Name: A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a usar a sedimentação de equilíbrio para estudar interações proteicas e estabilidade de oligômeros pentaméricos da proteína do vírus sincicial respiratório humano em diferentes valores de pH.

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Este trabalho foi financiado pela National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) e Tier 1 grant RG 51/13.

Este protocolo é baseado nos seguintes recursos, que devem ser encaminhados para mais detalhes e considerações especiais 3, 25-28. 1. Densidade de harmonização de micelas detergentes com 2 H2O Nota: A densidade da solução tampão deve ser adaptada à densidade das micelas detergentes. Agentes de ajuste de densidade comuns incluem 2 H 2 O, 2 H 18 O, 2 H 2 O 18, glicerol e sacarose 29. H 2 O 18 tem a mesma densidade que 2 H 2 O e pode ser uma escolha melhor se deuteração de protões permutáveis ​​na proteína não é desejado. Neste processo, a densidade de 3- -propanesulfonate (C14SB) detergente (N, N-dimethylmyristylammonio) em Tris 50 mM pH 7,3, NaCl 100 mM será combinado com 2 H 2 O. Como uma estimativa inicial as seguintes concentrações de2 H2O será utilizado: 10, 30, e 50% v / v. 1.1. Preparação de amostra <ol><li> Preparar as seguintes soluções de reserva e esterilizar filtro através de um filtro de seringa de 0,2 um: 50 ml de Tris 500 mM pH 7,3 e NaCl 1 M (tampão 10X); 1 mL C14SB 250 mM (solução detergente 50X). </li><li> Prepare a 200 ul de solução de amostra através da mistura de 20 uL 10X tampão, 4 ul 50X solução detergente, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 156 ul de H2O desionizada Prepare também 200 jil de solução de referência, através da mistura de 20 uL solução tampão 10X, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 160 ul de H2O desionizada </li><li> Repetir o passo 1.1.2 para os outros 2 H 2 O concentrações, isto é, 30% e 50%, ajustando as quantidades de H 2 O 2 e H 2 O apropriadamente. </li></ol> 1.2. Assembleia de 6 canais AUC células e as amostras de carregamento para dentro das células. Nota: Existem dois tipos de células AUC, dependendo do método de carregamento de amostra. As células sem preenchimento externa tem de ser carregados antes da sua selagem da célula, ao passo que as células de enchimento externo pode ser carregado depois as células são selados. Montagem de uma célula de AUC externa de enchimento foi descrito anteriormente 3. Neste protocolo, a montagem de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo é descrito. A principal diferença é que tem anéis de rosca de ambos os lados que têm de ser apertadas separadamente, e ele não precisa de tampões de habitação (Fig. 1). A diferença de etapas de montagem são destacadas a seguir. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Figura 1. Vista explodida de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, Cells, e manual do usuário frontal. <ol><li> Preparar dois conjuntos de janelas para cada célula da AUC com janela de safira, em vez da janela de quartzo (Fig. 2). Coloque a junta da janela no suporte da janela. Ligeiramente dobrar o forro de janela e colocá-lo no suporte da janela de tal modo que a abertura é formada para a ranhura oposta titular janela. Coloque a janela de safira dentro do forro janela, alinhando a marca com a chaveta titular janela. Nota:. A janela de quartzo é compressível e, portanto, irá produzir refracção mais luz a alta velocidade 28, 30 Portanto, para medições de interferência acima de 30000 rpm, como nesta experiência correspondente densidade, são utilizadas janelas de safira. Uma janela de safira, é mais pesado do que a janela de quartzo e tem um &quot;X&quot; para o lado gravado. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Figura 2. Vista explodida of o conjunto janela. