Name: Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a avaliar a formação de conexões sinápticas entre neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas e neurônios corticais primários usando estimulação optogenética com channelrhodopsin-2. Este método acelera a maturação neuronal.

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Agradecemos K. Deisseroth e S. Je para as construções de lentivírus ChR2 e Synapsin1-tdTomato respectivamente, C. Chai para a partilha de conhecimentos e na geração de protocolo iPSC, WY Leong para o suporte técnico, membros do laboratório Goh para reagentes e experiência de compartilhamento. Este trabalho foi financiado pela Abbott Nutrition e do Centro Acadêmico de Excelência (ACE) prêmio de pesquisa da GlaxoSmithKline (GSK) para ELG, pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura no âmbito do seu Programa de Pesquisa Competitiva (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) para ELG e GJA, e pelo Instituto de Classe Mundial (WCI) Programa da Fundação Nacional da Coreia Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia (MEST) (NRF Grant Number: WCI 2009-003) para GJA

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<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Optogenética fornece precisão temporal e espacial para a ativação de populações de neurônios 13. Em nossos experimentos, todo o campo da objetiva do microscópio foi iluminado por 30 s para foto-estimular apenas neurônios corticais que expressam ChR2. Isso nos permitiu determinar se conexões sinápticas foram formados entre diferentes populações de neurônios dentro do co-cultura. Nossos resultados revelaram que fotoestimulação aumenta freqüência PSC em neurônios iPSC derivados, o que demonstra que esses neurônios recebem a entrada sináptica dos neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2. Este, por sua vez, demonstrado que os neurónios iPSC derivados incorporados com sucesso em circuitos com os neurónios corticais. Existem vários passos críticos para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que as culturas de astrócitos de rato NPC-derivados são saudáveis, com a morte celular mínima, antes de prosseguir com chapeamentode outros tipos de células. Os neurônios corticais e NPCs humanos atribuem bem em astrócitos saudáveis ​​e registros eletrofisiológicos dependem fortemente das condições de cultivo. As outras etapas fundamentais neste protocolo são a eletroporação e chapeamento de neurônios corticais em culturas de astrócitos. Como um grande número de células morrem após a electroporação, é importante para assegurar que, pelo menos, 6 milhões de neurónios corticais são electroporadas para placas com as culturas de astrócitos em placas de 24 poços. Temos observado que, quando menos do que 6 milhões de células foram electroporadas, o número de neurónios que sobrevivem não formar uma rede neuronal densa, que afectou registos electrofisiolicos. O número de neurônios corticais eletroporados também deve ser consistente para cada experimento co-cultura para permitir a comparação entre os diferentes estudos. Para todas as etapas que envolvem a digestão enzimática, é essencial para não deixar as células em solução digestivo durante muito tempo, pois pode levar à morte da célula. Esteabordagem pode ser utilizada para rastrear a capacidade de neurónios derivados de fibroblastos específicos do paciente para formar contactos sinápticos com outros neurónios. Os neurónios derivados de fibroblastos de pacientes que sofrem da perturbação do neurodesenvolvimento síndrome de Rett (RTT) apresentam defeitos de transmissão sináptica: RTT neurónios apresentam uma redução significativa na frequência e amplitude de PSC comparada com os neurónios saudáveis, presumivelmente devido à menor conectividade sináptica 14. Nosso sistema de co-cultura permite o exame dos efeitos da droga sobre os neurônios que apresentam defeitos de desenvolvimento. Isto pode ser realizado por meio de adição de compostos de interesse durante a semeadura de NPCs humanos doentes, bem como durante a exposição contínua a compostos ao longo do tempo de diferenciação neuronal. Embora este sistema de co-cultura pode também ser utilizada como um modelo para o teste da droga, uma limitação desta abordagem é que o processo de investigar os efeitos de cada composto candidato pode ser longo e tedioso quantonão é um método de rastreio de alto rendimento. Após o tratamento com compostos candidatos, os neurónios derivados de iPSC tem que ser corrigido individualmente para determinar os efeitos de cada composto sobre PSCs. Além disso, atualmente há não muitos fibroblastos disponíveis e iPSCs de pacientes. Portanto, será de interesse em um futuro próximo para ter mais células do paciente e também para adaptar este protocolo para triagem de alto rendimento. Por exemplo, por marcação de neurónios iPSC derivados com um indicador de actividade, tais como sensores geneticamente codificados de iões, ou o potencial de membrana, seria possível aumentar a taxa de produção substancialmente pelo procedimento electrofisiológico demorado-pisar lado. Como todo o processo de gerar este sistema de co-cultura, a partir de fibroblastos de reprogramação para executar registos electrofisiolicos, requer mais do que 90 dias, recomenda-se que tanto os iPSCs humanos ou NPCs ser expandida, após a reprogramação e etapas de indução neural respectivamente,e criopreservadas para reduzir o tempo necessário para experiências futuras. Em nossos experimentos, nós expressamos ChR2 em neurônios corticais sob o promotor synapsin1. Porque este promotor é pan-neuronal, que presumivelmente foram photostimulating ambos os neurônios corticais inibitórios e excitatórios. Se o objectivo de experiências futuras é interrogar especificamente circuitos ou inibitórios ou excitatórios, promotores mais específicos podem ser usados. Como alternativa, os neurônios corticais poderia ser obtido a partir de transgênicos (ou injetada-virus ratos) onde a expressão ChR2 é especificamente orientada para as subpopulações geneticamente definidos de neurônios. Por exemplo, os tecidos corticais colheita de um rato que tem Cre recombinase expressa em interneurons contendo parvalbumina (Interneurônios PV) que é cruzada com um mouse com floxed ChR2 renderá uma situação em que os únicos neurônios corticais que expressam ChR2 será interneurons PV 15. O uso de tais ChR2-expressando interneurónios no nosso pedido co-cuLTURE sistema permitirá a determinação de se um neurônio iPSC derivado remendada é capaz de incorporar em um circuito com interneurons PV. Com base em um estudo anterior 9, os neurônios corticais são maduros com sobreposição de dendrites após 14 dias in vitro. Assim, se fotoestimulação não desencadeia uma resposta de um neurónio iPSC derivado de patched, deve indicar que o neurónio não tem a capacidade para fazer ligações sinápticas com neurónios corticais. Um neurônio iPSC derivada é capaz de receber a entrada sináptica ou de outros neurônios iPSC derivados ou neurônios corticais. Se foram utilizadas gravações de sujeição do emplastro tradicional, não seria possível distinguir onde a entrada sináptica é proveniente. A vantagem do nosso sistema é que as respostas pós-sinápticos de entrada presynaptic cortical pode ser evocado seletivamente e identificados. Os procedimentos descritos aqui fornecer uma abordagem simples para avaliar a capacidade dos neurônios iPSC derivados de integrarnuma rede neuronal definido.

