Name: Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a caracterizar conexões sinápticas entre neurônios identificados morfologicamente usando fatias agudas de cérebro e gravações emparelhadas de patch-clamp. Este método correlaciona propriedades estruturais e funcionais de microcircuitos neurais.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Grupo 'Função dos Microcircuitos Neuronais' do Instituto de Neurociência e Medicina, INM-2, Centro de Pesquisa Jülich e do Grupo 'Função dos Microcircuitos Corticais' do Departamento de Psiquiatria, Psicoterapia e Psicossomática, Faculdade de Medicina, JARA, Universidade RWTH Aachen pelas discussões frutíferas. Este trabalho foi apoiado pelo grupo de pesquisa DFG sobre a função do córtex do barril (BaCoFun).

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Gravações pares de excitatório sinapticamente acoplados e / ou os neurónios inibitórios são uma abordagem muito versátil para o estudo de microcircuitos neuronais. Não só esta abordagem permitem estimar conectividade sináptica entre os tipos de neurônios, mas também permite determinar as características funcionais da conexão e da morfologia dos neurônios pré e pós-sinápticos. Além disso, agonista e / ou antagonista pode ser facilmente aplicado aos neurónios em preparações de fatias. Isto permite estudar os efeitos da ne...

Microcircuitos neuronais entre dois neurônios synaptically acoplados são os blocos de construção de redes de grande escala no cérebro e são as unidades fundamentais do processamento de informações sináptica. Um pré-requisito para a caracterização de tais microcircuitos neuronais é conhecer a morfologia e as propriedades funcionais de ambos os neurónios parceiros pré e pós-sinápticos, o tipo de conexão sináptica (s) e a sua estrutura e mecanismo funcional. No entanto, em muitos estudos de ligações sinápticas, pelo menos, um dos neurónios em um microcircuito não está bem caracterizada. Isto resulta a partir dos protocolos de estimulação relativamente não específicos, muitas vezes utilizados em estudos de conectividade sináptica. Portanto, as propriedades estruturais e funcionais do neurónio pré-sináptico quer não são identificadas em todos ou apenas a um pequeno grau (ou seja, a expressão de proteínas marcadoras etc.). Gravações emparelhados em combinação com coloração intracelular por marcadores such como biocitina, neurobiotin ou corantes fluorescentes são mais adequados para o estudo de pequenas microcircuitos neuronais. Esta técnica permite investigar muitos parâmetros estruturais e funcionais de uma conexão sináptica identificadas morfologicamente, ao mesmo tempo. Os chamados conexões monosinápticos «unitária» entre dois neurônios têm sido investigados em ambas as regiões cerebrais corticais e subcorticais 10/01 usando preparações fatia agudas. Inicialmente, microeléctrodos afiados foram usadas nestas experiências; mais tarde, a gravação de patch clamp foi utilizada a fim de obter gravações de sinais sinápticos com um nível de ruído mais baixo e uma resolução temporal melhorada. Um avanço técnico significativo foi o uso de diferencial de infravermelho interferência contraste (IR-DIC) óptica 11-14, uma técnica microscópica que melhorou significativamente a visibilidade e identificação de neurônios na fatia do cérebro, de modo que se tornou possível to de obter gravações de visualmente identificados conexões sinápticas 15-17. Em geral, as gravações emparelhados são feitas em preparações de fatias agudas; só muito poucas publicações são gravações de relatórios disponíveis de neurônios conectados synaptically in vivo 18-20. A vantagem mais importante das gravações emparelhados é o facto de que uma caracterização funcional pode ser combinada com uma análise morfológica, tanto a luz e electrões nível microscópico (ver por ex., 7,16,21). Após o processamento histoquímica, a morfologia dendrítica e axonal do par neurônio synaptically conectado é rastreado. Subsequentemente, é possível quantificar características morfológicas, tais como comprimento, densidade espacial, orientação, padrão de ramificação, etc. Estes parâmetros podem então proporcionar uma base para a classificação objectiva de uma conexão sináptica específico. Além disso, em contraste com a maioria das outras técnicas utilizadas para estudar connecti neuronaisvidade, emparelhado gravações também permitir a identificação dos contatos sinápticos para conexões sinápticas unitários. Isso pode ser feito diretamente, usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica 16,21-27 ou usando imagens de cálcio 28,29 das espinhas dendríticas. No entanto, com esta última abordagem só excitatório, mas não conexões inibidoras pode ser estudada como requer o influxo de cálcio através dos canais dos receptores pós-sinápticos. Além de uma análise detalhada da transmissão sináptica em um microcircuito emparelhado gravações neuronais definidas também permitem o estudo das regras de plasticidade sináptica 30,31 ou - em combinação com a aplicação de agonista / antagonista - a modulação da transmissão sináptica por neurotransmissores tais como acetilcolina e 32 adenosina 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triplo</td><td>com 2 - 3 pré-amplificadores</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>com 2 portas de câmera, uma objetiva de 4X e uma objetiva de imersão em água de 40X</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>câmera CCD infravermelha</td></tr><tr><td>Estação de trabalho</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>com uma platina x-y motorizada e um eixo de foco motorizado para o microscópio</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z para 2 - 3 pré-amplificadores</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibração</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microtome Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>com softwares Neurolucida e Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

eletrofisiológica e caracterização morfológica de neuronal microcircuits em aguda fatias do cérebro do usando emparelhados patch-clamp recordings

