Name: Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda métodos de citometria de fluxo para avaliar citotoxicidade e imunossupressão em células mononucleares do sangue periférico expostas a produtos de tabaco combustível.

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Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.

NOTA: consentimento informado por escrito para fazer este estudo foi obtido em uma unidade de pesquisa clínica local, sob aprovação IRB, por Boas Práticas Clínicas. Processamento do sangue, o isolamento de PBMC e as outras experiências de cultura de células são realizadas em condições estéreis, utilizando reagentes e fornecimentos microbiologicamente estéreis. 1. Preparação WS-CM <ol><li> Gerar WS-CM como descrito anteriormente 12. <ol><li> Prepare WS-CM, passando fumaça de quatro 3R4F cigarros de referência através de Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte esquema de fumar: 35-60-2, o volume de sopro em ml, intervalo de sopro em segundo, ea duração do sopro no segundo, respectivamente. Cada preparação gera uma amostra de 20 ml. </li></ol></li><li> Tubo (s) etiqueta com data, hora concluída, eo nome e número de cigarros. Armazenar os 500 mL alíquotas a -80 ° C imediatamente após o tabagismo está concluída. </li><li> Analise alíquotas de WS congelados-CM Para determinar os níveis de nicotina, nitrosaminas específicas do tabaco, e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, tal como anteriormente descrito 12. </li></ol> 2. Isolamento de PBMC <ol><li> Coletar sangue fresco de doadores saudáveis ​​(que são não-consumidores de produtos de tabaco) Isolar PBMC de sangue fresco conforme descrito abaixo em uma aprovação separada do Wake Forest Baptist Health IRB 15. <ol><li> Antes da chegada da bolsa de sangue, possuem uma garrafa de 500 ml, uma tesoura, tampão de isolamento, e salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) pronto em um nível de segurança biológica 2 (BSL-2) cultura de células de capa. Tampão de isolamento deve ser protegido da luz. </li><li> Mantenha o saco de sangue de cabeça para baixo e cortar o tubo logo abaixo onde foi preso deixando pelo menos 3 cm de tubagem. </li><li> Retire a tampa da garrafa de 500 ml e mantenha o tubo acima da abertura do frasco. Pegue o saco de sangue e inverter para permitir que o sangue flua livremente do saco em tele garrafa até que o saco está vazio. Permitir que o sangue flua para a parede interior da garrafa contra directamente para baixo a fim de evitar a criação de bolhas. </li><li> Pour tampão de isolamento para dentro da garrafa a uma proporção de 1: 5 de tampão de isolamento de sangue. Tapar o frasco firmemente e suavemente invertê-lo, a cargo de ponta a ponta, 10 vezes. Deixar o frasco dentro do capuz de cultura de células a incubar com as luzes apagadas, durante 1 h à TA. </li><li> A, camada de cor de palha luz vai construir acima do sangue. Remover esta camada usando uma pipeta de 25 ml sorológico em 50 ml tubos cônicos. O valor arrecadado pode variar 50-300 ml, dependendo do assunto que doou sangue. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante translúcido, deixando um pelete de cor de sangue escuro. O pellet será solto, mas viscoso. </li><li> Pipetar 3 ml de tampão de isolamento em tubos cónicos de 15 ml. </li><li> Para ressuspender o sedimento, adicionar 20 ml de DPBS para cada 50 ml de líquido cor de palha recolhidos em step 2.1.5. Vortex para misturar bem, e consolidar o líquido novamente suspensas a partir de vários tubos. Este líquido contém suspenso células sanguíneas. </li><li> Com uma pipeta de transferência, a transferência de 5 ml de células sanguíneas em suspensão em 3 ml de tampão de isolamento no passo 2.1.8. Inclinar o tubo cónico de 15 ml que contém a suspensão de células lenta e suavemente para criar duas camadas separadas. Centrifugar os tubos a 400 xg durante 40 min à temperatura ambiente com o mínimo de aceleração e sem travão. </li><li> Usar uma pipeta de transferência para remover a camada resultante turva meio (buffy coat) contendo PBMCs em um tubo de 50 ml. Evite desenho outras camadas claras abaixo dela. Transferência não mais do que 25 ml em cada tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 25 ml de tampão corrente fria (ou mais para preencher todo o volume restante do tubo de 50 ml) para lavar as células. Centrifuga-se as células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de corrida. Este contém PBMC. Contar as células e usar immediata ou colocar no gelo para congelar. </li></ol></li></ol> 3. congelamento e