Name: Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a caracterizar conexões sinápticas entre neurônios identificados morfologicamente usando fatias agudas de cérebro e gravações emparelhadas de patch-clamp. Este método correlaciona propriedades estruturais e funcionais de microcircuitos neurais.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Grupo 'Função dos Microcircuitos Neuronais' do Instituto de Neurociência e Medicina, INM-2, Centro de Pesquisa Jülich e do Grupo 'Função dos Microcircuitos Corticais' do Departamento de Psiquiatria, Psicoterapia e Psicossomática, Faculdade de Medicina, JARA, Universidade RWTH Aachen pelas discussões frutíferas. Este trabalho foi apoiado pelo grupo de pesquisa DFG sobre a função do córtex do barril (BaCoFun).

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Gravações pares de excitatório sinapticamente acoplados e / ou os neurónios inibitórios são uma abordagem muito versátil para o estudo de microcircuitos neuronais. Não só esta abordagem permitem estimar conectividade sináptica entre os tipos de neurônios, mas também permite determinar as características funcionais da conexão e da morfologia dos neurônios pré e pós-sinápticos. Além disso, agonista e / ou antagonista pode ser facilmente aplicado aos neurónios em preparações de fatias. Isto permite estudar os efeitos da ne...

Microcircuitos neuronais entre dois neurônios synaptically acoplados são os blocos de construção de redes de grande escala no cérebro e são as unidades fundamentais do processamento de informações sináptica. Um pré-requisito para a caracterização de tais microcircuitos neuronais é conhecer a morfologia e as propriedades funcionais de ambos os neurónios parceiros pré e pós-sinápticos, o tipo de conexão sináptica (s) e a sua estrutura e mecanismo funcional. No entanto, em muitos estudos de ligações sinápticas, pelo menos, um dos neurónios em um microcircuito não está bem caracterizada. Isto resulta a partir dos protocolos de estimulação relativamente não específicos, muitas vezes utilizados em estudos de conectividade sináptica. Portanto, as propriedades estruturais e funcionais do neurónio pré-sináptico quer não são identificadas em todos ou apenas a um pequeno grau (ou seja, a expressão de proteínas marcadoras etc.). Gravações emparelhados em combinação com coloração intracelular por marcadores such como biocitina, neurobiotin ou corantes fluorescentes são mais adequados para o estudo de pequenas microcircuitos neuronais. Esta técnica permite investigar muitos parâmetros estruturais e funcionais de uma conexão sináptica identificadas morfologicamente, ao mesmo tempo. Os chamados conexões monosinápticos «unitária» entre dois neurônios têm sido investigados em ambas as regiões cerebrais corticais e subcorticais 10/01 usando preparações fatia agudas. Inicialmente, microeléctrodos afiados foram usadas nestas experiências; mais tarde, a gravação de patch clamp foi utilizada a fim de obter gravações de sinais sinápticos com um nível de ruído mais baixo e uma resolução temporal melhorada. Um avanço técnico significativo foi o uso de diferencial de infravermelho interferência contraste (IR-DIC) óptica 11-14, uma técnica microscópica que melhorou significativamente a visibilidade e identificação de neurônios na fatia do cérebro, de modo que se tornou possível to de obter gravações de visualmente identificados conexões sinápticas 15-17. Em geral, as gravações emparelhados são feitas em preparações de fatias agudas; só muito poucas publicações são gravações de relatórios disponíveis de neurônios conectados synaptically in vivo 18-20. A vantagem mais importante das gravações emparelhados é o facto de que uma caracterização funcional pode ser combinada com uma análise morfológica, tanto a luz e electrões nível microscópico (ver por ex., 7,16,21). Após o processamento histoquímica, a morfologia dendrítica e axonal do par neurônio synaptically conectado é rastreado. Subsequentemente, é possível quantificar características morfológicas, tais como comprimento, densidade espacial, orientação, padrão de ramificação, etc. Estes parâmetros podem então proporcionar uma base para a classificação objectiva de uma conexão sináptica específico. Além disso, em contraste com a maioria das outras técnicas utilizadas para estudar connecti neuronaisvidade, emparelhado gravações também permitir a identificação dos contatos sinápticos para conexões sinápticas unitários. Isso pode ser feito diretamente, usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica 16,21-27 ou usando imagens de cálcio 28,29 das espinhas dendríticas. No entanto, com esta última abordagem só excitatório, mas não conexões inibidoras pode ser estudada como requer o influxo de cálcio através dos canais dos receptores pós-sinápticos. Além de uma análise detalhada da transmissão sináptica em um microcircuito emparelhado gravações neuronais definidas também permitem o estudo das regras de plasticidade sináptica 30,31 ou - em combinação com a aplicação de agonista / antagonista - a modulação da transmissão sináptica por neurotransmissores tais como acetilcolina e 32 adenosina 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triplo</td><td>com 2 - 3 pré-amplificadores</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>com 2 portas de câmera, uma objetiva de 4X e uma objetiva de imersão em água de 40X</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>câmera CCD infravermelha</td></tr><tr><td>Estação de trabalho</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>com uma platina x-y motorizada e um eixo de foco motorizado para o microscópio</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z para 2 - 3 pré-amplificadores</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibração</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microtome Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>com softwares Neurolucida e Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

eletrofisiológica e caracterização morfológica de neuronal microcircuits em aguda fatias do cérebro do usando emparelhados patch-clamp recordings