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, de células e, manual do usuário Counterbalance <ol><li> Coloque o compartimento celular com o número de peça de cabeça para baixo. Com os keyways alinhadas com a chave da habitação, deslizar para dentro da caixa de células em primeiro lugar, uma peça central de 6 sector com o lado chanfrado para baixo, seguido por um conjunto de janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à esquerda). </li><li> Cubra ligeiramente o roscas do anel de rosca e anel de parafuso arruela com spinkote. Coloque uma arruela anel de parafuso na parte superior do conjunto janela. Instale o anel de parafuso na habitação janela com a palavra &quot;OUT&quot; voltado para fora. Aperte o anel de parafuso utilizando a ferramenta de alinhamento celular. </li><li> Usando a chave de torque, aperte o anel de parafuso para apenas 60 libras por polegada. </li><li> Coloque a célula com o número de peça vertical e posicionadas em 12 horas. Load 120 ul de referência para as carreiras da esquerda e 110 ul de amostra para as carreiras da direita. Certifique-se de que cada amostra e referência está corretamente pareado. Nota: O volume de amostra exacta não é crítica, mas a referência precisa de ter um pouco mais do que o volume da amostra (5-10 uL) de modo que o menisco da amostra sejam distintas. </li><li> Cuidadosamente deslize para dentro do conjunto habitacional celular uma janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à direita). Tome cuidado para não perturbar o celular excessivamente e derramar o conteúdo. </li><li> Repita o passo 1.2. 3 e 1.2. 4, apertando o segundo anel de parafuso para 120 libras por polegada. Inverter o celular e voltar a apertar o primeiro anel de parafuso para 120 libras por polegada. </li><li> Carregar as células dentro do rotor, instalar o rotor no centrifugador e instalar o monocromador de acordo com as instruções do fabricante 28. Nota: Os detalhes deste step também pode ser encontrado nesta referência 3. </li></ol> 1.3. Configurando medição interferência <ol><li> Inicie o software de interface de usuário para o instrumento AUC e realizar a configuração de laser radial e calibração para cada célula a 3000 rpm, de acordo com as instruções do fabricante, que serão resumidos na etapa seguinte. </li><li> 1.3.1.1 Depois de vácuo suficiente tiver sido atingido (&lt;100 micra), executar a centrifugar a 3000 rpm. Visualize o padrão de interferência no software de interface de usuário e ajustar os parâmetros do laser para obter o mais alto contraste. </li><li> Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando &quot;Equilibrium&quot; e &quot;interferência&quot; de medição. Configurar um método de equilíbrio de sedimentação (botão &quot;Method&quot;) para serem executadas em 45000 rpm ou a velocidade mais alta prevista para amostras de proteínas, o que for maior, com temperatura de execução a 20 ° C e coletar uma verificação a cada 15 minutos. Monitor equilíbrio andamento abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função &quot;Match&quot;, depois de pelo menos 12 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 3). Nota: a função similar também está disponível em SEDFIT (Opções | Carregando Opções | Teste abordagem para Equilibrium). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Figura 3. O resultado de função HeteroAnalysis Match. A função de fósforo pode ser usado para monitorar o progresso de equilíbrio, comparando RMSD entre as varreduras sucessivas e a última verificação. Este exemplo mostra para atingir o equilíbrio depois de 8 horas, tal como indicado por valores RMSD assimptóticas ao eixo-X. 1.4. Análise de dados <ol><li> Para cada conjunto de amostras, traçar o declive do perfil de distribuição radial contra o 2 H2O concentração. Nota: A distribuição será um muito superficial exponencial que apabordagens linearidade. Intersecção do eixo-X corresponde à concentração de H 2 O 2 correspondentes. </li><li> Para resultados mais precisos, realizar o experimento em várias repetições. Alternativamente, repetir a experiência com uma faixa mais estreita de 2 H 2 O concentração. </li></ol> 2. Sedimentação equilíbrio do SH em micelas C14SB 2.1. Parâmetros de execução <ol><li> Calcular a densidade e viscosidade do tampão, a proteína volume específico parcial e velocidade de centrifugação usando SEDNTERP. Para calcular a densidade e viscosidade de buffer, selecione Compute na seção &quot;Buffer de Dados Select&quot; e insira os componentes do tampão em conformidade, incluindo a D 2 O concentração. </li><li> 2.1.1.1 Para calcular proteína volume específico parcial, selecione Compute na secção de &quot;V-bar&quot; e digite a sequência de aminoácidos da proteína. Especifique o tamanho oligomï¿½ica esperado mais alto em &quot;Faça um oligômero deste monômero: N =&quot;campo, neste caso N = 5. Calcule a velocidade ao entrar valores no campo RPM na janela principal até σ ≈ 1; esta é uma regra de ouro para garantir uma boa forma exponencial do perfil de distribuição radial 25. Nota: Os valores calculados para esta