Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

O objetivo geral do experimento a seguir é modelar o ciclo de vida do vírus Ebola altamente patogênico em condições de nível de biossegurança dois. Isso é alcançado pela produção de partículas semelhantes ao vírus, que possuem a mesma composição proteica das partículas do vírus Ebola, mas carregam um mini genoma em vez do genoma viral. Um mini genoma é uma versão miniaturizada do genoma viral na qual os genes virais foram removidos e substituídos por um gene repórter, como a luciferase.

É importante destacar que o minigenoma utilizado para este experimento ainda carrega uma série de genes virais, que codificam as proteínas virais VP40, GP-um dois e VP24. Partículas semelhantes a vírus são produzidas pela expressão de um minigenoma em células 293T, chamadas células produtoras, juntamente com as proteínas virais np, VP35, VP30 e L, que em conjunto também são denominadas proteínas RNP.

O mini genoma é então replicado e transcrito em RNAs mensageiros pelas proteínas virais. Os RNAs mensageiros codificam o repórter Luciferase e as proteínas virais adicionais VP40, GP-um dois e VP24. Juntas, essas três proteínas levam à produção de partículas semelhantes a vírus, denominadas partículas semelhantes a vírus competentes para transcrição e replicação ou TRVLPs, já que os nucleocapsídeos nelas presentes são capazes de realizar replicação e transcrição do genoma. Como as TLPs carregam a glicoproteína do vírus Ebola GP-um dois, elas são capazes de infectar células-alvo.

Essas células-alvo foram previamente transfectadas com plasmídeo de expressão para np, VP35, VP30 e L. Juntas, essas proteínas do RNP reconhecem o mini genoma que foi introduzido nas células-alvo dentro dos TRVLPs. O mini genoma é então replicado e transcrito, levando à atividade do repórter, bem como à produção de novos TRVLPs, que podem novamente ser utilizados para infectar novas células-alvo.

É importante destacar que o minigenoma não carrega a informação genética necessária para sua própria replicação. Portanto, os TRVLPs não conseguem infectar produtivamente células que não expressem as quatro proteínas do RNP. Isso torna o sistema seguro para ser utilizado sob condições de nível de biossegurança dois.

A principal vantagem deste método é que ele nos permite modelar todo o ciclo de vida do vírus, incluindo a replicação do genoma, a expressão dos produtos gênicos virais, a produção de partículas virais e a infecção de células-alvo ao longo de múltiplos ciclos de infecção sob condições de nível de biossegurança dois. Isso significa que este trabalho pode ser realizado sem um laboratório de contenção máxima, que seria necessário para trabalhos com vírus Ebola vivos. Este método pode ser combinado com outras técnicas, como a diminuição mediada por RNA de fatores celulares ou a superexpressão desses fatores, para estudar o papel desses fatores na biologia viral. Além disso, podemos introduzir mutações nos genes virais para estudar o papel desses genes virais e de seus produtos na biologia do vírus.

Divida as células removendo o meio de células 293T com 80 a 90% de confluência, lavando-as duas vezes com PBS e adicionando dois mililitros de tripsina às células. Aguarde até que as células se arredondem.

Em seguida, desprenda-as batendo no frasco e adicionando oito mL de meio com 10% de FBS às células. Conte as células utilizando um contador automático de células, depois dilua as células até duas vezes 10 à quinta células por mililitro e semeie dois mL em cada poço de uma placa de seis poços. Retorne as células a um incubador úmido a 37 graus com 5% de CO2. Após 24 horas, transfecte as células com os plasmídeos necessários para a produção de TRVLPs. Em uma cabine de segurança biológica, pipete o DNA para um tubo utilizando ponteiras com filtro. Como controle negativo em um poço, o plasmídeo que codifica a polimerase viral L deve ser omitido; em vez disso, pode-se transfectar um plasmídeo que codifica GFP para visualizar a eficácia da transfeção. Em seguida, adicione 100 microlitros de Opti-MEM por poço ao DNA. Vortexe o tubo e centrifugue-o brevemente.

Em seguida, adicione 7,5 microlitros do reagente de transfeção transIT LT-one ao DNA diluído. Vortexe suavemente o tubo e incube-o à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, misture suavemente a mistura de transfeção pipetando para cima e para baixo, depois adicione 100 microlitros a cada poço de uma placa de seis poços, gota a gota.