descongelamento do PBMC <ol><li> Centrifugar as PBMCs que foram recolhidas no passo 2.1.13 durante 10 min a 400 x g. </li><li> Encher o recipiente de congelamento com álcool isopropílico acordo com as instruções do fabricante. CUIDADO: O álcool isopropílico é inflamável e altamente tóxico. </li><li> Ressuspender o sedimento com meio RPMI 1640 (4 ° C) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esta é meio RPMI 1640 congelação. Ressuspender o sedimento com uma quantidade de meio que irá resultar numa suspensão com cerca de 5 x 10 7 células / ml de congelação. O número de células disponíveis para a congelação irá variar. </li><li> Distribuir aliquotas de 1 mL de suspensão de células em tubos criogénicos de 2 ml e colocar os tubos criogénicos de congelação no recipiente. Coloque o recipiente de congelamento com criotubos em freezer a -80 ° C para armazenar O / N e, em seguida, remover os criotubos e transferir para armazenar em umcongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C. </li><li> Remover o tubo criogénico de armazenamento criogénico e descongelar rapidamente com agitação suave num banho de água a 37 ° C. </li><li> Transferir imediatamente as PBMCs foram descongeladas em tubo criogénico a um tubo de 15 ml com 10 ml de meio RPMI 1640 completo (4 ° C) contendo 10% de FBS, 1% de Pen / Strep e 1% de L-glutamina. O conteúdo do criotubo descongelado deve ser o mais rapidamente possível transferido para obter a viabilidade celular máxima 15. </li><li> Centrifuga-se as PBMC a 400 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento com 5 ml RPMI 1640 completo e contar as células. </li><li> Medir a viabilidade celular por meio de métodos estabelecidos, tais como o método de exclusão de azul de tripano. Geralmente a viabilidade celular, com este método é de cerca de 90-95%. As PBMC agora está pronto para usar em experiências. </li></ol> 4. morte celular da Determinação NOTA: As diluições são listadas aqui para o propósito deste study. As diluições podem ser alteradas em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 uL / ​​poço, como indicado abaixo. </li><li> Diluir WS-CM às seguintes concentrações: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 ug / mL de unidades de equi-nicotina (com base no teor de nicotina no WS-CM) 12. </li><li> Diluir nicotina em meio RPMI com as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Para o propósito deste estudo, preparar dois conjuntos de placas como anteriormente. Cobrir as placas e incubar uma placa durante 24 horas e uma placa durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste pontos de tempo que for necessário. </li&gt; <li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 95 ul de tampão de corrida seguido por 5 ul de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para cada poço de um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Adicione 100 ml de tampão de corrida para tubos de fragmentação. Transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo. </li><li> Determinar a percentagem de células 7AAD-positivo utilizando o software de análise de citometria de fluxo. </li></ol> 5. CE 50 Determinação <ol><li> Os valores de EC50 de WS-CM e nicotina são determinadas por coloração 7AAD-positivo de PBMC. </li><li> O valor de EC50 é definido como o ácido clorídrico coneentration à qual 50% das células já não eram viáveis ​​num ensaio de 24 horas, e os valores são expressos como ug de equi-nicotina unidades / ml. </li><li> Para as finalidades deste estudo, os valores de EC 50 foram determinados como sendo 1,56 ng / mL e 1,650 ug / ml para o WS-CM e nicotina, respectivamente. </li></ol> 6. As citocinas secretadas NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Diluir nicotina para as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / mL. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço.O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e, finalmente, a suspensão de células com 200 ul de tampão de corrida de gelo frio e repetindo o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de meio RPMI completo, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de 10 ug / ml de LPS meio a cada poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 4 h, 24 h, 48 h, ou 72 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste os tempos de incubação, se necessário. </li><li> Centrifugar a placa a 300 x g durante 3 min. </li><li> Tome 175 mL de sobrenadante de cada bem e guarde em um freezer a -80 ° C para realizar os ensaios em etapas 7 e 8. </li></ol> 7. Cytometric Bead Matriz Assay &lt;ol&gt; <li> Descongelar os sobrenadantes de células preparadas a partir do passo 6.10 e utilização no ensaio de CBA. Realizar o ensaio de matriz de esferas de citometria (CBA), conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> Descongelar os sobrenadantes de células do passo 6.10 e utilização no ELISA de IL-8. Realizar o ensaio ELISA, conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 9. intracelular Coloração e Citometria de Fluxo NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Na mesma placa, diluir nicotina para as concentrações seguintes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e ambientalmente hazardous. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 x g durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de meio RPMI completo para a placa, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Preparar as concentrações de trabalho de 2 ul / ml GolgiPlug e 10 ug / ml de LPS, utilizando meio RPMI completo e adicionar 200 ul a cada poço. </li><li> Incubar a placa durante 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> No final do passo 9.8, lavar as células com tampão de corrida (4 ° C) e centrifugação a 300xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de Cytofix a cada poço e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as células 3 vezes, conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 45 ul de 1x Cytoperm a cada poço seguido por 5 ul de cada um de um dos seguintes anticorpos para cada cavidade: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar as células duas vezes conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) e uma vez com tampão de corrida (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células com 200 uL de paraformaldeído a 2% (4 ° C). Transferência das células em 12 × 75 mm tubos, e analisar as amostras em citômetro de fluxo. CUIDADO: O paraformaldeído é corrosivo, altamente tóxico e um perigo para a saúde. </li></ol> 10. K562 Ensaio Killing NOTA: As células devem ser cultivadas K562em cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio RPMI completo até atingirem 80% de confluência antes do ensaio. <ol><li> Prepare um mM 5 carboxyfluorescein solução éster succinimidyl (CFSE) estoque, adicionando 18 mL de DMSO para o frasco. </li><li> Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço para alcançar as unidades de equi-nicotina desejadas ou as concentrações de nicotina para cada poço. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em meio RPMI completo a uma concentração de 1,5 x 10 6 células / poço. O volume total de células com WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células K562 por adição de 10 ml de DPBS e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células com 10 ml de DPBS e contar as células K562. </li><li> Prepare CFSE workisolução ng por adição de 1 ml de solução de estoque de CFSE a 1 ml de DPBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de trabalho de CFSE a 1 ml da suspensão de células K562 contendo 1-2 x 10 7 células. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT. </li><li> Imediatamente adicionar 200 mL de FBS. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT. </li><li> Adicionar 10 ml de meio RPMI completo e centrifugar o tubo a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e meio RPMI romper a pelota e ressuspender as células com 10 ml de meio RPMI completo e contar as células K562 marcadas com CFSE. </li><li> Lavam-se as CMSPs por centrifugação a placa a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por decantação do líquido. Substituir a tampa e vortex a parte inferior da placa. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar células K562 marcadas com CFSE, na proporção de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a cada poço da placa de amostra de CMSP e ainda incubate durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lava-se a mistura de células por centrifugação a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por se eliminar o líquido. Coloque a tampa e vortex a parte inferior da placa. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de corrida e repetir o passo de lavagem descrito no passo 10,14 mais uma vez. </li><li> Adicionar 95 ul de tampão de corrida, seguido por 5 mL de 7AAD a cada poço para um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de corrida a cada poço e transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo. </li><li> Determinar a percentagem de células positivas 7AAD e CFSE-positivos usando software de análise de citometria de fluxo. </li></ol>

