Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

O objetivo geral deste procedimento é expor o nervo facial para estudar lesões do nervo periférico. O nervo facial tem origem na ponte do tronco encefálico e sai do crânio através do forame estilomastóideo; em seguida, o nervo se divide em seus componentes principais.

Uma vez exposto, o nervo é exautotomizado na sua saída pelo forame estilomastóideo. Dois marcos anatômicos principais auxiliam na localização do nervo facial. O primeiro é o canal auditivo, composto por placas cartilaginosas de coloração branca perolada, conectadas por uma membrana fina.

O outro é o ventre anterior do músculo digástrico, que se situa sobre o nervo e sua saída pelo forame estilomastóideo. Após a lesão do nervo facial, o pesquisador pode estudar múltiplos fatores, como morte de neurônios motores ou expressão gênica. O modelo de lesão do nervo facial é um dos modelos de lesão nervosa periférica mais bem caracterizados.

As vantagens desta técnica são sua simplicidade, alta reprodutibilidade e ausência de efeito sobre funções vitais decorrentes da paralisia facial subsequente. Além disso, devido à natureza altamente simétrica do sistema nervoso, o lado não lesionado pode servir como um controle interno pareado para seus experimentos. Para manter o uso de técnicas assépticas durante todo o procedimento, certifique-se de que todas as ferramentas tenham sido autoclavadas e de que um esterilizador de contas de vidro esteja preparado para esterilizar os instrumentos entre as operações.

Prepare a bancada cirúrgica colocando uma almofada absorvente sobre um aquecedor, configurando o microscópio e fixando o cone nasal com fita adesiva para alinhá-lo com a borda do campo visual. Após anestesiar o camundongo, certifique-se de que ele não apresente nenhuma resposta física a manipulações, incluindo o aperto do dedo do pé. Em seguida, transfira o fluxo de gás da câmara de anestesia para o cone nasal e aplique pomada oftálmica.

Posicione o camundongo sobre o lado esquerdo, sobre campos cirúrgicos, com um aquecedor por baixo. Monitore continuamente a respiração do animal e ajuste o fluxo de fluoreto de ISO conforme necessário para manter a anestesia. Em seguida, para expor o local cirúrgico, fixe a orelha direita ao cone nasal com fita adesiva.

A veia auricular posterior deve ser vista percorrendo a região da orelha. Em seguida, umedeça o pelo com etanol 70% e depile a região. Após a remoção do pelo, limpe a pele com três fricções alternadas de iodo e etanol 70%, garantindo que a região fique completamente limpa.

Prossiga com a cirurgia. Certifique-se de posicionar a boca alinhada lateralmente, com a veia da orelha orientada horizontalmente. Isso facilitará muito a localização do nervo facial.

Para determinar a localização da primeira incisão, siga a veia auricular posterior a partir da orelha em direção à região posterior da saliência da orelha. Em seguida, utilizando tesoura de mola, faça uma incisão de quatro milímetros, dois a três milímetros posterior à saliência, para fins didáticos. Essa incisão será ampliada para expor a anatomia subjacente.

Agora realize uma dissecação romba da gordura subcutânea e da fáscia. Vasos sanguíneos e músculos podem ser facilmente danificados pela tesoura. Em caso de sangramento.

Aplicar pressão com um cotonete estéril por pelo menos 30 segundos. Se houver perda significativa de fluido, injetar até meio mililitro de solução salina intraperitoneal com uma agulha de 25 ou 27 fios. Agora, localizar o nervo facial utilizando os pontos de referência principais.

O nervo acessório espinhal é superficial ao nervo facial e pode ser visto percorrendo a porção occipital do crânio. Para inervar o músculo trapézio, identifique o canal auditivo cartilaginoso. Ele é de cor branca perolada e pode ser visto rostralmente ao nervo facial.

O nervo facial envolve a porção coddle do canal auditivo. Em seguida, identifique o ventre muscular do músculo digástrico anterior, que se situa superior e coddle ao nervo facial. Disseque sob esta estrutura para expor o nervo facial.

É uma estrutura sólida e branca, aderida a uma camada de fáscia subjacente. Identifique os ramos principais do nervo facial. Siga-os dorsalmente até sua origem no forame estilomastóideo.