experiência foi a seguinte: ρ = 1,03839 g / ml, 1,0267 η = cP = 0,7569 ml / g, 1 ω = 16000 rpm. </li><li> Calcule velocidades posteriores a seguir para garantir adequada diferença entre o perfil de distribuição em uma velocidade e no próximo 25. Nota: Isto também pode ser feito a partir da função &quot;Estimar equilíbrio rotor acelera função&quot; em SEDFIT, que leva em conta a coluna de solução (volume de enchimento). </li></ol> 2.2. Preparações de amostras <ol><li> Prepare 1 ml de solução de referência com mM C14SB 5 e 32,3% 2 H 2 O, conforme determinado a partir de experimento correspondente densidade (seção 1), através da mistura de 100 l solutio 10X tampãon (passo 1.1.1), 20 ul de 50X solução detergente (passo 1.1.1), 323 ul de H 2 O 2 (99,9%) e 527 ul de H2O desionizada </li><li> Dissolve-se liofilizado, SH péptidos purificados por HPLC (expressão e purificação descrito anteriormente 31) num solvente apropriado tal como metanol ou 50% v / v de acetonitrilo aquoso. Medir A280 dos péptidos dissolvidos em escala microlitro espectrofotómetro UV / Vis e alíquota para três amostras para dar um 280, 12 mm = 0,3, 0,5, e 0,8 (A280, 10 milímetros = 0,25, 0,417, e 0,67) quando diluída para cada 130 ul. Liofilizar as amostras durante a noite e ressuspender em 130 solução de referência ul (passo 2.2.1) para dar soluções de amostra. Nota: proteína CS pode ser detectada a partir de UV / Vis a absorvância a 280 nm, porque contém resíduos de Tyr e Trp. Proteínas sem resíduos aromáticos podem ser detectados por marcá-los com um cromóforo adequado, utilizando um mutante contendo Trp, ou usando interferirnce em vez de medições de absorvância. </li><li> Siga as etapas na seção 1.2 para montar uma célula AUC 6 canais com janelas de quartzo. Carregar a amostra de maior concentração (280 A, 12 mm = 0,8) no canal mais próxima do centro do rotor e menor concentração da amostra (A280, 12 mm = 0,3) mais distante do centro do rotor. </li></ol> 2.3. Configurando medidas de absorbância <ol><li> Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando &quot;Equilibrium&quot; e mensuração &quot;Absorbance&quot;. Especificar 280 nm como o comprimento de onda do detector. </li><li> Execute a calibração radial a 3000 rpm, verificando &quot;calibração Radial antes da primeira varredura&quot; em Opções de verificação, especificando a coleta de dados em baixa resolução, por exemplo, com tamanho do passo Radial = 0,01 centímetros, réplicas = 3 (baixa resolução, rápida), e executar uma única varredura . Após a verificação for concluída, desmarque a opção. </li><li> Configurar um método de equilíbrio de sedimentação (&quot;Method botão &quot;) para ser executado na primeira velocidade calculada no passo 2.1.3, a 20 ° C, e recolher uma verificação a cada 30 minutos. Em &quot;Detail&quot; uns dos células, especifique a coleta de dados em baixa resolução como no passo 2.3.2. Monitorar o progresso de equilíbrio, abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função &quot;Match&quot;, após pelo menos 18 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 4). Nota: para atingir o equilíbrio podem demorar muito mais tempo para a primeira velocidade, enquanto velocidades subseqüentes levará menos tempo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados de função HeteroAnalysis Match. A primeira e segunda velocidades (topo à esquerda e à direita) parecem ter atingido o equilíbrio, mas é melhor esperar mais algumas horas para ter certeza. Em comparação, a terceira e quarta velocidades (canto inferior esquerdo e direito) têm claramente atingido o equilíbrioem um tempo menor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Uma vez que o equilíbrio foi atingido, recolher uma única varredura em alta resolução, por exemplo, com o tamanho do passo Radial = 0,001 centímetros, réplicas = 10 (alta resolução, lento). </li><li> Após a verificação for concluída, repita o passo 2.3.3 e 2.3.4 para a próxima velocidade. </li><li> Opcionalmente, quando necessário o tempo para atingir o equilíbrio para cada velocidade é conhecida (ou calculada a partir da experiência), configurar o método de equilíbrio de sedimentação de verificação para incluir todas as velocidades calculadas no passo 2.1.3 e recolher uma varredura após o tempo de equilíbrio para cada velocidade. Neste caso, especifique a coleta de dados de alta resolução em &quot;Detail&quot; cada célula. </li></ol> 2.4. A análise dos dados em SEDFIT