Nos últimos anos, a nossa compreensão do neurônio e função do circuito neuronal foram revolucionou por várias ferramentas Optogenetic que controlam a excitabilidade neuronal. Uma dessas ferramentas é o canal de cátions ativado por luz, channelrhodopsin-2 (ChR2): neurônios que expressam ChR2 potenciais de ação fogo em resposta à estimulação de luz 1-3. Porque os neurónios não são normalmente sensíveis à luz, esta capacidade notável abre novos caminhos para o controlo temporal e espacial exacta da actividade de populações geneticamente definidas de neurónios 4 e tem estudos da função cerebral grandemente acelerada. ChR2 foi aplicada a investigação em células estaminais para fins diferentes, de acompanhamento do desenvolvimento neuronal 5 a atividade de redes neurais 6 regulação. Aqui usamos ChR2 para aumentar a utilidade de um sistema de co-cultura neuronal. Sistemas de co-cultura permitir a avaliação das interações entre os diferentes tipos de células.Co-culturas de neurónios e células da glia, os principais tipos de células do sistema nervoso, são comumente usados ​​para investigar a sinalização entre estes tipos de células diferentes, bem como para avaliar a significância do presente sinalização para respostas fisiológicas, a propagação de danos e para examinar o mecanismos moleculares que estão potencialmente envolvidos no presente sinalização 7. Um estudo prévio revelou que iPSCs humanos diferenciar-se em neurónios muito rapidamente na presença de meio de cultura contendo os neurónios corticais de rato primários, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e 8. Neste protocolo, demonstramos um método que utiliza ChR2 em um sistema de co-cultura para interrogar conexões sinápticas entre os neurônios e neurônios corticais de rato derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos). Nós descrevemos etapas para dissecar e colheita tecidos cerebrais 9, bem como para manter e diferenciar as células progenitoras neurais de rato (NPCs) em astrócitos e NPCs humanos intO neurónios para criar o sistema de co-cultura. Para estabelecer este sistema de co-cultura, foi utilizado o método de reprogramação sem integração descrito por Okita et al. 10 para gerar iPSCs humanos. Estes foram, em seguida, de forma eficiente iPSCs diferenciadas em NPCs em condições quimicamente definidas utilizando inibidores de moléculas pequenas, tal como descrito por Li et al. 11 Na co-culturas, as diferentes populações de neurónios podem ser identificados através de detecção de expressão ChR2 em neurónios corticais e de marcação de neurónios iPSC derivados através da proteína fluorescente, em tandem dímero de tomate (tdTomato). Combinando registos electrofisiolicos de neurónios iPSC derivados com fotoestimulação optogenetic dos neurónios corticais permite avaliar a capacidade destes dois tipos de neurónios para formar circuitos uns com os outros. Especificamente, fotoestimulação de ChR2 expressando neurônios corticais evocar respostas sinápticas em neurônios iPSC derivados que se formaram circuitos sinápticoscom a rede de neurônios corticais photostimulated. Nós demonstramos que o aumento correntes pós-sinápticos são realmente detectado em neurônios iPSC derivados sob tais condições. Este protocolo permite a avaliação de circuitos sináptica sob uma variedade de condições experimentais, incluindo recapitulação dos diferentes modelos de doenças neurológicas usando iPSCs derivadas a partir de fibroblastos de pacientes com a doença.

