Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

O objetivo geral deste procedimento é homogeneizar rapidamente fragmentos de tecido humano em uma única suspensão celular sem digestão enzimática para análise qualitativa e quantitativa e isolamento de subpopulações específicas de linfócitos. Isso é feito primeiro usando um bisturi estéril para cortar os fragmentos de tecido em pequenos pedaços. Em seguida, a pasta do tecido é transferida para um tubo dissociado mecânico, onde os fragmentos são homogeneizados em uma única suspensão celular.

As células são então coletadas por centrifugação para análise a jusante. Em última análise, a citometria de fluxo pode ser usada para analisar os linfócitos infiltrantes, subpopulações asiáticos. Meu laboratório desenvolveu essa técnica porque estávamos procurando uma maneira de obter imagens de linfócitos infiltrantes de tumores sem afetar drasticamente seu estado nativo.

Queríamos algo em que pudéssemos isolar rapidamente as células e analisá-las como estavam na cirurgia. Esta técnica tem sido utilizada em mais de 300 tumores de mama e tecidos normais em nosso laboratório, sendo de fácil utilização e pode ser utilizada no dia a dia. Ele pode ser usado para examinar marcadores prognósticos, resposta ao tratamento e desfecho clínico em longo prazo.

Demonstrando essa técnica hoje estará John Nicola Loic. Um técnico em meu laboratório Comece pesando a amostra de tecido e, em seguida, medindo o comprimento, a largura e a altura do tecido. Em seguida, transfira o fragmento de tecido para uma pequena placa de Petri contendo um mililitro do meio de células hematopoiéticas livres de soro quimicamente definido apropriado e use um bisturi estéril para cortar as amostras em pequenos pedaços de um a dois milímetros quadrados.

Em seguida, transfira o conteúdo do prato para um tubo C de dissociação mecânica e lave o prato e o bisturi com dois mililitros de meio. Adicione a lavagem ao tubo C e, em seguida, execute o programa de dissociação mecânica de 0,01 duas vezes sucessivas para homogeneizar suavemente os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular. Após o segundo ciclo, decantar o homogeneizado através de um filtro de células de 40 micrómetros para um tubo cónico de 50 ml.

Em seguida, use a mesma praga que sua pipeta de lavar a placa de Petri para transferir qualquer líquido restante no tubo C para o filtro de células. Em seguida, use uma micropipeta de um mililitro para transferir o líquido filtrado para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue o tubo C com mais três mililitros de meio. Transfira esta lavagem através do filtro de células para o tubo de 50 mililitros.

Em seguida, mova suavemente o tecido não homogeneizado ao redor do filtro com uma ponta limpa de um mililitro para espremer a quantidade máxima de líquido residual preso no tecido no tubo de 50 mililitros. Agora, coloque o filtro de células de cabeça para baixo em cima do tubo C original e enxágue o filtro com mais três mililitros de meio para que o tecido não homogeneizado caia de volta no tubo C. Homogeneizar novamente o tecido por mais dois ciclos, como acabamos de demonstrar, e então despeje este segundo homogeneizado através do filtro de células.

Novamente, enxágue o tubo C com mais três mililitros de meio. Em seguida, filtre o sobrenadante através do filtro e esprema o líquido residual para fora do tecido, como acabamos de demonstrar. Neste ponto, um volume de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensão unicelular deve estar presente no tubo de 15 mililitros, e aproximadamente nove mililitros devem ser observados no tubo de 50 mililitros.

Para separar o sobrenadante tecidual das células, a primeira centrífuga, ambos os tubos de homogeneizado por 15 minutos a 600 Gs e temperatura ambiente, decanta o sobrenadante do tubo de 15 mililitros para um tubo de 1,5 mililitro, colocando-o a quatro graus Celsius e descarta o sobrenadante do tubo de 50 mililitros. Em seguida, bata suavemente em cada tubo em uma superfície dura para quebrar cada uma das pelotas celulares. Ressuspenda o pellet de células soltas no tubo de 50 mililitros com 500 microlitros de meio e transfira as células para o tubo de 15 mililitros para ressuspender o segundo pellet.

Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com mais 500 microlitros de meio e transfira a lavagem para o tubo de 15 mililitros para máxima recuperação celular. Depois de contar o número de células viáveis por trian blue exclusão pellet a suspensão celular. Finalmente, diminua o sobrenadante do tecido reservado.

Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para pelo menos um tubo limpo sem tocar ou perturbar o pellet e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para análise futura a jusante. Nesses gráficos, são mostrados gráficos de pontos representativos de citometria de fluxo de homogeneizados de células tumorais dissociadas, seguidos de marcação com anticorpos específicos contra leucócitos e marcadores de células epiteliais, conforme demonstrado. Este protocolo não altera significativamente a viabilidade das células positivas para CD 45.

No entanto, há uma perda considerável de células positivas viáveis para EPAM. Apesar disso, os subconjuntos viáveis de EPAM positivo e CD 45 positivo podem ser segregados com base em seu tamanho e estrutura em grandes células tumorais epiteliais, pequenas células epiteliais ou células grandes e pequenas CD45 positivas. Gráficos de pontos representativos de citometria de fluxo dos principais subconjuntos de infiltração de tumor são mostrados aqui com os linfócitos controlados pela viabilidade das células positivas para CD 45.

Finalmente, a expressão de citocinas ou imunoglobulinas totais presentes no sobrenadante do câncer de mama pode ser comparada com a do sobrenadante do tecido mamário normal, revelando, conforme demonstrado neste experimento representativo, aumentos em ambos os tipos de proteínas associadas ao tecido tumoral Enquanto o participante é o procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e limpar e recuperar a quantidade máxima de material em cada etapa do procedimento para obter um número suficiente de células para sua análise de endpoint.