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

A combinação de gravações de patch clamp de dois (ou mais) neurónios sinapticamente acoplados (gravações emparelhados), em preparações de fatias cerebrais agudos com simultânea enchimento biocitina intracelular permite uma análise correlacionada das suas propriedades estruturais e funcionais. Com este método, é possível identificar e caracterizar os neurônios pré e pós-sinápticos pela sua morfologia e padrão de resposta eletrofisiológica. Gravações emparelhadas permitem estudar os padrões de conectividade entre estes neurónios, bem como as propriedades de ambos transmissão sináptica química e eléctrica. Aqui, vamos dar uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para obter gravações emparelhados confiáveis, juntamente com uma ótima recuperação da morfologia neurônio. Vamos descrever como pares de neurônios conectados via sinapses químicas ou junções comunicantes são identificados em preparações fatia cérebro. Vamos delinear como os neurônios são reconstruídos para obter sua morfologia 3D da Dendritic e domínio axonal e como contatos sinápticos são identificadas e localizadas. Também vamos discutir as ressalvas e limitações da técnica de gravação emparelhado, em especial os associados truncations dendríticas e axonais durante a preparação de fatias do cérebro, porque estes afetam fortemente as estimativas de conectividade. No entanto, devido à versatilidade da abordagem gravação emparelhado irá permanecer um instrumento valioso na caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.

Gravações emparelhados são o método de escolha para uma caracterização detalhada das conexões sinápticas uni ou bidirecionais morfologicamente identificadas, bem como a junção da diferença conexões (elétricas) (Figura 1). Um exemplo de uma gravação emparelhado na camada 4 do córtex somatossensorial tambor é mostrado na Figura 1A. Ambos excitatório unidireccional e conexões sinápticas inibidoras pode ser caracterizado (Figura 1B, C). Além disso gravações emparelhadas per...

