Modelo de Rato Induzida fotoquimicamente posterior neuropatia óptica isquémica

O objetivo deste vídeo é demonstrar um modelo fotoquímico induzido de neuropatia óptica isquêmica posterior e avaliar seus efeitos com lombo retrógrado de células ganglionares da retina em pacientes com mais de 50 anos. A neuropatia óptica isquêmica é o tipo mais prevalente de neuropatia óptica aguda. A condição pode se apresentar como um dos dois subtipos de acordo com a fonte de suprimento sanguíneo específico afetada e a apresentação clínica, neuropatia óptica isquêmica anterior ou neuropatia óptica isquêmica posterior.

Embora a patogênese da neuropatia óptica isquêmica anterior tenha sido extensivamente estudada, a neuropatia óptica isquêmica posterior permaneceu pouco compreendida devido à sua baixa prevalência, apresentação variável e critérios diagnósticos mal definidos. Além disso, nenhum tratamento foi comprovado para prevenir ou reverter efetivamente a perda de visão da neuropatia óptica isquêmica anterior ou posterior. Portanto, um modelo animal reprodutível e confiável de neuropatia óptica isquêmica posterior é de grande valor para estudar o processo da doença in vivo e testar novos regimes terapêuticos para neuroproteção e regeneração de axônios A lesão isquêmica induzida por fotoquímica na microvasculatura, resultando em edema vasogênico e trombose, cria efetivamente isquemia tecidual regional.

O dano isquêmico é disseminado para áreas vizinhas e ainda mais exacerbado pela compressão microvascular devido a um edema vasogênico concomitante. Induzimos seletivamente essa forma de isquemia através do diretor do nervo óptico de Bbar para espelhar o dano causado pela neuropatia óptica isquêmica posterior. Aqui, Wang e Dale Brown fornecem uma demonstração passo a passo do procedimento.

Até onde sabemos, o modelo de lesão isquêmica no nervo óptico posterior foi desenvolvido na medida em que produz isquemia, evitando trauma físico. Assim, os processos fisiológicos da neuropatia óptica isquêmica posterior podem ser melhor imitados. Neste vídeo, demonstraremos todo o procedimento do nosso modelo de repetição de neuropatia óptica isquêmica posterior após a exposição cirúrgica da abelha eryri do nervo óptico posterior.

Um corante fotossensibilizante é injetado por via intravenosa e um feixe de laser é focado na superfície do nervo óptico. A interação fotoquímica entre o eryri B e o laser durante a radiação I danifica o endotélio vascular, provocando oclusão microvascular mediada por trombose plaquetária e compressão aous. A lesão isquêmica resultante produz uma morte gradual, mas pronunciada, das células ganglionares da retina devido a uma perda de entrada axonal, uma lesão remota induzida e um resultado clinicamente relevante.

Laser YA operando a 532 nanômetros e 300 miliwatts de potência máxima. Em seguida, há um helicóptero de feixe operando a 250 hertz, que é usado para reduzir a potência média para 7,5% de sua potência de pico. Temos um obturador de feixe fechado normalmente ENC com um pequeno orifício de 100 mícrons de diâmetro perfurado para produzir um feixe de mira fraco quando fechado.

Em seguida, há uma lente plana convexa de 25 centímetros de distância focal e, finalmente, um prisma de ângulo vermelho para direcionar o feixe para baixo no nervo óptico. Depois de originado de sua fonte, o feixe de laser passa pelo helicóptero, reduzindo a potência média para 7,5% de seu pico. O feixe de corte é então interceptado pelo obturador, que quando fechado produz um feixe de mira muito fraco, filtrando espacialmente o feixe através do orifício de 100 mícrons de diâmetro.

Este feixe fraco é então focalizado pela lente e redirecionado para baixo através do ângulo reto. Prisma no nervo óptico posterior exposto I A radiação é iniciada trocando um filtro de segurança no caminho óptico de um microscópio operacional, seguido pela abertura do obturador do feixe após um segundo de atraso. Neste ponto, o feixe de corte de potência total é focado e direcionado para baixo no nervo óptico exposto.