<table><tbody><tr><td>Kit de Proliferação Neurocult (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contém NSC Basal Medium e NSC Suplemento</td></tr><tr><td>de Proliferação Epi5 Episomal iPSC Kit de Reprogramação</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM sem glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>suplemento GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Humano LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Composto E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Pesquisa FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Para meio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>Definido FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Para meio de neurônio primário</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Para meio de neurônio primário</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Para colheita de cérebros</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; unidade de filtro</td><td>m Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Para estudos eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Para estudos eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Frascos Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Protetores de Vidro</td> Kit de Nucleofector de Neurônio de Rato <td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Para eletroporação de neurônios corticais primários</td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Néon&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Para eletroporação de fibroblastos humanos</td></tr><tr><td>Mini Análise&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Análise v.6</td><td>Para medição de PSCs</td></tr><tr><td>Fibroblastos Humanos Dérmicos Normais</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de arco curto</td><td>de mercúrio OSRAM</td><td>HBO 103 W / 2</td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem optogenetic para avaliar formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Aqui descrevemos um protocolo para gerar uma co-cultura composta por 2 populações neuronais diferentes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são reprogramadas a partir de fibroblastos humanos usando vetores epissómicos. Colônias de iPSCs podem ser observadas 30 dias após o início da reprogramação de fibroblastos. As colônias pluripotentes são colhidas manualmente e cultivadas em meio de indução neural para permitir a diferenciação em células progenitoras neurais (NPCs). As iPSCs se convertem rapidamente em células neuroepiteliais em 1 semana e mantêm a capacidade de se auto-renovar quando mantidas em alta densidade de cultura. Os NPCs primários de camundongos são diferenciados em astrócitos pela exposição a um meio contendo soro por 7 dias e formam uma monocamada sobre a qual os neurônios corticais de rato embrionários do dia 18 (E18) (transfectados com channelrodopsina-2 (ChR2)) são adicionados. Os NPCs humanos marcados com a proteína fluorescente, dímero tandem Tomato (tdTomato), são então semeados na cultura de neurônios astrócitos / corticais no dia seguinte e podem se diferenciar por 28 a 35 dias. Demonstramos que esse sistema forma conexões sinápticas entre neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais, evidentes a partir de um aumento na frequência das correntes sinápticas após a fotoestimulação dos neurônios corticais. Este sistema de co-cultura fornece uma nova plataforma para avaliar a capacidade dos neurônios derivados de iPSC de criar conexões sinápticas com outras populações neuronais.

