Name: Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a detectar múltiplas características de vetores da malária simultaneamente usando genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF. Este ensaio molecular identifica espécies, resistência a inseticidas e infecção por parasitas.

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Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.

1. Amplificação por PCR <ol><li> Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepare PCR cocktail como descrito no protocolo do fabricante (Tabela 1). O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. Vortex o tubo contendo o cocktail de PCR ligeiramente e centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g. </li><li> Dispensar 3 ul do cocktail de PCR em cada poço de um não-contornado placa de 96 poços. A pipeta repetidora pode economizar tempo para este processo. </li><li> Adicionar 2 ul de DNA genómico adequada de mosquitos em cada poço. NOTA: Processo de obtenção de ADN genómico a partir de m<html> tecidos osquito (cabeça / tórax, abdômen ou do corpo inteiro) é descrito em outras literaturas 29-32. Escolha um protocolo de extração de DNA adequado para diferenciar aqueles com Plasmodium no sangue (abdómen) de mosquitos infecciosos (Plasmodium na cabeça / tórax). Normalmente usamos DNA extraído de partes do corpo (cabeça / tórax ou abdômen) de mosquitos, por isso, concentração de DNA varia de 0.05-2ng / l. Embora a entrada de DNA total é menor do que a recomendação do fabricante (5-10ng / rxn), que costuma ter robusto SNP chamadas de 98% das amostras de DNA sem amplificação do genoma inteiro. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. </li><li> Usar o seguinte protocolo termociclador para realizar a amplificação por PCR: (1) 94 ° C durante 2 minutos, (2) 94 ° C durante 30 segundos, (3) 56 ° C durante 30 segundos, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir o passo (2) - (4) por 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, 4 ° C e preensão. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. O tratamento da SAP <ol><li> Preparar a solução de enzima SAP em uma placa de 96 poços (Ver Tabela 2). Processar 96 amostras em uma placa. O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. </li><li> Vortex o tubo de solução de enzima SAP levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul da solução de enzima SAP em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Incubar a placa como se segue: (1) 37 ° C durante 40 minutos, (2) 85 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima, (3) a 4 ° C preensão. Ao terminar este passo, a placa de armazenar a -20 ° C antes de continuar. Processar a placa armazenado dentro de 2 semanas. </li></ol> 3. SNP Extension <ol><li> Se a placa de amostra é congelado após o tratamento SAP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir. </li><li> Preparar a mistura de extensão do primer (Tabela Suplementar S2). Cada SNP tem uma extension iniciador. Manter a concentração estoque de cada iniciador de extensão em 500 M. Opcionalmente, alíquota de 100-200 reacções por tubo e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar a mistura de extensão como descrito na Tabela 3. O volume de reacção 96 inclui uma saliência de 20%. </li><li> Vortex o tubo de extensão cocktail levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul do cocktail de extensão em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo. </li><li> Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Thermocycle da placa, como mostrado na Figura 1. Neste momento, proceder à espectrometria de massa ou armazenar a placa à temperatura de -20 ° C até 2 semanas. </li></ol> 4. Condicionado o SNP extensão do produto para otimizar Análise Espectrometria de Massa <ol><li> Se a placa de amostra é congelado após a extensão SNP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir. </li><li> Transferir 15 mg de resina a partir da sua Container na placa covinha usando uma colher alongada. Use o raspador para espalhar resina para os poços da placa de covinha. Varrer o raspador de lado a lado ao longo da placa para espalhar a covinha resina. Verifique se há resina em cada poço. </li><li> Raspe o excesso de resina da placa covinha usando o raspador. Deixe que a resina de suporte na placa de ondulação para a, pelo menos, 20 min. Enquanto a resina deixando ficar na placa de ondulação, adicionar 41 ul de água para HPLC a cada poço da placa de amostra. </li><li> Delicadamente, coloque a placa de amostra de cabeça para baixo, sobre a placa covinha. Certifique-se de repor a placa de amostra contra o pequeno posto arredondada da placa covinha, que alinha os poços na placa de amostra com os poços da placa covinha. </li><li> Segurando a placa de amostra ea placa covinha juntos, lançá-los suavemente sobre modo a resina cai para fora da placa covinha nas cavidades da placa de amostra. Toque na placa covinha de modo a resina cai na placa de amostra. Certifique-se de toda a resina no diplaca mple cai nos poços da placa de amostra. Centrifugar a placa a 3200 xg durante 30 seg. </li><li> Girar a placa de amostras num rotor durante 5 min à TA. Rotator deve girar a placa de amostra de 360 ​​° sobre o eixo longitudinal. </li><li> Centrifuga-se a amostra na placa de 3.200 xg durante 5 min. Após este passo, armazenar a placa de amostra a -20 ° C até 2 semanas antes de prosseguir para o próximo passo. </li></ol> 5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa <ol><li> Transferir o produto da extensão do SNP condicionado para um bioarray tais como SpectroCHIP conforme as instruções do fabricante. Usamos MassARRAY Nanodispenser para este passo. </li><li> Assim que a transferência for concluída, definir a forma como os ensaios e as placas estão a ser criado no banco de dados do ensaio. Nome do ensaio e placas de tal forma que cada placa tem identificador único que liga ao design ensaio específico (Tabela Suplementar S3). </li><li> Depois de ensaio e placa foram definidos, adquirir espectros usando um espectrômetro de massa. </li></ol><ol><li> Realizar análise de dados utilizando uma análise em tempo real PCR software de interpretação de dados, como Tipos Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obter dados em formato .xml que contém o layout da amostra, espectrograma de massa para cada bem, as informações marcador incluindo nome, massa esperada para cada variante do SNP correspondente, e qualquer erro ou mensagens de aviso associado a cada reação. Ver Figura 2 para o espectrograma de massa resultante. </li><li> Realizar análise do genótipo SNP agrupamento, definindo o limite de detecção (magnitude ou sinal-ruído) e tolerância / variação permitida para cada genótipo. A Figura 3 mostra um exemplo de uma 04707-KDR # 2 clusters genótipo SNP. </li><li> Exportar os resultantes chamadas genótipo SNP em um programa de planilha. </li></ol>

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<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização - tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que possam interferir c...

Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis ​​pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resistência knock-down, ou kdr, SNP) 13 -18, (3) a detecção de parasitas PCR 19-23, e (4) de triagem para DNA específica do host no intestino médio do mosquito 24,25. Foi desenvolvido um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos estes ensaios numa única reacção multiplex com o objetivo de umalyzing características epidemiologicamente importantes de vetores da malária em África. O ensaio MDA inclui múltiplos marcadores para a detecção (1) espécie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou outro (nenhum dos três)), (2) a resistência aos inseticidas representada em kdr SNPs (ambos L1014F e L1014S) , (3) a presença de dois grandes parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) a partir de uma fonte de sangue aviária e seis hospedeiros mamíferos. Tradicionalmente, estes ensaios foram realizados em reacções em cadeia de polimerase separadas. Quando todos esses ensaios são feitos usando uma plataforma PCR convencional, requer a realização de ensaios de reacção de PCR 10/08 e acompanha os passos de eletroforese em gel. Cada reação individual PCR de preparação para resultados documentando leva 4-5 horas, enquanto o método aqui apresentado MDA leva cerca de 5 horas em sua totalidade. Isto é equivalente a uma economia de 90% em custos de trabalho sozinho. O MDA apresentou aqui custa US $ 5por amostra de genotipagem de todos os 33 SNPs. Isto é consideravelmente mais barato do que as solteiras ensaios baseados em gel de agarose, que custa cerca de US $ 1,50 por amostra. Ensaios que detectam todas as características abrangidas pelo MDA requereria um mínimo de 8-10 ensaios separados baseadas em gel de agarose a um custo de $ 12-15 por amostra. Além disso, o MDA reduz grandemente a possibilidade de gerar uma falsa positiva ou negativa através da utilização de pelo menos três marcadores para cada parasita ou fonte de acolhimento de detecção. A plataforma que utilizado não está limitado a vetores da malária, mas pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações, tais como a medicina, e medicina veterinária, e biologia de base 26-28. Em profundidade estudos de associação ou de genética de populações estudos envolvendo um grande número (em ordem de 100s) das amostras exigem ensaios rentáveis ​​triagem para múltiplos marcadores simultaneamente. A maioria dos estudos que utilizam dois ou mais ensaios de PCR separadas poderia implementar o MDA para resultados mais rápidos a um custo menor. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF espectrometria de massa para aplicações genômicas para análise de ácidos nucléicos.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Transfere produtos de reação iPLEX concluídos para o</td></tr><tr><td>conjunto de reagentes de genotipagem SpectroCHIP iPLEX Gold</td><td>Sequenom</td><td>10158</td><td>Reagentes usados para o ensaio iPLEX, incluindo o kit SAP.</td></tr></tbody></table>

um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados ​​para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.

A identificação das espécies: Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar. genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas: A 1014 ° codão do canal de sódio parágrafo te...

Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos...

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Este vídeo demonstra um ensaio de alimentação sanguínea para avaliar a mortalidade e a fecundidade de compostos de teste com novos modos de ação em mosquitos fêmeas. Essa técnica ajuda na triagem de novas classes de inseticidas para matar a população resistente de mosquitos e controlar a propagação de doenças.

Ensaio de alimentação de mosquitos: um método para avaliar os efeitos dos compostos de teste na mortalidade e fecundidade de mosquitos fêmeas adultas

Enquanto a análise de alta resolução de fusão oferece a capacidade de diferenciar entre polimorfismos de nucleotídeo único em uma população heterogênea, viés amplificação alelo mutante pode aumentar a sua capacidade para detectar alelos presentes em percentagens relativamente baixas dentro de uma amostra. Este protocolo descreve melhorias que melhoram a sensibilidade da análise de fusão de alta resolução.

Métodos para aumentar a sensibilidade de alta resolução de derretimento Single Nucleotide Polymorphism Genotipagem em Malária

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

Este protocolo fornece os passos desde a extração de DNA até a configuração experimental para PCR de gotícula digital (ddPCR), incluindo análise para identificação e quantificação de eventos não homólogos de junção final (NHEJ) em locais-alvo após o decote Cas9 induzido pelo GRNA e reparação de DNA. Outros usos deste método incluem aplicações como detecção de polimorfismo e verificação de variantes de edição de genes.

PCR de gotícula digital para detectar mutações indelés em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Os imunoensaios de fluorescência multiplex estão se tornando uma referência para testes sorológicos. Sua aplicação, no entanto, é limitada pela complexidade e pelos demorados processos de acoplamento de analitos de esferas. Este relatório apresenta um protocolo de acoplamento de esferas de microesferas multiplex semiautomatizado e reprodutível que é comparável ao método padrão, reduzindo consideravelmente o tempo de resultados.

Um ensaio sorológico multiplex para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus

Aprenda a detectar múltiplas características de vetores da malária simultaneamente usando genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF. Este ensaio molecular identifica espécies, resistência a inseticidas e infecção por parasitas.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

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