mais dois minutos. Após a segunda incubação, lave as células em 10 mililitros de meio completo, depois ressuspenda o pellet em mais 10 mililitros de meio completo e conte as células.

Agora centrifugue os PBMs tratados com tabaco e decanta o sobrenadante. Em seguida, recoloque a tampa, ressuspenda as células por vórtice e lave-as em 200 microlitros de meio completo por poço. Para iniciar o ensaio de morte, adicione as células K 5 62 marcadas com CFSE ao pbmc na proporção de um para 15 e incube a co-cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Após cinco horas, gire as células e descarte o sobrenadante. Suspenda os pellets por vórtice e, em seguida, lave as células com 200 microlitros de tampão de funcionamento por poço, em seguida, adicione 95 microlitros de tampão de funcionamento, seguido de cinco microlitros de sete A a d para um volume total de 100 microlitros por poço. Por fim, incube as células no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de corrida a cada poço e transfira todo o volume para os tubos de fax correspondentes apropriados para determinar a porcentagem de sete células positivas a, D e CFSE. Por análise de citometria de fluxo, observa-se um aumento dependente da dose na morte celular com meio condicionado por fumaça total em 24 horas, com quase 80% das células mortas a quatro microgramas por mililitro de unidades de nicotina equina. No entanto, o tratamento dos BMCs p por apenas três horas não resulta em toxicidade significativa, mesmo a cinco microgramas por mililitro de unidades de nicotina equina de meio condicionado a fumaça inteira em 24 horas.

Um grau comparável de morte celular não é observado antes do tratamento com 3000 microgramas por mililitro de nicotina após três horas, o tratamento com nicotina não causa morte celular mensurável antes da concentração de 2000 microgramas por mililitro de tratamento com condição de fumaça total, meio e nicotina, seguido pela estimulação do receptor TLR quatro por LPS resulta em uma diminuição dependente da dose de citocinas secretadas. Embora o grau de supressão varie entre as citocinas individuais. Além disso, quando as células são tratadas com LPS e plugue de Golgi por apenas seis horas, uma diminuição no número de células positivas para citocinas intracelulares é observada após a exposição ao meio de fumaça total, mesmo nas concentrações mais baixas de unidades de nicotina equina em comparação com a exposição à nicotina.

De fato, os resultados deste ensaio de morte ilustram que a exposição a 1,56 microgramas por mililitro de meio de fumaça total reduz significativamente a capacidade de matar da população PBMC efetora em comparação com o controle e as concentrações de dose mais baixas. Considerando que o tratamento com nicotina em altas ou baixas concentrações não interfere na capacidade de matar da população efetora PBMC ao tentar esses procedimentos. É importante ser preciso com a rotulagem CFSE, bem como com as diluições de anticorpos, tempo de rotulagem e temperaturas de incubação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de marcação de anticorpos na citometria de fluxo para determinar os efeitos de preparações de produtos de tabaco ou outros tratamentos nas células mononucleares do sangue periférico.