e SEDPHAT Nota: Para mais detalhes e considerações em leitor de análise de dados é chamado to seguinte site: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Abertas scans de alta resolução em SEDFIT (Dados | dados de equilíbrio de carga de sedimentação) e dividir os dados em três canais (estas correspondem a diferentes concentrações para cada amostra; Opções | Carregando Opções | Salve 6 canais de dados brutos em 3 subconjuntos). </li><li> Re-abertos arquivos de dados que pertencem a uma mesma amostra e mesma concentração, mas diferentes velocidades em SEDFIT. Ajuste o menisco (linha vermelha vertical), fundo de células (linha vertical azul) e os limites de montagem (linhas verdes verticais), e exportar os dados para uso em SEDPHAT (Data | Exportação de dados para SEDPHAT). Entrada dos parâmetros calculados na etapa 2.1.1, assim como o tipo de rotor e tipo central, conforme solicitado. Repita este passo para cada amostra e concentração. </li><li> Abra todos os dados da mesma amostra (todas as concentrações e velocidades) em SEDPHAT e preencha parâmetros da experiência; um exemplo é mostrado na Fig. 5. Nota: quando D 2 O é adicionado no buffer, deut<html> peração de protões permutáveis ​​alterar significativamente o peso molecular da proteína, especialmente para as proteínas solúveis em água. As proteínas da membrana, especialmente as pequenas, como proteína SH, são menos afetados porque as regiões incorporado à membrana são protegidos de câmbio. Para corrigir isso, introduzir o &quot;tampão D fração mol&quot;. Nota: Nesta etapa é recomendado para salvar o conjunto de dados editados separadamente, selecionando menu Data | copiar todos os dados e salvar como Nova Configuração. </li><li> Selecione um modelo e preencha parâmetros globais para esse modelo. Nota: A título de exemplo, o modelo &quot;Monómero-n-Mer auto-associação&quot; e os seus parâmetros são apresentados na Fig. 6. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Figura 5. Um exemplo de como preencher parâmetros experimentais. files / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Um exemplo de como preencher parâmetros globais para o modelo monômero-n-Mer Auto-Associação. <ol><li> Executar um Fit global selecionando o menu Fit | Global de Fit e esperar até que os converge ajuste. Anote (ou tomar um screenshot) os resultados de ajuste, especialmente o qui-quadrado mundial reduziu e log K de valores. Extrato de outros dados, como dados de ajuste e resíduos de montagem a partir do menu de cópia e exibe | Mostrar informação termodinâmica. </li><li> Retornar para parâmetros globais e verificar M (1) para acomodar o peso molecular monômero e repita o passo 2.4.5. Anote o peso molecular equipada e reduziu qui-quadrado global. </li><li> Repita o passo 2.4.3 a 2.4.6 para cada modelo a ser testado e comparar a qualidade ajuste de cada modelo, comparando a redução do valor do qui-quadrado global, bem como resíduos de montagem. Nota: As pequenas e aleatórias resíduos montagem geralmente indica um bom ajuste, e o modelo que se encaixa melhor fariatem a menor redução do qui-quadrado global. O peso molecular do monómero colocada e que o valor de qui-quadrado não devem diferir substancialmente da do peso molecular (teórico) fixo. </li><li> Calcule o intervalo de confiança para o registro obtido Ka por valor selecionando primeiro Estatísticas | Critical qui-quadrado para as projeções de superfície de erro e de introduzir o intervalo de confiança desejado. Em seguida, vá para Estatísticas | Gerar projeção superfície de erro 1-dimensional e desmarque log Ka em diálogo parâmetros globais para obter os valores de qui-quadrado para log Ka. Nota: Os leitores são aconselhados a consultar as seguintes fontes (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) para obter mais detalhes sobre o método 32, bem como ilustração deste método 33. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este documento fornece um protocolo experimental para a preparação e análise de oligomerização de uma pequena proteína de membrana em detergente usando equilíbrio sedimentação da amostra. O protocolo descrito é igualmente válido para -e simpler- proteínas solúveis, como o passo correspondente da densidade não é necessária. Com efeito, o sistema é constituído por uma mistura de detergente e da proteína. Para realizar estudos de sedimentação, o detergente deve estar invisível para o campo gravitacional, de modo que não co...