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<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensaio nestes ensai...

Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramentas para orientar a regulamentação emergente de vários produtos do tabaco 10,11. Por exemplo, nós demonstramos que inflamáveis ​​produtos do tabaco (UTEs), como meio de toda com ar-fumo (WS-CM) e material particulado total (TPM) são muito mais citotóxica e prejudicial paraDNA de UTEs não-combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, foi recentemente informou que UTEs combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, que recentemente informou que UTEs combustíveis causou acentuada imunodepressão. Isto foi demonstrado pela supressão da Toll- como receptores (TLR) -ligands, estimulou a secreção de citocinas, e célula-alvo (K562) matando por PBMC em um modelo ex vivo 14. Dada a importância da inflamação em processos de doença induzida por fumo de cigarro, uma maior optimização das condições de ensaio para avaliar os efeitos imunomoduladores do fumo do cigarro é apresentado no presente relatório. Os ensaios ex vivo tipicamente medido intracelular e citocinas, bem como a função citolítica das células T citotóxicas e de células K562 NK em ensaios de morte 14 segregada. Os ensaios envolvidos pré-incubação com WS-CM e nicotina e subsequente estimulação de PBMCs com agonistas de TLR durante um período de 3 dias; as leituras finais são realizadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e / ou citometria de fluxo. Utilizamos o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que se liga a receptores TLR-4 e estimula as CMSPs resultando na produção de citocinas intracelulares e de secreção de citocinas. Além disso a optimização das diversas etapas do ensaio para avaliação dos efeitos imunomoduladores da UTEs, também presentes métodos para isolar as PBMC, ensaios de morte celular, e a quantificação de IL-8. Estes métodos podem ser aplicados para abordar outras questões de pesquisa e mais refinado para avaliar os produtos do tabaco no contexto regulamentar. Tabela 1. relatos de in vitro e ex vivo Publicado métodos usados ​​para estudar varilus efeitos fisiopatológicos de preparações de produtos de tabaco CS, médio fumaça de cigarro.; CSC, fumaça de cigarro condensado; CSE, cigarro extrato de fumo; ELISA, enzima-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; qPCR, a reação em cadeia da polimerase quantitativa; RT, em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa; TS, fumo de tabaco. <table><tbody><tr><td> Autor (ano de estudo) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell, et al. (2008) </td></tr><tr><td> As células usadas </td><td> Células do endotélio brônquicas humanas (BEAS-2B), neutrófilos humanos </td><td> Células epiteliais alveolares Humanos (A549) </td><td> Vias aéreas células musculares lisas Humanos (HASMC) </td><td> As células U937 premonocytic Humanos, monócitos humanos </td><td> Alveolares tipo II células epiteliais (ATII) </td><td> Monocytic HumanoA linha de células (células THP-1), os macrófagos de pulmão humano </td></tr><tr><td> TPP usado </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Método usado </td><td> ELISA, qPCR, migração, mudança electromobility </td><td> Imuno-química, electroforese, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforese </td><td> Mudança Gel-mobilidade </td><td> A microscopia óptica, microscopia eletrônica, eletroforese, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit de E-toxate (Sigma), o ensaio de placa de p65 (TransAM), electroforese, vários kits de imunoensaio </td></tr><tr><td> Medida </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, a migração </td><td> Acetiltransferases de histona, desacetilases de histonas, NF-kB, IL-8, pi-kB α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina </td><td> Proteínas de choque térmico / estresse (HSP / Hsp70), fator de transcrição HF, NF-kB,TNF-α </td><td> Proteína tensioactiva (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, o TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilação de ERK, cJun: ligação de ADN, a glutationa, o p65: ligação de ADN </td></tr><tr><td> Resultado final </td><td> CSE regula negativamente a produção de citocinas por meio de supressão da activação de AP-1. </td><td> H 2 O 2 e CSC melhorar a acetilação de proteínas histona, diminuir a actividade de histona-desacetilase, diferencialmente regulam a libertação de citocina pró-inflamatória. </td><td> A fumaça do cigarro pode causar a liberação de IL-8 de HASMC, reforçada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 libertação, a inibição da eotaxina e RANTES por fumaça de cigarro. </td><td> TS activado fator de transcrição HF, que foi associado com Hsp70 superexpressão e inibição da actividade NFkB e TNF-α liberação vinculativo. </td><td> Redução ATII níveis de quimiocinas derivadas de células compromisso alveoreparação lar, contribuindo para o cigarro induzida pelo fumo dano alveolar e enfisema. </td><td> Dados fornecer explicação mecanicista para infecções respiratórias por que os fumantes têm aumentado. Supressão da resposta inata é acompanhada por um aumento na produção de IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>Tubos de 12 x 75 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de 2 ml Axygen</td><td></td><td>MCT-150-CS</td><td></td></tr><tr><td>3R4F cigarros de referência</td><td>Univ. de Kentucky, Faculdade de Agricultura</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>frasco</td> <td>de 500 mlCorning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>placa de fundo plano de 96 poços</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>placas de fundo redondo de 96 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de células</td><td>Centrífuga Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondas Moleculares Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cluster</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Nocivo se ingerido, cancerígeno</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Inflamável</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software analisa dados CBA</td></tr><tr><td>Unidade de filtro</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 cores, em Ex 405 e Em 785.</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 cores em Ex 495 e Em 785.</td></tr><tr><td>Software de análise de citometria de fluxo</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Contém DMSO, irritante</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Carcinógeno, irritante, corrosivo</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>de citocinas inflamatórias humanasBD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gama; V-500 Anticorpo</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>sensibilizador de pele</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R e D Sistemas</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de isolamento</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Líquido inflamável, irritante</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alpha; Anticorpo PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Toxicidade aguda, oral</td></tr><tr><td>Monensina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Toxicidade aguda, perigo ambiental</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" M"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Inflamável, irritação da pele</td></tr><tr><td>Caneta/estreptococo</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de corrida</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para avaliar a citotoxicidade e imunossupressão de combustível tabaco preparações produto

