Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar como as conexões sinápticas entre neurônios morfologicamente identificados são caracterizadas funcional e estruturalmente. Isso é conseguido através da obtenção de fatias cerebrais agudas, que são otimizadas para estudar uma conexão sináptica específica. O patch clamping é então usado para testar neurônios sinapticamente acoplados.

Para isso, um neurônio pós-sináptico prospectivo individual é corrigido e uma segunda pipeta é usada para estimular os neurônios circundantes, a fim de estabelecer a existência de uma conexão sináptica. Se nenhuma resposta for observada, o eletrodo estimulante é movido. Uma vez que uma conexão é encontrada, o neurônio pré-sináptico é recombinado no modo atacado.

Após registros eletrofisiológicos desses neurônios e preenchimentos simultâneos de biotina, a fatia é fixada, processada para biotina e reconstruções 3D assistidas por computador dos neurônios são realizadas. Em última análise, nosso método visa uma análise estrutural e funcional quantitativa correlacionada de microcircuitos neuronais. A principal vantagem das gravações pareadas de neurônios sinapticamente acoplados é que podemos realizar uma análise estrutural e funcional correlacionada de neurônios pré e pós-sinápticos em microcircuitos neuronais.

Ainda mais recentemente, técnicas introduzidas, como a estimulação óptica de neurônios, até agora não são capazes de conseguir isso com tantos detalhes. Este método permite o estudo das interações de excitação e inibição de tipos de neurônios morfologicamente identificados e como a atividade é modulada. Demonstrando os procedimentos para gravações de animais de estimação será Guan.

Ele que é pós-doutorando no meu laboratório. Depois de preparar as fatias da região alvo, deixe-as incubar durante esse tempo, puxe as pipetas de remendo, que devem ter uma haste longa e fina. Depois de prender uma fatia de cérebro com uma harpa de platina em uma câmara experimental, encha uma pipeta de gravação com solução interna.

Coloque a pipeta no pré-amplificador e tampe um suposto neurônio pós-sináptico no modo de célula inteira usando uma pipeta de busca de oito a 10 mega ohm de resistência preenchida com uma solução interna na qual os sais de potássio são substituídos por sais de sódio. Aplique sucção suave na pipeta de busca para remendar um potencial neurônio pré-sináptico em uma célula solta. Configuração anexada.

Mantenha o potencial da membrana sob a vedação solta entre 30 e 60 milivolts negativos no modo de grampo de corrente. Em seguida, aplique grandes pulsos de corrente de 0,2 a dois nano amperes para provocar um potencial de ação na célula pré-sináptica potencial. Observe esse potencial de ação como uma pequena espigueta na resposta de tensão.

Defina a frequência de estimulação para 0,1 hertz para evitar o esgotamento da resposta pós-sináptica. Se o neurônio pós-sináptico não responder à estimulação do adesivo de neurônio potencialmente pré-sináptico testado, um novo neurônio pré-sináptico potencial em modo de vedação solta. Teste até 30 neurônios potencialmente pré-sinápticos dessa maneira.

Continuando a usar o mesmo eletrodo de busca, desde que uma vedação com resistência superior a 30 mega ohm possa ser estabelecida. Se a estimulação no modo de vedação solta resultar em um EPSP ou IPSP com uma latência inferior a cinco milissegundos no neurônio pós-sináptico, remova a pipeta de busca do neurônio pré-sináptico usando um eletrodo de registro cheio de biotina contendo solução interna regular com uma resistência de quatro a oito mega ohm. Corrija o neurônio pré-sináptico e registre no modo de pinça de corrente de célula inteira.

Elimine potenciais de ação por injeção de corrente nos neurônios pré-sinápticos e registre a resposta pós-sináptica. Armazene os dados em um computador para posterior análise offline. Ao longo da gravação, a biotina se difunde no neurônio para obter uma coloração adequada.