Ultracentrifugação analítica 1-5 é um dos métodos mais importantes para estudar as interações de macromoléculas em condições fisiológicas, sendo acessível para ambas as interações fracas e fortes. O método é livre-label e utiliza a absorção de luz ou interferência, e até mesmo sistemas ópticos de fluorescência pode ser usado para acessar faixas de concentração ao longo de várias ordens de magnitude 6. Este método é especialmente útil, pois a maioria dos processos bioquímicos dependem de interações reversíveis. A estequiometria e resistência destas interacções têm de ser quantitativamente caracterizada para compreender os processos biológicos, e um número de métodos existentes para este fim 7, 8. No entanto, as interacções transientes são difíceis de estudar 9. A escolha de um método para caracterizar as interacções macromoleculares depende da sua natureza estática ou dinâmica. No primeiro caso, SEDIM<html> entação velocidade (SV) é usada, em que a taxa de transporte radial é medida e complexos são fraccionados com base em diferenças na massa e forma flutuante. Em contraste, as associações dinâmicas que são reversíveis na escala temporal da experiência não pode ser fisicamente separadas. Neste caso, auto ou hetero-interacções que as interacções não covalentes são em um equilíbrio que depende da concentração de proteína total. Estas interacções dinâmicas pode ser estudado por ambos equilíbrio de sedimentação (SE) e velocidade de sedimentação (SV) 10. No entanto, o primeiro método é mais simples de realizar e é descrito aqui. Em SE, a centrifugação é realizada a uma velocidade suficientemente baixa de modo a que se atingir um equilíbrio entre difusão e sedimentação. Neste ponto, o perfil de equilíbrio de um sinal óptico (UV-VIS), como uma função da distância radial, pode ser analisada utilizando modelos termodinâmicos pré-definido para associações 11. ve_content &quot;&gt; No presente documento, um estudo de equilíbrio de sedimentação, é apresentado o auto-associação de uma proteína da membrana virai que forma canais de iões. Devido à sua hidrofobicidade, a experiência é executado em presença de detergentes, e no presente caso, a densidade de solvente tem de ser compensada com a do detergente. No entanto, o protocolo descrito seria idêntica no caso de uma proteína solúvel em água, excepto que sem correspondência de densidade solvente seria necessário. A proteína utilizada é codificado no vírus respiratório sincicial humano (hRSV), um pneumovirus envelopado na família paramyxoviridae que causa a doença do trato respiratório inferior em crianças, idosos e imunocomprometidos populações em todo o mundo 12. Até 64 milhões de casos notificados de infecção hRSV e 160.000 mortes ocorrem a cada ano. O genoma hRSV transcreve 11 proteínas, incluindo as proteínas de membrana de três F, G, e pequeno hidrofóbico (SH). SH proteína está envolvidana patogênese da infecção pelo VSR. RSV sem o gene SH (RSVΔSH) era viável, causou a formação de sincícios e cresceu tão bem como o tipo selvagem (WT) vírus 13-16. No entanto, o vírus RSVΔSH replicado 10 vezes menos eficientemente do que o WT no tracto respiratório superior 15, 16. Além disso, o vírus RSVΔSH foi atenuada nos no rato vivo e modelos chimpanzé 13, 17. A proteína é um SH (RSV subgrupo A) 64 ou 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de comprimento do tipo II de proteína integral da membrana que se acumula maioritariamente nas membranas do Golgi compartimento 18. SH proteína tem um único previu uma hélice transmembranar (TM) 19 de domínio que é altamente conservada 20,21. Os domínios extramembrane C- e N-terminais são orientados lumenally / extracelularmente e no citoplasma, respectivamente. Ambos domínio TM sintético (resíduos 18-43) E SH proteína de comprimento completo foram mostrados para formar homopentamers em uma variedade de detergentes. A forma homopentameric é responsável pela atividade do canal em bicamadas lipídicas planas 22,23. A orientação correcta dos monómeros TM na bicamada lipídica foi primeiro determinada utilizando dicroismo local específico de infravermelhos 23, o qual mostrou His-22 para estar em uma luminal, perto de inter-helicoidal, a orientação. O domínio TM mesma orientação foi confirmada por estudos de RMN que reconstituídas a pentamérica um feixe helicoidal da proteína de comprimento completo em dodecylphosphocholine (DPC) 22 micelas. Neste modelo &#39;micela&#39;, um único domínio TM a- helicoidal foi flanqueada no terminal-N por uma a-hélice, e C-terminal por uma b-gancho de cabelo estendida. Os dois resíduos de proteína protonáveis ​​SH, His-22 e His-51, estão localizados no domínio TM (orientada lumenally), e na extremidade do C-terminal extramembrane β hairpin (medida a partir da poro do canal), respectivamente. Em um ambie bicellarnment, no entanto, o TM α-hélice estende-se a His-51, e ambos os resíduos His são acessíveis para o lúmen do canal 24. A estrutura do canal adopta uma arquitectura em forma de funil 22, onde a região mais estreita (Ser-Cys-29 a 45) 22 está alinhada com cadeias laterais hidrofóbicas (Ile-32, Ile-36, Ile-40 e Leu-44), e Ile-36 define o ponto mais estreito no lúmen do canal. His-22 está localizado na maior abertura deste funil, enquanto que His-51 está na ponta de abertura mais pequena. No presente documento, centrifugação analítica em equilíbrio de sedimentação de um modo foi usado para determinar se a sua protonação afecta a estabilidade do pentâmero da proteína de CS. Neste caso, SH proteína foi solubilizada em detergente de betaína-C14, que tem sido utilizado anteriormente para mostrar que as formas de proteínas pentaméricas oligómeros SH 22.