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (quatro amostras do dador). T-teste do aluno entre amostras de controlo tratados e não tratados foi realizada utilizando o software Excel, bem como comparações t-teste para todos os tratamentos com seus controles correspondentes. A significância estatística foi indicada por: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Para medir o efeito da exposição a WS-CM e nicotina, as PBMC foram tratadas com diferentes concentraçõ...

Usando ensaios ex vivo otimizados de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), mostramos que uma preparação de produto de tabaco combustível suprime acentuadamente as citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores e a capacidade citolítica de PBMCs efetores. Esses ensaios rápidos podem ser úteis na avaliação do produto e na compreensão dos potenciais efeitos a longo prazo da exposição ao tabaco.

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os efeitos da preparação de produtos de tabaco sobre a secreção de citocinas e a eliminação de células-alvo por PBMCs. Isso é realizado primeiramente tratando PBMCs cultivados com meio condicionado por fumaça total, meio de cultura ou nicotina, seguido por coloração intracelular dos PBMCs tratados para determinar sua produção de citocinas. Alternativamente, células K562 marcadas com CFSE são cultivadas em co-cultura com PBMCs efetoras tratadas com meio condicionado por fumaça total, e a viabilidade das células K562 é avaliada por coloração com sevenAAD.Por fim, os efeitos das preparações de produtos de tabaco combustíveis sobre as BMCs-P de qualquer ensaio são medidos por citometria de fluxo. As principais vantagens de nossos métodos em relação aos métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo ou o teste ALI, são o alto rendimento, a ausência de radioatividade e a possibilidade de medir a funcionalidade celular. Embora este método possa fornecer informações sobre os efeitos biológicos das preparações de produtos de tabaco.Ele também pode ser aplicado à avaliação de outros compostos que afetam as funções mediadas pelo receptor tipo toll e as funções STIC de células efetoras PBMC. Antes de iniciar o procedimento de coloração, dilua o condensado de fumaça total, o meio e a nicotina nas concentrações indicadas em meio RPMI completo, até um volume total de 100 microlitros por poço em uma placa de 96 poços.Em seguida, adicione 100 microlitros de BMCs-P, suspensos em meio completo na concentração de um vezes 10 elevado a seis células por poço, para um volume total de 200 microlitros por poço. A seguir, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius e 5%CO2. Após três horas, lave as células e aspire o sobrenadante.Em seguida, cubra novamente a placa e vortexe-a para dissociar os pellets. Lave as células mais duas vezes, uma vez em tampão corrente gelado e uma vez em meio completo após a segunda lavagem. Trate-as com 200 microlitros por poço de meio completo suplementado com Golgi plug e LPS durante seis horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Em seguida, lave as células com tampão corrente gelado e trate-as com 100 microlitros de cyto fix por poço a quatro graus Celsius após 20 minutos, lave as células três vezes com perm wash gelado. Em seguida, adicione 45 microlitros de cyto perm a cada poço, seguido de cinco microlitros de cada um dos anticorpos listados. Após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células três vezes e fixe-as em 200 microlitros de paraformaldeído a 2%, gelado.Em seguida, transfira as células para tubos de 12 por 75 milímetros e analise as amostras em um citômetro de fluxo. Após preparar uma placa de pbmc tratados com produto de tabaco conforme acabou de ser demonstrado, lave um cultivo de células K 5 62, colhidas em uma confluência de 80% em 10 mililitros de DPBS.Resus. Suspenda o pellet em cinco mililitros de DPBS e conte as células.Em seguida, adicione um mililitro de solução de trabalho de CFSE recém-preparada a um a dois vezes 10 à sétima células K562 em um mililitro de meio completo e disperse