Deixe a biotina se difundir por pelo menos 15 a 30 minutos, dependendo do tamanho do neurônio. Para microcircuitos neuronais com alta taxa de conectividade, um eletrodo de busca não é usado. Em vez disso, comece corrigindo diretamente um neurônio pré-sináptico no modo de célula inteira.

Em seguida, usando um eletrodo de remendo preenchido com solução interna regular de um potencial neurônio pós-sináptico também no modo de célula inteira, ambas as células devem estar sob controle de pinça de corrente. Elimine um potencial de ação na célula pré-sináptica e monitore o neurônio pós-sináptico em potencial para um potencial pós-sináptico. Se o neurônio não mostrar uma resposta à estimulação pré-sináptica, use um novo eletrodo para remendar um novo neurônio novamente no modo de célula inteira.

Quando uma conexão for encontrada, prossiga com a gravação conforme demonstrado anteriormente, sem alterar a pipeta de conexão. Depois de fixar e montar as fatias conforme descrito no protocolo de texto, examine os neurônios marcados com biotina sob um microscópio óptico. Certifique-se de que os bastões axonais e as espinhas dendríticas estejam claramente visíveis.

Usando um sistema comercial de rastreamento de neurônios, rastreie manualmente os neurônios ou pares de neurônios sinapticamente acoplados. Certifique-se de incluir até mesmo pequenas colaterais axonais ou dendríticas. Use os traços para obter reconstruções neuronais 3D, corrija as reconstruções neuronais para encolhimento em todas as três dimensões espaciais na seção apropriada do programa de rastreamento.

Os fatores de correção de encolhimento para o meio de incorporação são aproximadamente 1,1 para as direções x e y e aproximadamente 2,1 para a direção Z. Um par de células acoplado reciprocamente composto por um estrelado espinhoso e um rápido pico no neurônio. Na camada cortical, quatro foram preenchidos com biotina.

Durante a gravação, os pontos verdes indicam supostos contatos sinápticos excitatórios entre o neurônio espinhoso pré-sináptico e o interneurônio inter-sináptico pós-sináptico. Os pontos azuis indicam supostos contatos sinápticos inibitórios recíprocos. Imagens de alta potência dos contatos sinápticos são mostradas aqui.

Os círculos abertos verdes mostram contatos excitatórios e os círculos abertos azuis mostram contatos inibitórios. Uma reconstrução neurolúcida desse par de células reciprocamente conectadas é mostrada aqui. O axônio interneurônio é mostrado em azul e seu soma e dendrito são mostrados em vermelho.

O axônio dos neurônios espinhosos é mostrado em verde e seu soma e dite estão em branco. A inserção mostra os compartimentos dendríticos somato dos neurônios pré e pós-sinápticos. Juntamente com os supostos contatos sinápticos, os contornos do barril foram identificados nas micrografias fotográficas de campo claro de baixa potência feitas a partir da fatia aguda do cérebro.

Uma conexão sináptica representativa com uma taxa de conectividade muito baixa é mostrada aqui. Um potencial de ação pré-sináptico em uma célula parametálica da camada seis evocou um potencial pós-sináptico excitatório monossináptico em um neurônio parametálico da camada quatro estrelas. A latência mostrada aqui de mais de três milissegundos dessa conexão translaminar é muito maior do que a latência de aproximadamente um milissegundo observada em conexões intralaminares locais.

Dois potenciais de ação a 10 hertz provocados na célula parametálica da camada seis desencadearam potenciais pós-sinápticos no neurônio parametálico estrela da camada quatro mostrado aqui. Observe a facilitação de curto prazo. É importante lembrar que a condição de corte precisa ser otimizada para uma determinada conexão sináptica e que, durante a gravação, a configuração precisa ser absolutamente estável e, em seguida, a compreensão ideal da gravação é garantida.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como as medições eletrofisiológicas e as reconstruções morfológicas são usadas para obter uma visão geral das propriedades estruturais e funcionais dos microcircuitos neuronais no neocórtex.