<table><tbody><tr><td>3- (N,N-dimetilmiritilamônio)propanossulfonato</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério 99,8%</td> <td>Isótopo de Cambridge</td><td>DLM-4-99,8</td><td></td></tr><tr><td>Rotor An-50 Ti, Analítico, 8 Lugares</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, Analítico,</td><td>4 Lugares Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Carcaça de célula</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>Centro de mesa de seis canais de 12 mm,</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td>Epon a carvão</tr><tr><td>Porta de janela</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Junta de janela</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Forro de janela</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Janela de safira</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Janela de quartzo</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Arruela de anel de parafuso</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Anel de parafuso</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de suporte de torque</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Contrapeso</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de alinhamento celular</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

a sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: efeito de histidina a protonação em pentamérica estabilidade

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usado para estudar as interacções reversíveis entre macromoléculas sobre uma ampla gama de forças de interacção e em condições fisiológicas. Isso faz com que AUC um método de escolha para avaliar quantitativamente estequiometria e termodinâmica dos homo e hetero-associação que são transitórias e reversíveis nos processos bioquímicos. Na modalidade de equilíbrio de sedimentação (SE), um equilíbrio entre difusão e sedimentação fornece um perfil como uma função da distância radial que depende de um modelo de associação específica. Nisto, um protocolo detalhado SE é descrita para determinar a energia associação tamanho e monómero-monómero de uma pequena oligómero de proteína de membrana usando uma ultracentrífuga analítica. ES-AUC é livre de marcador, apenas com base em princípios físicos, e pode ser usado em ambas as proteínas solúveis da membrana e água. Um exemplo é mostrado deste último, o pequeno hidrofóbico (SH) nas proteínas do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), Um polipeptídeo de ácido 65-amino com um único transmembranar (TM) de domínio helicoidal-α que forma canais de iões pentaméricos. Dados estrutural à base de RMN mostra que a proteína tem duas SH protonável resíduos de His no seu domínio transmembranar que são orientados de frente para o lúmen do canal. SE experimentos foram concebidos para determinar como pH afeta constante de associação e do tamanho da proteína oligomérica SH. Embora a forma pentamérica foi preservada em todos os casos, a sua constante de associação foi reduzida a pH baixo. Esses dados estão de acordo para uma dependência de pH semelhante ao observado para atividade canal SH, consistente com uma orientação do lúmen das duas Seus teor de resíduos no proteína SH. Este último pode experimentar repulsão eletrostática e estabilidade oligômero reduzida em pH baixo. Em resumo, este método é aplicável sempre que a informação quantitativa sobre proteína-proteína subtis alterações de associação em condições fisiológicas têm de ser medidos.