Aqui, um protocolo descrevendo os vários passos envolvidos na geração de uma co-cultura consistindo astrócitos, os neurónios corticais e neurónios humanos é ilustrado. IPSCs humano foram obtidas através da reprogramação de fibroblastos utilizando vectores epissomais 10 e especificada na linhagem neural com um cocktail de inibidores de moléculas pequenas, tornando NPCs 11 que foram mantidas a uma densidade elevada (Figura 1A). Vários passos são necessários para gerar a co-cultura: diferenciação dos NPCs do mouse em astrócitos, chapeamento de neurônios corticais de ratos que expressam ChR2, e semeadura de NPCs humanos marcados com tdTomato (Figura 1B). No dia 2 de diferenciação, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) + astrócitos podem ser facilmente observadas nas nossas culturas (Figura 1C). Rato NPCs foram deixadas diferenciar durante pelo menos uma semana antes do plaqueamento neurónios corticais que expressam ChR2 sobre a monocamada de astrócitos (Figura 1D). Após 34 semanas de diferenciação NPC humano, tdTomato + neurónios foram detectados nas culturas (Figura 1E). Este sistema de co-cultura permite a detecção de correntes coerentes de neurónios pós-sinápticos iPSC derivados individuais em resposta à estimulação luminosa (Figura 2A). Quando estimulada por luz, potenciais de acção foram gerados em neurónios corticais que expressam ChR2 (Figura 2B). iPSC-neurónios derivados também são excitáveis ​​(Figura 2C), que mostra o aumento da acção de disparo potencial como a amplitude de despolarização impulsos de corrente foi aumentada (Figura 2D). Assim, estas células exibem propriedades neuronais maduros. Na ausência de luz, os neurónios derivados de iPSC recebido entradas sinápticas espontâneas (Figura 2E). Estas correntes dentro pós-sinápticos foram predominantemente mediado por receptores AMPA, porque as correntes através de receptores GABA seria ida e receptores NMDA não carregam uma correnteta segurando potencial de -70 mV. Pelo menos alguns desses insumos eram de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2, porque a estimulação de luz aumentou consideravelmente a frequência das correntes pós-sinápticos (Figura 2E). O tempo de este aumento na entrada sináptica é mostrado na Figura 2F: fotoestimulação dos neurônios corticais foi sustentado ao longo do 30 seg longo luz do flash. Embora a frequência das unidades de atendimento foi elevada quando ChR2 expressando neurônios corticais foram photostimulated (Figura 2G), a sua amplitude não foi afetada (Figura 2H). Em resumo, estes resultados indicam que os neurônios iPSC derivados exibiu propriedades neuronais maduras e poderia formar conexões sinápticas com neurônios corticais pré-sinápticos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Figura 1: diagramas esquemáticos para a geração de co-cultura(A) Timeline sistema. para a reprogramação fibroblastos humanos em iPSCs e indução neural para NPCs. (B) Timeline para diferenciação terminal de NPCs humanos em neurônios maduros sobre corticais neurônios e astrócitos culturas. (C) rato NPCs diferenciar rapidamente em GFAP + astrócitos após 2 dias in vitro. (D) Após uma semana, os neurónios corticais que expressam ChR2 foram plaqueadas em astrócitos GFAP +. (E) com 4 a 5 semanas após a diferenciação de NPCs humanos, registos electrofisiolicos foram efectuados em tdTomato + neurónios. Barras de escala representam 100 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Figura 2: Análise Optogenetic de conectividade sináptica funcional. (A) derivado de células iPSC marcados com tdTomato (vermelho) foram co-cultivadas com os neurónios corticais que expressa o activado pela luzcanal, ChR2 (verde). Gravações de neurônios iPSC derivados revelou atuais (PSC) respostas pós-sinápticos, o que poderia vir de qualquer neurônios corticais ou outros neurônios iPSC derivados. (B) Iluminação (barra azul) provocou uma série de potenciais de ação em neurônios corticais que expressam ChR2. ( células C) iPSC derivados são evocadas por injecção de corrente. (D) Firing vs curva de corrente de células iPSC derivados. (E) fotoestimulação dos neurônios corticais ChR2 expressando (barra azul) aumentou a freqüência de unidades de atendimento em neurônios iPSC derivadas . Claro que (F) Hora do aumento na freqüência PSC produzido por fotoestimulação. Barra azul indica o tempo de fotoestimulação. (G, H) Enquanto frequência CPS foi aumentada por fotoestimulação (G), a amplitude do PSC não foi afectada (H). * Indica p &lt;0,05 comparado com o controlo com o teste t de estudante.