Use pinças finas para manter o local aberto enquanto utiliza a ponta da tesoura de mola para dissecar ao longo do trajeto dos nervos faciais. O seio mastoide ósseo de Raymond pode ser sentido pelas pinças. Agora, identifique o tronco do nervo facial para esmagar o nervo.

Comprima com a pinça fina por 30 segundos com pressão constante. Isso irá seccionar todos os axônios. Em seguida, repita a compressão em um ângulo perpendicular por mais 30 segundos.

Mantenha a pressão constante entre os experimentos. Agora que os marcos anatômicos relevantes foram identificados, demonstrarei a técnica cirúrgica mais refinada. Usando uma incisão menor, siga a veia auricular posterior desde o lóbulo da orelha até a região posterior da saliência da orelha e faça uma incisão de quatro milímetros, dois a três milímetros posterior à saliência.

Agora, dissecar diretamente através da gordura subcutânea e da fáscia utilizando os três pontos de referência: o nervo acessório espinhal, o conduto auditivo e o ventre anterior do músculo digástrico. Expor o nervo facial. Seguir o nervo facial em direção ao forame estilomastóideo para alcançar o tronco do nervo facial, seccionar o nervo, estabilizá-lo suavemente com pinça fina e cortá-lo com tesoura.

Evite aplicar tração excessiva sobre o nervo, pois ele pode se romper a partir do tronco encefálico. Em seguida, afaste os cotos ou remova um segmento do nervo, garantindo que não ocorra qualquer recolamento. Por fim, examine cuidadosamente o nervo e confirme que ele foi completamente seccionado.

Após a evisceração, retorne todas as gorduras e músculos para suas posições aproximadas. Em seguida, feche a ferida com grampos cirúrgicos de 7,5 milímetros, suturas ou cola de cianoacrilato. Se necessário, aplique analgésicos neste momento, desligue a anestesia e devolva o camundongo a uma gaiola vazia sem forração.

Enquanto o animal se recupera, examine-o em busca de sinais de paralisia facial, os bigodes estão paralisados. Se estiverem voltados para trás, em direção à bochecha, o nariz parecerá desviado e o olho não piscará em resposta a uma lufada de ar. Agora, se o animal for fêmea, aloje-a com outra fêmea.

Mas se o macho permanecer isolado até que a função de piscar o olho retorne, aplique pomada tópica no tálamo diariamente para prevenir complicações corneanas. Enquanto isso, monitore o camundongo em busca de sinais de infecção ou outras complicações até que o local cirúrgico esteja cicatrizado. Existe uma variação significativa na perda de neurônios motores após ex sodomia, dependendo da idade e do fundo genético dos camundongos em animais selvagens que recebem uma secção do nervo facial com oito semanas de idade.

Cerca de 86% dos neurônios motores sobrevivem aos 28 dias após a neurotomia. Foi observada perda celular significativamente maior no modelo murino SOD1 de esclerose lateral amiotrófica, bem como no laser de captura por microdissecção em camundongos imunodeficientes com o gene de ativação de recombinação dois nocauteado.

A microdissecção foi utilizada para isolar material do núcleo motor facial. Todo o núcleo motor facial pôde ser coletado. Alternativamente, os subnúcleos puderam ser coletados separadamente.

A técnica possui grande precisão. Os neurônios motores podem ser capturados individualmente e o restante da pílula neural também pode ser coletado para análise posterior. A PCR quantitativa foi utilizada para examinar a expressão gênica nas amostras subnucleares do subnúcleo medial ventral, indicado pela linha tracejada, e do subnúcleo lateral ventral, indicado pela linha contínua; a expressão de quatro genes associados à resposta de regeneração nervosa foi medida.

Foram encontradas algumas diferenças entre os subnúcleos destes. A expressão de Gap 43 mostrou a maior diferença entre os subnúcleos. Uma vez dominada esta técnica, a cirurgia pode ser concluída em apenas alguns minutos.

É importante lembrar de posicionar corretamente o animal, fazer a incisão no local adequado e usar os pontos de referência anatômicos para localizar o nervo facial. É fácil se perder na região da cabeça e do pescoço; portanto, se você se sentir perdido, localize simplesmente o canal auditivo cartilaginoso e siga-o posteriormente para encontrar o nervo facial.