a coloração celular por vortex. Incube as células à temperatura ambiente; após exatamente dois minutos, adicione 200 microlitros de soro bovino fetal (FBS) e vortexe as células novamente, incubando-as por mais dois minutos. Após a segunda incubação, lave as células em 10 mililitros de meio completo, depois reconstitua o pellet em outros 10 mililitros de meio completo e conte as células.Agora, centrifugue os pBMCs tratados com tabaco e decante o sobrenatante. Em seguida, recoloque a tampa, ressuspenda as células por vortex e lave-as com 200 microlitros de meio completo por poço. Para iniciar o ensaio de morte celular, adicione as células K562 marcadas com CFSE aos PBMCs numa proporção de 1 para 15 e incube a co-cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.Após cinco horas, centrifugue as células e descarte o sobrenadante. Suspenda os pellets por vortexamento e, em seguida, lave as células com 200 microlitros de tampão de corrida por poço, depois adicione 95 microlitros de tampão de corrida, seguidos por cinco microlitros de sete A a d, perfazendo um volume total de 100 microlitros por poço. Por fim, incube as células ao abrigo da luz, à temperatura ambiente, por 15 minutos.Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de corrida a cada poço e transfira todo o volume para os tubos fax correspondentes apropriados para determinar a porcentagem de células positivas para sete a a D e CFSE. Por meio de análise citométrica de fluxo, observa-se um aumento dependente da dose na morte celular com meio condicionado por fumaça total após 24 horas, com cerca de 80% das células mortas a quatro microgramas por mililitro de unidades de nicotina equin. No entanto, o tratamento das pBMCs por apenas três horas não resulta em toxicidade significativa, mesmo a cinco microgramas por mililitro de unidades de nicotina equin de meio condicionado por fumaça total após 24 horas.Um grau comparável de morte celular não é observado antes do tratamento com 3000 microgramas por mililitro de nicotina após três horas; o tratamento com nicotina não causa morte celular mensurável antes da concentração de 2000 microgramas por mililitro no tratamento com a condição de fumaça total, meio e nicotina, seguido pela estimulação do receptor TLR4 por LPS, o que resulta em uma diminuição dependente da dose das citocinas secretadas. Embora o grau de supressão varie entre as citocinas individuais. Além disso, quando as células são tratadas simultaneamente com LPS e Golgi plug por apenas seis horas, observa-se uma redução no número de células positivas para citocinas intracelulares após exposição ao meio da condição de fumaça total, mesmo nas concentrações mais baixas de unidades equimolares de nicotina em comparação com a exposição à nicotina.De fato, os resultados deste ensaio de citotoxicidade ilustram que a exposição a 1,56 microgramas por mililitro de meio condicionado por fumaça total reduz significativamente a capacidade de citotoxicidade da população efetora de PBMCs em comparação com o controle e com as concentrações de dose mais baixas. Enquanto isso, o tratamento com nicotina, em concentrações altas ou baixas, não interfere com a capacidade citotóxica da população efetora de PBMCs durante a realização desses procedimentos. É importante ser preciso na marcação com CFSE, bem como nos tempos de marcação, diluições de anticorpos e temperaturas de incubação.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de marcação com anticorpos na citometria de fluxo para determinar os efeitos de preparações de produtos de tabaco ou outros tratamentos sobre células mononucleares do sangue periférico.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Este vídeo demonstra o efeito das preparações de produtos de tabaco, TPPs, na produção de citocinas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano usando citometria de fluxo. O tratamento das células com TPP regula negativamente a produção de citocinas pró-inflamatórias, que é estimada após a estimulação com lipopolissacarídeos, seguida de imunocoloração e análise por citometria de fluxo.