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estabelecer um sistema de co-cultura para avaliar a capacidade dos neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas de formar conexões funcionais por meio de uma abordagem genética baseada na fotoestimulação de neurônios cultivados por meio do canal RUSIN dois ou CR dois. Isso é alcançado primeiramente isolando células progenitoras neurais primárias de camundongo, ou NPCs, e permitindo que elas se diferenciem em astrócitos. Em seguida, neurônios corticais primários de rato são transfectados com CH R dois e semeados sobre a camada de astrócitos, que serve como a população neuronal existente.Em seguida, NPCs humanos derivados de culturas de células-tronco pluripotentes induzidas ou IPSC são transduzidos com o vírus de tomate 2D da sinapsina um, depois colocados sobre o cultivo de neurônios astrócitos e induzidos a se diferenciar, formando subsequentemente conexões sinápticas. Os resultados mostram que os neurônios derivados de IPSC formam conexões sinápticas com neurônios corticais de rato com base em gravações eletrofisiológicas de correntes pós-sinápticas nos neurônios derivados de IPSC após estimulação fotogênica dos neurônios corticais que expressam CHR dois. A principal vantagem deste método em relação aos existentes, como os que envolvem apenas co-cultivo de astrócitos com neurônios humanos derivados de IPSC, é que o tempo de maturação desses neurônios humanos é mais curto.Isso ocorre porque a presença de neurônios primários pode acelerar a maturação desses neurônios humanos, demonstrando que o procedimento será realizado por Uni Chin, aluna de pós-graduação do meu laboratório, e por Y da equipe do laboratório de George Augustine. Após a coleta de cérebros de ratos embriões e o isolamento do tecido cortical de acordo com o protocolo descrito, transfira os tecidos corticais para uma placa contendo a solução de digestão de tecido cortical pré-aquecida. Pique os tecidos corticais o mais finamente possível antes de incubá-los a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transfira os tecidos corticais para um tubo cônico de 50 mililitros, dissocie os tecidos utilizando uma pipeta serológica até obter uma solução homogênea, sem fragmentos de tecido.Passe a solução tecidual através de um filtro celular de 70 micra para remover quaisquer coágulos teciduais remanescentes. Aliquote três mililitros da solução em tubos cónicos de 15 mililitros.Adicione 800 microlitros de BSA 7,5% em um XPBS ao fundo de cada tubo, formando uma camada sob a camada de tecido. Centrifugue a 200 Gs por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante aspirando a partir da interface das duas camadas. Evite perturbar o pellet de selp no fundo do tubo.Após utilizar um mililitro de meio de neurônios primários para ressuspender cada paleta celular, combine todos em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, utilize um hemocitômetro para determinar a densidade celular. Centrifugue 6 milhões de neurônios corticais de rato a 200 Gs durante cinco minutos e remova o sobrenadante.São necessários pelo menos 6 milhões de neurônios corticais para a eletroporação. Para garantir a formação de uma rede neuronal pelos neurônios sobreviventes, adicione 100 microlitros de solução de eletroporação ao pellet celular e ressuspenda suavemente. Em seguida, combine 100 microlitros da suspensão celular com seis microgramas do plasmídeo CR dois e transfira para um vet certificado.Selecione e aplique o programa apropriado para eletroporação de acordo com as instruções do fabricante. Após a eletroporação, adicione 500 microlitros de MEM ao vet. Transfira as células para 11,5 mililitros de meio de neurônio primário e ressuspenda suavemente.Em seguida, adicione 500 microlitros em cada poço de uma placa de 24 poços contendo astrócitos de camundongo. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou CIPs, induza e mantenha as células como uma cultura de células progenitoras neurais humanas ou CPNs de acordo com o protocolo descrito no texto.Neste exemplo, as NPCs são marcadas utilizando o vetor lentiviral synapse em um tomate TD no dia seguinte à adição de neurônios primários a uma cultura de astrócitos. Use um XPBS para lavar as NPCs humanas uma vez, então adicione a solução de desanexação celular e incube por cinco minutos a 30 graus Celsius. Certifique-se de que todas as células tenham se desanexado.Em seguida, transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo o dobro da quantidade de D-M-E-M-F 12 e centrifugue a 200 ×g por cinco minutos. Remova o sobrenatante e use o meio de diferenciação neuronal para ressuspender suavemente o pellet em células individuais. Utilize um hemocitômetro para contar as células.Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de culturas de neurônios corticais e astrócitos. As NPCs humanas a 5.000 células por centímetro quadrado por poço em meio de diferenciação neuronal. Incube a 37 graus Celsius e 5%CO2, e substitua o meio a cada dois ou três dias durante pelo menos 28 dias.Para confirmar se os IPCs humanos se comportam como neurônios maduros, utilize um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão em água de 60 x para localizar células diferenciadas a partir de IPCs humanos. Visualizando o TD-tomate. Puxe uma pipeta de registro até uma resistência de quatro a seis ohms para perfusão.As células à temperatura ambiente em uma solução externa borbulhada constantemente com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono. Use uma solução interna para preencher a micropipeta de gravação, realize um selo em uma célula positiva para tomate TD no modo de célula inteira e registre a geração de potenciais de ação em resposta à injeção de corrente no clamp de corrente. Para confirmar que o potencial de ação de células corticais que expressam CHR dois é evocado de forma confiável pela estimulação luminosa.Primeiro, localize células corticais que expressam CR dois por meio da visualização de GFP através da iluminação com lâmpada de arco de mercúrio, utilizando um filtro de excitação com comprimento de onda de 480 sobre 40 nanômetros. Verifique se um potencial de ação é evocado de forma confiável por meio de gravação em regime de clamp de corrente no modo de célula inteira. Para realizar a estimulação genética, realize o patch em uma célula positiva para TD-tomate no modo de célula inteira e ajuste o clamp de voltagem em menos 70 milivolts com a lâmpada de mercúrio de campo inteiro e um filtro de excitação de 480 sobre 40.Estimule todo o campo por 30 segundos. Registre as correntes pós-sinápticas ou PSCs de uma célula selada induzidas pela estimulação fotônica de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam CHR2. Defina o limiar para amplitude e área das correntes em cinco picoampères aqui e pico, respectivamente, e inspecione manualmente esses eventos para descartar quaisquer traços não relacionados a PSCs.Como demonstrado neste vídeo, várias etapas são necessárias para gerar a co-cultura de neurônios derivados de CIPs, neurônios corticais primários e astrócitos. Esta imagem mostra que, no segundo dia de diferenciação de NPCs de camundongo em astrócitos, astrócitos positivos para a proteína ácida fibrilar glial ou GFAP podem ser facilmente observados. NPCs de camundongo foram deixados diferenciar por pelo menos uma semana antes do plaqueamento de neurônios corticais, expressando CR dois, sobre a monocamada de astrócitos, e ambos são identificados nesta co-cultura por meio de coloração imunofluorescente de GFAP e CHR dois.Após três a quatro semanas de diferenciação de NPCs humanos, neurônios positivos para tomate TD foram detectados nas culturas, conforme mostrado aqui. Quando estimulados pela luz, potenciais de ação foram gerados em neurônios corticais expressando CHR dois IPSC. Os neurônios derivados também são excitáveis, demonstrando aumento do potencial de ação.Disparos potenciais conforme a amplitude dos pulsos de corrente despolarizantes foi aumentada. Na ausência de luz, neurônios derivados de IPSC receberam entradas sinápticas espontâneas. Essas correntes pós-sinápticas entrantes foram predominantemente mediadas por receptores AMPA.A estimulação luminosa dos neurônios corticais foi mantida durante todo o 32º estímulo luminoso prolongado, enquanto a frequência dos PSCs estava elevada. Quando os neurônios corticais que expressavam CHR dois foram estimulados com luz, suas amplitudes não foram afetadas. Após este procedimento, podemos utilizar outros sistemas de co-cultura com diferentes tipos celulares específicos de pacientes para responder perguntas adicionais, como o efeito de compostos candidatos a fármacos sobre doenças específicas de interesse.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

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Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

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Uma técnica de co-cultura para diferenciar células progenitoras neurais humanas em neurônios

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

O vídeo demonstra a gravação eletrofisiológica para avaliar as conexões neurais entre neurônios corticais derivados de iPSC e de ratos, confirmando contatos sinápticos na co-cultura, ativando canais iônicos sensíveis à luz e detectando correntes pós-sinápticas.

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Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

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A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

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Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

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