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar como as conexões sinápticas entre neurônios morfologicamente identificados são caracterizadas funcional e estruturalmente. Isso é conseguido através da obtenção de fatias cerebrais agudas, que são otimizadas para estudar uma conexão sináptica específica. O patch clamping é então usado para testar neurônios sinapticamente acoplados.Para isso, um neurônio pós-sináptico prospectivo individual é corrigido e uma segunda pipeta é usada para estimular os neurônios circundantes, a fim de estabelecer a existência de uma conexão sináptica. Se nenhuma resposta for observada, o eletrodo estimulante é movido. Uma vez que uma conexão é encontrada, o neurônio pré-sináptico é recombinado no modo atacado.Após registros eletrofisiológicos desses neurônios e preenchimentos simultâneos de biotina, a fatia é fixada, processada para biotina e reconstruções 3D assistidas por computador dos neurônios são realizadas. Em última análise, nosso método visa uma análise estrutural e funcional quantitativa correlacionada de microcircuitos neuronais. A principal vantagem das gravações pareadas de neurônios sinapticamente acoplados é que podemos realizar uma análise estrutural e funcional correlacionada de neurônios pré e pós-sinápticos em microcircuitos neuronais.Ainda mais recentemente, técnicas introduzidas, como a estimulação óptica de neurônios, até agora não são capazes de conseguir isso com tantos detalhes. Este método permite o estudo das interações de excitação e inibição de tipos de neurônios morfologicamente identificados e como a atividade é modulada. Demonstrando os procedimentos para gravações de animais de estimação será Guan.Ele que é pós-doutorando no meu laboratório. Depois de preparar as fatias da região alvo, deixe-as incubar durante esse tempo, puxe as pipetas de remendo, que devem ter uma haste longa e fina. Depois de prender uma fatia de cérebro com uma harpa de platina em uma câmara experimental, encha uma pipeta de gravação com solução interna.Coloque a pipeta no pré-amplificador e tampe um suposto neurônio pós-sináptico no modo de célula inteira usando uma pipeta de busca de oito a 10 mega ohm de resistência preenchida com uma solução interna na qual os sais de potássio são substituídos por sais de sódio. Aplique sucção suave na pipeta de busca para remendar um potencial neurônio pré-sináptico em uma célula solta. Configuração anexada.Mantenha o potencial da membrana sob a vedação solta entre 30 e 60 milivolts negativos no modo de grampo de corrente. Em seguida, aplique grandes pulsos de corrente de 0,2 a dois nano amperes para provocar um potencial de ação na célula pré-sináptica potencial. Observe esse potencial de ação como uma pequena espigueta na resposta de tensão.Defina a frequência de estimulação para 0,1 hertz para evitar o esgotamento da resposta pós-sináptica. Se o neurônio pós-sináptico não responder à estimulação do adesivo de neurônio potencialmente pré-sináptico testado, um novo neurônio pré-sináptico potencial em modo de vedação solta. Teste até 30 neurônios potencialmente pré-sinápticos dessa maneira.Continuando a usar o mesmo eletrodo de busca, desde que uma vedação com resistência superior a 30 mega ohm possa ser estabelecida. Se a estimulação no modo de vedação solta resultar em um EPSP ou IPSP com uma latência inferior a cinco milissegundos no neurônio pós-sináptico, remova a pipeta de busca do neurônio pré-sináptico usando um eletrodo de registro cheio de biotina contendo solução interna regular com uma resistência de quatro a oito mega ohm. Corrija o neurônio pré-sináptico e registre no modo de pinça de corrente de célula inteira.Elimine potenciais de ação por injeção de corrente nos neurônios pré-sinápticos e registre a resposta pós-sináptica. Armazene os dados em um computador para posterior análise offline. Ao longo da gravação, a biotina se difunde no neurônio para obter uma coloração adequada.Deixe a biotina se difundir por pelo menos 15 a 30 minutos, dependendo do tamanho do neurônio. Para microcircuitos neuronais com alta taxa de conectividade, um eletrodo de busca não é usado. Em vez disso, comece corrigindo diretamente um neurônio pré-sináptico no modo de célula inteira.Em seguida, usando um eletrodo de remendo preenchido com solução interna regular de um potencial neurônio pós-sináptico também no modo de célula inteira, ambas as células devem estar sob controle de pinça de corrente. Elimine um potencial de ação na célula pré-sináptica e monitore o neurônio pós-sináptico em potencial para um potencial pós-sináptico. Se o neurônio não mostrar uma resposta à estimulação pré-sináptica, use um novo eletrodo para remendar um novo neurônio novamente no modo de célula inteira.Quando uma conexão for encontrada, prossiga com a gravação conforme demonstrado anteriormente, sem alterar a pipeta de conexão. Depois de fixar e montar as fatias conforme descrito no protocolo de texto, examine os neurônios marcados com biotina sob um microscópio óptico. Certifique-se de que os bastões axonais e as espinhas dendríticas estejam claramente visíveis.Usando um sistema comercial de rastreamento de neurônios, rastreie manualmente os neurônios ou pares de neurônios sinapticamente acoplados. Certifique-se de incluir até mesmo pequenas colaterais axonais ou dendríticas. Use os traços para obter reconstruções neuronais 3D, corrija as reconstruções neuronais para encolhimento em todas as três dimensões espaciais na seção apropriada do programa de rastreamento.Os fatores de correção de encolhimento para o meio de incorporação são aproximadamente 1,1 para as direções x e y e aproximadamente 2,1 para a direção Z. Um par de células acoplado reciprocamente composto por um estrelado espinhoso e um rápido pico no neurônio. Na camada cortical, quatro foram preenchidos com biotina.Durante a gravação, os pontos verdes indicam supostos contatos sinápticos excitatórios entre o neurônio espinhoso pré-sináptico e o interneurônio inter-sináptico pós-sináptico. Os pontos azuis indicam supostos contatos sinápticos inibitórios recíprocos. Imagens de alta potência dos contatos sinápticos são mostradas aqui.Os círculos abertos verdes mostram contatos excitatórios e os círculos abertos azuis mostram contatos inibitórios. Uma reconstrução neurolúcida desse par de células reciprocamente conectadas é mostrada aqui. O axônio interneurônio é mostrado em azul e seu soma e dendrito são mostrados em vermelho.O axônio dos neurônios espinhosos é mostrado em verde e seu soma e dite estão em branco. A inserção mostra os compartimentos dendríticos somato dos neurônios pré e pós-sinápticos. Juntamente com os supostos contatos sinápticos, os contornos do barril foram identificados nas micrografias fotográficas de campo claro de baixa potência feitas a partir da fatia aguda do cérebro.Uma conexão sináptica representativa com uma taxa de conectividade muito baixa é mostrada aqui. Um potencial de ação pré-sináptico em uma célula parametálica da camada seis evocou um potencial pós-sináptico excitatório monossináptico em um neurônio parametálico da camada quatro estrelas. A latência mostrada aqui de mais de três milissegundos dessa conexão translaminar é muito maior do que a latência de aproximadamente um milissegundo observada em conexões intralaminares locais.Dois potenciais de ação a 10 hertz provocados na célula parametálica da camada seis desencadearam potenciais pós-sinápticos no neurônio parametálico estrela da camada quatro mostrado aqui. Observe a facilitação de curto prazo. É importante lembrar que a condição de corte precisa ser otimizada para uma determinada conexão sináptica e que, durante a gravação, a configuração precisa ser absolutamente estável e, em seguida, a compreensão ideal da gravação é garantida.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como as medições eletrofisiológicas e as reconstruções morfológicas são usadas para obter uma visão geral das propriedades estruturais e funcionais dos microcircuitos neuronais no neocórtex.

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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