O perfil radial de distribuição C14SB micelas detergentes em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3, forma um exponenciais muito raso que poderiam ser ajustados a um modelo linear (Figura 7A). O declive desta distribuição está inversamente correlacionada com a concentração de D 2 O (Figura 7B). O ponto em que o declive é zero, ou seja, o correspondente D 2 O concentração, verificou-se ser de 32,3%. Veja a Figura 7 abaixo.</str...

O equilíbrio de sedimentação (SE) pode ser usado para estudar as interações proteína-proteína em um ambiente fisiológico. Este manuscrito descreve o uso desta técnica para determinar o efeito do pH na estabilidade de um homopentâmero formado pela pequena proteína hidrofóbica (SH) codificada pelo vírus respiratório sincicial humano (hRSV).

A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

O objetivo geral do seguinte experimento é determinar o tamanho do oligômero formado por um pequeno polipeptídeo hidrofóbico no detergente C 14 sulfalano e a estabilidade desse oligômero quando o pH é alterado. Isso é alcançado primeiramente pela determinação da concentração de óxido de deutério que corresponde à densidade das micelas do detergente, neutralizando assim sua flutuabilidade. Em um segundo passo, é realizada uma série de experimentos de equilíbrio de sedimentação para as amostras do pequeno proteína hidrofóbica solubilizada.No detergente C 14 sulfalano, é utilizada a concentração determinada de detergente oxidado. Em seguida, os primeiros e segundos passos são repetidos em um pH diferente, a fim de comparar o perfil de sedimentação da proteína nesses diversos valores de pH. Os resultados mostrarão tanto o tamanho oligomérico da pequena proteína hidrofóbica nesse detergente quanto o efeito do pH na estabilidade desse oligômero no detergente C 14 sulfalano.A demonstração visual deste método é fundamental porque envolve várias etapas, como a montagem e o carregamento das células, o ajuste da densidade e o alcance das condições de equilíbrio, o que pode facilmente sobrecarregar e confundir usuários iniciantes. Qualquer pequeno erro nessas etapas pode potencialmente desperdiçar vários dias de tempo experimental. O procedimento será demonstrado por Suria, estudante de doutorado no meu laboratório.Primeiro, prepare o tampão 10x e o detergente 50x. Prepare as soluções estoque e filtre-estilize cada uma através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetros para um einor de 1,5 mililitro a partir das soluções estoque de tampão 10x e detergente 50x. Prepare 200 microlitros de três soluções amostrais separadas contendo 10%, 30% e 50% de óxido de deutério em volume.Para montar uma célula analítica de ultracentrifugação de seis canais sem preenchimento externo, coloque a junta da janela no suporte da janela, levemente dobre o revestimento da janela e insira-o no suporte de modo que a abertura seja formada oposta ao suporte da janela. Encaixe em seguida coloque uma janela de safira dentro do revestimento da janela, alinhando a marca com o suporte da janela. Encaixe posicione o alojamento de venda com o número de peça voltado para baixo, com os encaixes alinhados à chave do alojamento.Deslize um centro com seis setores com o lado chanfrado voltado para baixo para dentro da carcaça da célula, seguido por um conjunto de janela com a janela voltada para baixo. Em seguida, cubra levemente as roscas do anel parafusável e a arruela do anel parafusável com lubrificante para revestimento por centrifugação. Coloque uma arruela do anel parafusável sobre o conjunto de janela. Instale o anel parafusável na carcaça da janela com a palavra "out" voltada para fora e aperte o anel parafusável manualmente utilizando a ferramenta de alinhamento da célula.Em seguida, aperte o anel de rosca apenas a 60 polegadas por libra usando a chave de torque. Após isso, posicione uma célula com o número de peça voltado para cima e alinhe às 12 horas. Carregue 120 microlitros de solução de referência nas fileiras da esquerda e 110 microlitros de solução da amostra nas fileiras da direita.Usando uma pipeta de 200 microlitros, certifique-se de que cada amostra e referência esteja corretamente pareada com cuidado. Deslize um conjunto de janela com a janela voltada para baixo na carcaça da célula, tomando cuidado para não perturbar excessivamente a célula, pois isso poderia derramar seu conteúdo. Repita os passos anteriores, apertando o segundo anel de parafuso até 120 polegadas por libra.Em seguida, inverta a cubeta e reaperte o primeiro anel de fixação a 120 polegadas-libra. Carregue as cubetas no rotor. Instale o rotor na centrífuga e instale o monocromador de acordo com as instruções do fabricante.Após atingido o vácuo suficiente, execute a centrífuga a 3000 