Analisando o efeito de preparações de produtos de tabaco na produção de citocinas por meio de coloração intracelular e citometria de fluxo

Neste vídeo, estudamos o efeito de um meio totalmente condicionado à fumaça, uma preparação de produto de tabaco combustível, na morte de células K562 por células mononucleares efetoras do sangue periférico.

Matando células K562 por células mononucleares do sangue periférico expostas a preparações de produtos de tabaco

Este vídeo ilustra uma técnica para avaliar a citotoxicidade em fatias de pulmão humanas cortadas com precisão por meio do ensaio WST-1. Fatias de pulmão humanas cortadas com precisão são submetidas a concentrações incrementais de um produto químico citotóxico para quantificar sua citotoxicidade. Uma diminuição na intensidade da cor serve como confirmação do impacto prejudicial do produto químico nas células pulmonares.

Um ensaio para medir a citotoxicidade induzida quimicamente em fatias de pulmão humanas cortadas com precisão

O objetivo deste protocolo é expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D humanos à fumaça de cigarro convencional (CS) na interface ar-líquido. O impacto do CS nos tecidos é então investigado usando um ensaio de atividade do citocromo P450, uma medição de batimento de cílios e uma abordagem de biologia de sistemas.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

O objetivo do estudo foi avaliar o impacto biológico de 15 constituintes da fumaça de cigarro usando uma combinação de um analisador de células em tempo real baseado em impedância e uma plataforma baseada em triagem de alto conteúdo (HCS) para avaliação toxicológica in vitro. Este estudo fornece informações sobre doses efetivas, toxicidade e modos de ação dos compostos testados.

Análise alto teor de triagem para avaliar os efeitos toxicológicos de Constituintes nocivas e potencialmente prejudiciais (HPHC)

Este protocolo descreve um método para expor roedores ao vapor de cigarro eletrônico (vapor E) e fumaça de cigarro. As câmaras de exposição são construídas modificando câmaras de anestesia com um sistema de bombeamento automatizado que fornece vapor E ou fumaça de cigarro a roedores. Este sistema pode ser facilmente modificado para acomodar muitos endpoints experimentais.

Comparando os efeitos do fumo eletrônico do cigarro e do cigarro em uma novela<em&gt; In Vivo</em&gt; Sistema de Exposição

Aqui, descrevemos um aparelho de laboratório programáveis que pode ser usado para criar extratos de aerossol de cigarro eletrônico e fumaça de cigarro convencional. Este método fornece uma ferramenta útil para fazer comparações diretas entre cigarros convencionais e cigarros eletrônicos e é um ponto de entrada acessível para pesquisa de cigarro eletrônico.

Um microcontrolador operado dispositivo para a geração de extratos líquidos de aerossol de cigarro eletrônico e fumo cigarro convencional

Tendo em conta o princípio dos 3R, modelos respiratórios como alternativas para estudos animais estão evoluindo. Especialmente para a avaliação dos riscos das substâncias respiratórias, há uma falta de ensaios adequados. Aqui, descrevemos o uso de fatias de pulmão humano de precisão de corte para a avaliação de substâncias no ar.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Os usuários de cigarro eletrônico (e-cig) estão a aumentar em todo o mundo. Pouco, no entanto, é conhecido sobre os efeitos de saúde induzidos por aerossóis inalados e-cig. Este artigo descreve uma técnica de geração de aerossol e-cig apropriada para exposições de animais e estudos toxicológicos posteriores. Esses protocolos são necessários para estabelecer sistemas de exposição experimentalmente reproduzíveis e padronizada e-cig.

Geração de aerossol de cigarro eletrônico por um dispositivo de máquina-Vaping de terceira geração: aplicativo para estudos toxicológicos

Estabelecemos um modelo in vitro padronizado para estudar a exposição ao vapor de cannabis na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma abordagem sistemática para examinar os impactos da cannabis vaporizada, abordando o crescente interesse em vaporizadores de cannabis como uma alternativa ao fumo.

In vitro Exposições à Cannabis de Células Epiteliais Pulmonares na Interface Ar-Líquido

Aprenda métodos de citometria de fluxo para avaliar citotoxicidade e imunossupressão em células mononucleares do sangue periférico expostas a produtos de tabaco combustível.

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

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