A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl ^- Canais e Transportadores

O objetivo geral deste procedimento é determinar quantitativamente a atividade de transporte de canais ou transportadores de cloreto reconstituídos. Isso é feito primeiro reconstituindo o transportador purificado puro em lipossomas em baixa densidade, de modo que cada lipossomo contenha zero ou uma cópia do complexo ativo após a remoção dos íons cloreto externos, de modo que haja um gradiente iônico direcionado para fora, os lipossomas são adicionados à câmara de registro onde a concentração de cloreto é monitorada usando um eletrodo sensível ao cloreto. Em seguida, o flx de cloreto dos lipossomas é iniciado pela adição de Val Mycin, um ionóforo de potássio, que aumenta o potencial de membrana.

Uma vez que o sinal atinge o estado estacionário, o experimento é encerrado pela adição de detergente para dissolver os lipossomas. Em última análise, medindo a taxa de efluxo de cloreto dos lipossomas de protea, reconstituídos com um canal ou transportador purificado, é possível determinar quantitativamente a taxa de transporte unitário e a estequiometria do complexo proteico ativo. A principal vantagem desta técnica sobre outras abordagens existentes, como medições de fluxo baseadas em fluorescência, é que, com esta técnica, é possível determinar quantitativamente os principais parâmetros do transportador reconstituído, como a taxa de renovação unitária e a geometria do complexo.

Além de fornecer medidas quantitativas desses parâmetros-chave, esse método pode ser usado para determinar com rapidez e precisão o efeito de pequenas moléculas de mutação e monitorar subunidades na proteína de transferência reconstituída. A configuração de gravação consiste em duas câmaras, um eletrodo de cloreto, um medidor de pH com saída elétrica analógica ou digital, um digitalizador e um computador com software de aquisição apropriado. Conecte o eletrodo de cloreto ao medidor de pH e, em seguida, conecte a saída do medidor de pH ao digitalizador, que está conectado ao computador.

Coloque o eletrodo de referência em uma câmara e o fio de recodificação na outra. Em seguida, coloque as câmaras em uma placa de agitação com a barra de agitação na câmara de gravação. Certifique-se de que a barra de agitação não toque no eletrodo.

Conecte as câmaras usando uma ponte de ágar na noite anterior aos experimentos, inche um grama de contas de cidex G 50 em 15 mililitros de tampão externo com agitação suave por pelo menos três horas em temperatura ambiente antes do uso. Cada experimento requer aproximadamente três mililitros de grânulos inchados enquanto os lipossomas estão descongelando à temperatura ambiente. Despeje aproximadamente três mililitros de contas G 50 inchadas em cada coluna.

Deixe-os secar por gravidade. Fluxo à temperatura ambiente. Isso geralmente leva de um a dois minutos.

Em seguida, prepare as vesículas ulares extrudando os lipossomas de protea 11 vezes através de uma mini extrusora usando um corte de Teflon de 0,4 mícron. Em seguida, coloque a coluna em uma centrífuga de tubo de fundo redondo de plástico por 20 a 30 segundos a 1400 G em uma centrífuga clínica para remover o excesso de solução. Depois disso, guardando o fluxo, coloque a coluna em um tubo de vidro de 13 por 100 milímetros e adicione 100 microlitros das vesículas extrudadas à coluna.

Gire a coluna por um minuto a 500 G.In uma centrífuga clínica, colete aproximadamente 200 microlitros do fluxo através do qual será adicionado à câmara de registro. Para realizar a medição do efluxo, coloque dois mililitros de cloreto de potássio 100 milimolar na câmara de referência e 1,8 mililitros do tampão externo na câmara de registro. Inicie o programa de aquisição.

Deixe a linha de base se equilibrar. Isso pode levar alguns minutos. Quando o sinal atingir uma linha de base estável, comece a gravar.

Adicione 15 microlitros de uma solução de cloreto de potássio molar bronzeado para calibrar o sistema. Em seguida, adicione lipossomas. Um pequeno salto pode ser visível devido à remoção incompleta de cloreto externo dos lipossomas da protea.

Aguarde até que a linha de base se estabilize. Em seguida, adicione CIN para iniciar flx. Deixe o FLX seguir seu curso de tempo até que ele se estabilize.

Neste ponto, adicione 40 microlitros de glicocida beta Octa 1,5 molar preparado no tampão externo para dissolver todos os lipossomas. Em seguida, aguarde de 10 a 15 segundos. Finalize a gravação e prossiga para a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.

Quando os lipossomas contendo alto cloreto interno são imersos em baixo cloreto, produzindo um gradiente de cloreto de 300 vezes, nenhum fluxo líquido de íons é observado. Isso ocorre porque os lipossomas livres de proteínas têm baixa permeabilidade intrínseca aos íons. Nenhum FLX macroscópico é observado a partir de lipossomas prot reconstituídos com o transportador de cloreto acoplado a prótons, C-L-C-E-C um.

Como a pequena quantidade de cloreto que sai do vesco acumula uma carga líquida positiva no lipossoma, a adição de CIN permite que os íons de potássio se movam através da membrana, aliviando o potencial elétrico e iniciando o cloreto. A reação é encerrada e a quantidade total de íons cloreto contidos nas vesículas é medida para determinar as propriedades das proteínas reconstituídas individuais. Os dados brutos do curso do tempo de efluxo são primeiro convertidos de milivolts para uma concentração de cloreto e, em seguida, normalizados e o curso do tempo é então ajustado.

Determinou-se que a constante de tempo do efluxo é de 41 segundos e a fração de lipossomas contendo zero cópias ativas de C-L-C-E-C um é o ponto 31, indicando que aproximadamente um terço dos lipossomas contém zero proteínas ativas a partir desses valores e medindo o teor de cloreto de vesículas contendo pelo menos uma cópia de C-L-C-E-C um, é possível determinar uma taxa de transporte unitário de C-L-C-E-C igual a aproximadamente 2.500 íons cloreto por segundo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a necessidade de rotatividade de um transportador. Esses experimentos podem ser realizados em 10 a 15 minutos quando realizados com cuidado.

É fundamental avaliar cuidadosamente a qualidade dos lipossomas, pois os vazamentos afetam negativamente as estimativas da taxa de rotatividade.