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

A combinação de gravações de patch clamp de dois (ou mais) neurónios sinapticamente acoplados (gravações emparelhados), em preparações de fatias cerebrais agudos com simultânea enchimento biocitina intracelular permite uma análise correlacionada das suas propriedades estruturais e funcionais. Com este método, é possível identificar e caracterizar os neurônios pré e pós-sinápticos pela sua morfologia e padrão de resposta eletrofisiológica. Gravações emparelhadas permitem estudar os padrões de conectividade entre estes neurónios, bem como as propriedades de ambos transmissão sináptica química e eléctrica. Aqui, vamos dar uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para obter gravações emparelhados confiáveis, juntamente com uma ótima recuperação da morfologia neurônio. Vamos descrever como pares de neurônios conectados via sinapses químicas ou junções comunicantes são identificados em preparações fatia cérebro. Vamos delinear como os neurônios são reconstruídos para obter sua morfologia 3D da Dendritic e domínio axonal e como contatos sinápticos são identificadas e localizadas. Também vamos discutir as ressalvas e limitações da técnica de gravação emparelhado, em especial os associados truncations dendríticas e axonais durante a preparação de fatias do cérebro, porque estes afetam fortemente as estimativas de conectividade. No entanto, devido à versatilidade da abordagem gravação emparelhado irá permanecer um instrumento valioso na caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.

Gravações emparelhados são o método de escolha para uma caracterização detalhada das conexões sinápticas uni ou bidirecionais morfologicamente identificadas, bem como a junção da diferença conexões (elétricas) (Figura 1). Um exemplo de uma gravação emparelhado na camada 4 do córtex somatossensorial tambor é mostrado na Figura 1A. Ambos excitatório unidireccional e conexões sinápticas inibidoras pode ser caracterizado (Figura 1B, C). Além disso gravações emparelhadas per...

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar como as conexões sinápticas entre neurônios morfologicamente identificados são caracterizadas funcional e estruturalmente. Isso é conseguido através da obtenção de fatias cerebrais agudas, que são otimizadas para estudar uma conexão sináptica específica. O patch clamping é então usado para testar neurônios sinapticamente acoplados.Para isso, um neurônio pós-sináptico prospectivo individual é corrigido e uma segunda pipeta é usada para estimular os neurônios circundantes, a fim de estabelecer a existência de uma conexão sináptica. Se nenhuma resposta for observada, o eletrodo estimulante é movido. Uma vez que uma conexão é encontrada, o neurônio pré-sináptico é recombinado no modo atacado.Após registros eletrofisiológicos desses neurônios e preenchimentos simultâneos de biotina, a fatia é fixada, processada para biotina e reconstruções 3D assistidas por computador dos neurônios são realizadas. Em última análise, nosso método visa uma análise estrutural e funcional quantitativa correlacionada de microcircuitos neuronais. A principal vantagem das gravações pareadas de neurônios sinapticamente acoplados é que podemos realizar uma an

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma abordagem multi-facetada para investigar alterações funcionais para circuitos do hipocampo é explicado. Técnicas electrofisiológicas são descritos em conjunto com o protocolo de lesão, testes comportamentais e método de dissecação regional. A combinação destas técnicas pode ser aplicada de forma semelhante para outras regiões do cérebro e perguntas científicas.

Investigações sobre alterações da função Circuito Hippocampal Após lesão cerebral traumática leve

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Este vídeo demonstra o procedimento para mapear conexões sinápticas protegendo uma fatia de cérebro, posicionando pipetas para obter configurações de células inteiras e estimulando neurônios pré-sinápticos a registrar respostas pós-sinápticas, elucidando assim a conectividade neuronal.

Registro de grampo de patch emparelhado das conexões neuronais em fatias cerebrais agudas

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Os protocolos de circuito fechado estão se tornando cada vez mais difundidos na eletrofisiologia moderna. Apresentamos uma maneira simples, versátil e barata de realizar protocolos eletrofisiológicos complexos em neurônios piramidais corticais in vitro, usando um computador desktop e uma placa de aquisição digital.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Aprenda a caracterizar conexões sinápticas entre neurônios identificados morfologicamente usando fatias agudas de cérebro e gravações emparelhadas de patch-clamp. Este método correlaciona propriedades estruturais e funcionais de microcircuitos neurais.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings (Vídeo) | JoVE Journal

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

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