Depois de adicionar os complexos de transfeção às células, balance o recipiente para frente e para trás e de um lado para o outro. Não gire o recipiente, pois isso resultará em uma transfeção desigual. Após esse procedimento, retorne as células ao incubador. Vinte e quatro horas após a transfeção, remova o sobrenadante das células. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio com 5% de FBS às células e retorne-as ao incubador.

24 horas após a transfeção das células produtoras, divida as células 293T conforme descrito anteriormente. 24 horas após a divisão, transfecte-as com os plasmídeos que codificam as proteínas RNP do vírus Ebola, bem como Tim-one, que atua como fator de adesão para os vírus Ebola. 72 horas após a transfeção das células produtoras e 24 horas após a transfeção das células-alvo, colete o sobrenadante das células produtoras e pipete-o para um tubo de 15 mililitros.

Após coletar o sobrenatante, remova qualquer líquido remanescente e adicione 250 microlitros de tampão de lise luminiscente às células, incubando-as por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, determine a atividade de luciferase conforme descrito no passo três deste vídeo. Enquanto isso, centrifugue o sobrenatante das células produtoras por cinco minutos a 800 ×g e à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o meio das células-alvo e adicione três mililitros do sobrenadante clarificado das células P-zero às células-alvo. Faça isso em um poço por vez. Quando terminar, retorne as células-alvo ao incubador. 24 horas após a infecção.

Remova o sobrenatante das células-alvo. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio com 5% de FBS às células e retorne-as ao incubador. Para determinar a atividade do repórter em células produtoras ou células-alvo, essas células são colhidas 72 horas após a transfeção no caso das células produtoras e 72 horas após a infecção no caso das células-alvo.

Para tanto, remova o sobrenatante das células e adicione 250 microlitros de tampão de lise luminiscente às células, incubando-as por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente. Se desejado, o sobrenatante pode ser usado para infectar um novo conjunto de células-alvo. Nesse caso, colete o sobrenatante e infecte as células-alvo conforme descrito no passo dois deste vídeo.

Enquanto isso, descongele 40 microlitros por poço de tampão de ensaio de luciferase e adicione um centésimo do volume de substrato de luciferase ao tampão. Agite o reagente final de luciferase em vórtex e certifique-se de que ele atingiu a temperatura ambiente antes de prosseguir. Em seguida, pipete 40 microlitros do reagente em uma placa branca opaca de 96 poços. Para evitar problemas com crosstalk, é aconselhável deixar um poço livre entre os poços de amostra. Após o término da incubação de 10 minutos, lave as células para o tampão de lise por pipetagem e transfira o lisado celular para um tubo. Centrifugue os lisados por três minutos a 10.000 g e temperatura ambiente. Após isso, pipete 40 microlitros dos lisados na placa de 96 poços contendo o reagente de luciferase. Incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente. Após os 10 minutos, meça a atividade de luciferase utilizando um luminômetro. O tempo de integração para a medição de luminiscência deve ser de um segundo. Com um luminômetro microplaca Modulus, os sinais típicos de luminiscência para o controle positivo devem estar em torno de um vezes 10 à sexta até um vezes 10 à sétima, enquanto o sinal para o controle negativo deve ser pelo menos duas a três ordens de magnitude menor. Em passagens subsequentes, a atividade do repórter nos controles positivos deve permanecer estável, enquanto a atividade do repórter nos controles negativos deve cair para níveis de fundo.

Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de produzir partículas semelhantes ao vírus competentes para replicação e transcrição do vírus Ebola, utilizá-las para infectar células-alvo e medir a atividade do repórter nas células produtoras e nas células-alvo.

É importante destacar que este método pode ser combinado com outras técnicas, como a diminuição mediada por RNA de fatores celulares, para estudar o papel desses fatores na biologia viral. Além disso, é possível introduzir mutações nos componentes virais utilizados neste método, a fim de estudar o papel desses componentes no ciclo de vida do vírus Ebola. Mais detalhes experimentais e reagentes específicos podem ser encontrados no artigo que acompanha este vídeo.