Após uma interação entre o feixe e a abelha ethin dissolvida na corrente sanguínea, essa luz laser verde de 5 a 32 nanômetros é absorvida eficientemente pelo ery circulante e o corante B e fluoresce é oxigênio molecular amarelo colidindo com uma molécula de corante de estado tripleto, aceita sua energia de excitação tornando-se oxigênio de estado singlete, que é altamente reativo. O oxigênio da TC então oxida diretamente o endotélio vascular e causa danos pontilhados à barreira, o que atrai especificamente as plaquetas e também facilita o vazamento de plasma para o parênquima. Esse processo de dano leva à oclusão vascular por trombose, bem como por edema vasogênico devido à compressão microvascular, a escada causa expansão da lesão além da profundidade de penetração da luz laser.

Se a técnica for feita corretamente, a trombina plaquetária não conterá fibra. Distinguindo assim este método no processo de coagulação do pé dependente do calor, muito menos eficiente. A operação de alta potência de pico aumenta a profundidade de penetração efetiva no nervo óptico opalescente, reduzindo a potência média para 7,5% via feixe.

O corte ajuda a garantir que um processo químico do pé e não um térmico esteja induzindo lesão tecidual peri em nossos ratos anestesiados com uma injeção intraperitoneal da cetamina Diaz em coquetel. Uma vez anestesiado, coloque suavemente a língua para a frente para evitar asfixia, raspe os locais cirúrgicos e aplique replicação, aumente em ambos os olhos para evitar o desenho da córnea durante a cirurgia. Avalie as etapas da anestesia para garantir que o animal não sinta dor durante a cirurgia.

Comece com o cateterismo da veia femoral. Antes dos procedimentos cirúrgicos, conecte um pedaço de tubo esterilizado e lavado com solução salina a uma seringa de um ML contendo uma solução pré-medida de 2% de eritri B. Com uma dose de 20 miligramas por quilograma de peso corporal, monte a seringa em uma bomba de infusão ajustada para uma taxa de 600 microlitros por minuto.

Limpe o local da cirurgia limpando a área com iodo de povidona a 10%, seguido de etanol a 70%. Faça uma incisão na base da coxa direita usando uma lâmina número 15. Corte e espalhe através da membrana com uma tesoura e separe o músculo com uma pinça até que o ramo da veia femoral se torne visível.

Continue dissecando para baixo com tesoura e fórceps, conforme necessário, para separar o vaso dos tecidos circundantes, conforme necessário. Limpe a área cirúrgica com BSS estéril frio para facilitar a visualização da veia. Separe cuidadosamente a bainha ao redor da veia, artéria e nervo do tecido subjacente.

Em seguida, isole a veia com dissecção romba ao longo de seus lados. Passe duas listas de agulhas de suturas de náilon sob a veia, elevando cuidadosamente o vaso, colocando pinças de ponta fina embaixo e agarrando-as e puxando-as. Ligue a veia distal com força e faça um nó solto ao redor da veia proximal.

Faça um corte parcial da veia perto da ligadura distal e expanda conforme necessário Com uma pinça segurando a parede da veia no corte, insira cuidadosamente o tubo de descarga salina no vaso. Em seguida, aperte o nó proximal solto ao redor do tubo. Ancore o tubo no lugar, amarrando-o à sutura distal.

Depois de verificar a qualidade do cateterismo e certificar-se de que está livre de obstruções ou vazamentos, feche temporariamente a incisão com suturas para proteger o cateterismo e o tecido. Prepare o local cirúrgico com solução de detergente de iodo a 10% Poon e etanol a 70%. Faça uma incisão ao longo da pele atrás do olho com uma lâmina número 15 e, em seguida, corte o tecido conjuntivo usando uma tesoura de entorse de Veneza.

Continue dissecando através do tecido conjuntivo ao longo da resma superior do osso óptico. Tome cuidado para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos locais. Dissecar através do tecido óptico até que o músculo reto superior seja visualizado.

O nervo óptico fica abaixo. Ele retrai o retalho de pele e o tecido conjuntivo lateralmente e para baixo. O olho girará para frente e para fora.