RPM. Visualize o padrão de interferência no software da interface do usuário e ajuste os parâmetros do laser para obter o maior contraste possível. Em seguida, crie um novo arquivo de configuração, especificando a medição de equilíbrio e de interferência.Configure um método de equilíbrio de sedimentação para operar a 45.000 rotações por minuto ou na velocidade máxima prevista para amostras proteicas, com temperatura de ensaio de 20 graus Celsius. Após coletar um dado inicial, faça uma varredura a cada 15 minutos durante pelo menos 12 horas. Monitore o progresso do equilíbrio abrindo os arquivos de dados no hetero analysis e selecionando a função match. Neste ponto, monte uma célula de ultracentrifugação analítica de seis canais com janelas de quartzo da mesma maneira que anteriormente.Usando ponteiras para carregamento de géis, carregue a amostra de proteína hidrofóbica pequena de maior concentração previamente preparada no canal mais próximo ao centro do rotor e a amostra de menor concentração no canal mais distante do centro do rotor. Para configurar a medição de absorbância, crie um novo arquivo de configuração especificando equilíbrio e medição de absorbância. Especifique 280 nanômetros como o comprimento de onda do detector.Em seguida, realize uma calibração radial a 3000 RPM verificando a calibração radial antes da primeira varredura e nas opções de varredura. Especifique a coleta de dados em baixa resolução e execute uma única varredura. Após a conclusão da varredura, desmarque a opção.Configure um método de equilíbrio de sedimentação para ser executado na primeira velocidade previamente calculada a 20 graus Celsius e colete um varredor a cada 30 minutos em cada detalhe da célula. Especifique a coleta de dados em baixa resolução após pelo menos 18 horas. Monitore o progresso do equilíbrio abrindo os arquivos de dados na análise hetero e selecionando a função de correspondência assim que o equilíbrio for alcançado.Colete uma única varredura em alta resolução após a conclusão da varredura. Repita os passos anteriores para a próxima velocidade quando o tempo necessário para atingir o equilíbrio em cada velocidade for conhecido. Configure o método de equilíbrio de sedimentação Varredura para incluir todas as velocidades previamente calculadas e para coletar uma varredura após o tempo de equilibração para cada velocidade.Neste caso, especifique a coleta de dados de alta resolução em cada célula para detalhar a distribuição radial do detergente C 14 sultan em minhas células e tampão de fosfato de sódio 50 molar. O pH 7,3 forma uma exponencial muito suave que pode ser ajustada a um modelo linear. A inclinação desse perfil depende da concentração de óxido de deutério, e a concentração que produziu inclinação zero foi encontrada em 32,3%. O mesmo experimento foi repetido para pH 5,5 e pH 3 para obter concentrações correspondentes de óxido de deutério de 30,3% e 41%, respectivamente.Em pH 7,3, observou-se que a pequena proteína hidrofóbica e o detergente formam pentâmeros com logaritmo aparente da constante de afinidade de 21,05. A constante de associação não mudou em pH 5,5, mas foi significativamente reduzida em pH três. Isso é consistente com relatos anteriores que mostram uma diminuição da condutância em pH mais baixo com um pK de aproximadamente 4,5.Uma vez dominada a montagem do rotor em equilíbrio celular, o carregamento e a configuração do experimento podem ser realizados em uma hora, se executados corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um experimento de equilíbrio de sedimentação, de modo que possa determinar o tamanho oligomérico de sua proteína de membrana e também comparar a estabilidade sob diferentes condições experimentais.

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Um protocolo é apresentado para rapidamente testar a estabilidade térmica das proteínas em uma variedade de condições através de ensaios de mudança térmica e nano diferencial de varredura fluorimétrico. Sistemas tampão, sais e aditivos, juntos composto por três telas de estabilidade única, são doseados com proteínas para identificar buffers adequados para estudos funcionais e estruturais.

Como estabilizar a proteína: telas de estabilidade Thermal turnos, ensaios e Nano diferencial digitalização fluorimétrico no projeto vírus-X

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Aprenda a usar a sedimentação de equilíbrio para estudar interações proteicas e estabilidade de oligômeros pentaméricos da proteína do vírus sincicial respiratório humano em diferentes valores de pH.

A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade (Vídeo) | JoVE Journal

A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

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