Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

O objetivo geral deste procedimento é homogeneizar rapidamente fragmentos de tecido humano em uma suspensão de células únicas sem digestão enzimática, para análise qualitativa e quantitativa e para o isolamento de subpopulações específicas de linfócitos. Isso é realizado primeiramente utilizando um bisturi estéril para cortar os fragmentos de tecido em pequenos pedaços. Em seguida, a pasta de tecido é transferida para um tubo dissociador mecânico, onde os fragmentos são ainda mais homogeneizados em uma suspensão de células únicas.

As células são então coletadas por centrifugação para análise posterior. Em última instância, a citometria de fluxo pode ser usada para analisar os linfócitos infiltrantes, subpopulações asiáticas. Meu laboratório desenvolveu esta técnica porque estávamos buscando uma maneira de visualizar linfócitos infiltrantes tumorais sem afetar drasticamente seu estado nativo.

Queríamos algo que nos permitisse isolar rapidamente as células e analisá-las tal como estavam durante a cirurgia. Esta técnica foi utilizada em mais de 300 tumores de mama e tecidos normais no nosso laboratório, é fácil de usar e pode ser aplicada rotineiramente no dia a dia. Pode ser usada para examinar marcadores prognósticos, resposta ao tratamento e desfechos clínicos de longo prazo.

Hoje, demonstrando esta técnica, estará John Nicola Loic. Um técnico no meu laboratório. Comece pesando a amostra de tecido e, em seguida, meça o comprimento, largura e altura do tecido. Em seguida, transfira o fragmento de tecido para uma pequena placa de Petri contendo um mililitro do meio celular hematopoético definido quimicamente e livre de soro, apropriado, e use um bisturi estéril para cortar as amostras em pequenos pedaços de um a dois milímetros quadrados.

Em seguida, transfira o conteúdo da placa para um tubo C de dissociação mecânica e enxágue a placa e o bisturi com dois mililitros de meio. Adicione a lavagem ao tubo C e execute então, duas vezes consecutivas, o programa de dissociação mecânica 0,01 para homogeneizar suavemente os fragmentos de tecido em uma suspensão de células simples. Após o segundo ciclo, decante o homogeneizado através de uma peneira celular de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, use o mesmo pistilador para pipetar e transferir para o filtro celular qualquer líquido remanescente no tubo C, lavando a placa de Petri. Depois, use uma micropipeta de um mililitro para transferir o líquido filtrado para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue o tubo C com mais três mililitros de meio. Transfira essa lavagem através do filtro celular para o tubo de 50 mililitros.

Em seguida, mova suavemente o tecido não homogeneizado dentro do filtro com uma ponteira limpa de um mililitro para extrair a maior quantidade possível do líquido residual aprisionado no tecido para o tubo de 50 mililitros. Agora, posicione o filtro celular com a abertura voltada para baixo sobre o tubo C original e lave o filtro com mais três mililitros de meio, de modo que o tecido não homogeneizado caia novamente no tubo C. Realize mais duas rodadas de homogeneização do tecido conforme demonstrado anteriormente e, então, despeje este segundo homogeneizado através do filtro celular.

Novamente, lave o tubo C com mais três mililitros de meio. Em seguida, filtre o sobrenadante através do coador e esprema o líquido residual do tecido conforme demonstrado anteriormente. Neste ponto, deve haver um volume de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensão de células isoladas no tubo de 15 mililitros, e cerca de nove mililitros devem ser observados no tubo de 50 mililitros.

Para separar o sobrenadante tecidual das células, primeiro centrifugue ambos os tubos do homogenato por 15 minutos a 600 Gs e temperatura ambiente, decante o sobrenadante do tubo de 15 mililitros para um tubo de 1,5 mililitro, coloque-o a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante do tubo de 50 mililitros. Em seguida, bata suavemente em cada tubo sobre uma superfície dura para desagregar cada um dos pellets celulares. Re-suspenda o pellet celular solto no tubo de 50 mililitros com 500 microlitros de meio e transfira as células para o tubo de 15 mililitros para re-suspender o segundo pellet.

Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com mais 500 microlitros de meio e transfira a lavagem para o tubo de 15 mililitros para recuperação máxima de células. Após contar o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de trian, pelletize a suspensão celular. Finalmente, centrifugue o sobrenadante tecidual reservado.

Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para pelo menos um tubo limpo sem tocar ou perturbar o pellet e armazene-o a menos 80 graus Celsius para análises downstream futuras. Nestes gráficos, são apresentados gráficos de dispersão representativos de citometria de fluxo de homogeneizados de células tumorais dissociadas, seguidos por marcação com anticorpos específicos contra marcadores de leucócitos e de células epiteliais, conforme demonstrado. Este protocolo não altera significativamente a viabilidade das células positivas para CD 45.

No entanto, há uma perda considerável de células viáveis positivas para EPAM. Apesar disso, os subconjuntos viáveis positivos para EPAM e positivos para CD45 podem ser segregados com base em seu tamanho e estrutura em células tumorais epiteliais grandes, células epiteliais pequenas ou células positivas para CD45 grandes e pequenas. Aqui são mostrados gráficos de dispersão representativos de citometria de fluxo dos principais subconjuntos infiltrantes tumorais, com os linfócitos selecionados com base na viabilidade das células positivas para CD45.

Por fim, a expressão de citocinas ou os imunoglobulinas totais presentes no sobrenadante de câncer de mama podem ser comparadas com o sobrenadante de tecido mamário normal, revelando, como demonstrado neste experimento representativo, aumentos em ambos os tipos de proteínas associadas ao tecido tumoral. Embora o procedimento seja simples, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e com limpeza, e recuperar a quantidade máxima de material em cada etapa do procedimento para obter um número suficiente de células para a análise final.