Insira cuidadosamente um par de pinças afiadas e expanda-as paralelamente ao nervo para expô-lo. A rede de microvasos que o alimenta será direcionada durante a irradiação a laser. Certifique-se de usar óculos de segurança de cor laranja o tempo todo ao operar o aparelho de irradiação a laser para se proteger da luz do laser.

Ligue o laser e ajuste as potências de pico e média em vários minutos. Antes de todos os procedimentos de irradiação. Coloque suavemente o animal no aparelho e posicione-o de forma que o feixe de mira brilhe perto do local de exposição do nervo óptico.

Em seguida, reexponha cuidadosamente o comprimento do nervo óptico com uma pinça de ponta fina. Faça pequenos ajustes no posicionamento para que o feixe de mira atinja o nervo óptico entre três e quatro milímetros atrás da cabeça do nervo óptico. Injete a solução de 2% de resina B através da ativação da bomba de infusão e deixe-a circular por alguns segundos durante esse tempo com uma pequena gota de BSS para umedecer a superfície do nervo óptico.

Depois de verificar a posição do feixe de mira, inicie o filtro de segurança controlado pelo pedal seguido de irradiação a laser e irradie por 90 segundos. A fluorescência amarela que aparece como laranja através do filtro deve ser observada a partir da superfície superior do nervo, e a fluorescência deve ser uniformizada através do nervo óptico. Com ligeiros ajustes posicionais do rato, o filtro de segurança abrir-se-á automaticamente após a irradiação.

Em alguns casos, pode-se observar micro-hemorragia, aliviar a tração nos músculos extraoculares, retornar o olho a uma posição neutra e fechar a incisão com suturas interrompidas. Corte as suturas que seguram o cateterismo da veia femoral e retire cuidadosamente o tubo. Amarre a veia femoral proximal firmemente para evitar vazamentos e feche a incisão com suturas interrompidas.

Aplique pomada antibiótica em ambas as incisões e verifique o fundo do olho quanto à integridade vascular da veia e artéria central da retina. Devolva o animal a uma gaiola limpa e aquecida para recuperação, administre analgésicos pós-cirúrgicos e cuide do animal. Seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com os animais.

Examine frequentemente o animal pós-operatório para garantir que o local da incisão esteja limpo e livre de infecções, avalie a dor e forneça analgésicos adequados e monitore a alimentação adequada e outros comportamentos. A imagem confocal de meses planos da retina pode ser usada para quantificar a sobrevivência das células de jogos da retina após a indução da neuropatia óptica isquêmica posterior usando lipina retro de queimado em comparação com animais de controle. Significativamente menos células de cabras das flores estão presentes em animais duas semanas após a indução do PI um.

Não é observada diferença significativa entre o número de células ganglionares da retina no controle dos animais simulados. Isso indica que a perda de células de gangue da retina é provocada pela combinação de um B e irradiação a laser, em vez da energia térmica do laser sozinho. A parte mais crítica do procedimento é a exposição e irradiação do nervo óptico.

A dissecção cuidadosa é necessária para evitar danos ao nervo pela pinça de ponta fina de tubarão ou pelo alongamento na artéria oftálmica. Entre no nervo óptico a cerca de um milímetro da cabeça do nervo óptico. Se a radiação de três a quatro milímetros de distância da cabeça do nervo óptico for importante para restringir a isquemia ao suporte capilar que irriga o nervo em vez das artérias e qualquer um de seus ramos que alimentam a retina interna O exame endoscópico é necessário para garantir a integridade vascular da artéria e veia central da retina após o procedimento Com parâmetros predefinidos para radiação laser.

Este modelo tem um curso de tempo reprodutível de morte celular, pois a intensidade de pico e a duração da irradiação são dois determinantes do dano isquêmico. A modificação da gravidade desses parâmetros pode ser feita para ajustar a gravidade do dano resultante das células ganglio da retina para diferentes objetivos de estudo Com otimização adicional. Este modelo fornece uma nova plataforma para pesquisa sobre patogênese e alterações moleculares da neuropatia óptica isquêmica posterior e pode ser usado para rastrear medicamentos de tratamento para esta e outras doenças isquêmicas do sistema nervoso central.