Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

O objetivo geral do experimento a seguir é estabelecer um sistema de co-cultura para avaliar a capacidade dos neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas de formar conexões funcionais por meio de uma abordagem genética baseada na fotoestimulação de neurônios cultivados por meio do canal RUSIN dois ou CR dois. Isso é alcançado primeiramente isolando células progenitoras neurais primárias de camundongo, ou NPCs, e permitindo que elas se diferenciem em astrócitos. Em seguida, neurônios corticais primários de rato são transfectados com CH R dois e semeados sobre a camada de astrócitos, que serve como a população neuronal existente.

Em seguida, NPCs humanos derivados de culturas de células-tronco pluripotentes induzidas ou IPSC são transduzidos com o vírus de tomate 2D da sinapsina um, depois colocados sobre o cultivo de neurônios astrócitos e induzidos a se diferenciar, formando subsequentemente conexões sinápticas. Os resultados mostram que os neurônios derivados de IPSC formam conexões sinápticas com neurônios corticais de rato com base em gravações eletrofisiológicas de correntes pós-sinápticas nos neurônios derivados de IPSC após estimulação fotogênica dos neurônios corticais que expressam CHR dois. A principal vantagem deste método em relação aos existentes, como os que envolvem apenas co-cultivo de astrócitos com neurônios humanos derivados de IPSC, é que o tempo de maturação desses neurônios humanos é mais curto.

Isso ocorre porque a presença de neurônios primários pode acelerar a maturação desses neurônios humanos, demonstrando que o procedimento será realizado por Uni Chin, aluna de pós-graduação do meu laboratório, e por Y da equipe do laboratório de George Augustine. Após a coleta de cérebros de ratos embriões e o isolamento do tecido cortical de acordo com o protocolo descrito, transfira os tecidos corticais para uma placa contendo a solução de digestão de tecido cortical pré-aquecida. Pique os tecidos corticais o mais finamente possível antes de incubá-los a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transfira os tecidos corticais para um tubo cônico de 50 mililitros, dissocie os tecidos utilizando uma pipeta serológica até obter uma solução homogênea, sem fragmentos de tecido.

Passe a solução tecidual através de um filtro celular de 70 micra para remover quaisquer coágulos teciduais remanescentes. Aliquote três mililitros da solução em tubos cónicos de 15 mililitros.

Adicione 800 microlitros de BSA 7,5% em um XPBS ao fundo de cada tubo, formando uma camada sob a camada de tecido. Centrifugue a 200 Gs por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante aspirando a partir da interface das duas camadas. Evite perturbar o pellet de selp no fundo do tubo.

Após utilizar um mililitro de meio de neurônios primários para ressuspender cada paleta celular, combine todos em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, utilize um hemocitômetro para determinar a densidade celular. Centrifugue 6 milhões de neurônios corticais de rato a 200 Gs durante cinco minutos e remova o sobrenadante.

São necessários pelo menos 6 milhões de neurônios corticais para a eletroporação. Para garantir a formação de uma rede neuronal pelos neurônios sobreviventes, adicione 100 microlitros de solução de eletroporação ao pellet celular e ressuspenda suavemente. Em seguida, combine 100 microlitros da suspensão celular com seis microgramas do plasmídeo CR dois e transfira para um vet certificado.

Selecione e aplique o programa apropriado para eletroporação de acordo com as instruções do fabricante. Após a eletroporação, adicione 500 microlitros de MEM ao vet. Transfira as células para 11,5 mililitros de meio de neurônio primário e ressuspenda suavemente.

Em seguida, adicione 500 microlitros em cada poço de uma placa de 24 poços contendo astrócitos de camundongo. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou CIPs, induza e mantenha as células como uma cultura de células progenitoras neurais humanas ou CPNs de acordo com o protocolo descrito no texto.

Neste exemplo, as NPCs são marcadas utilizando o vetor lentiviral synapse em um tomate TD no dia seguinte à adição de neurônios primários a uma cultura de astrócitos. Use um XPBS para lavar as NPCs humanas uma vez, então adicione a solução de desanexação celular e incube por cinco minutos a 30 graus Celsius. Certifique-se de que todas as células tenham se desanexado.

Em seguida, transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo o dobro da quantidade de D-M-E-M-F 12 e centrifugue a 200 ×g por cinco minutos. Remova o sobrenatante e use o meio de diferenciação neuronal para ressuspender suavemente o pellet em células individuais. Utilize um hemocitômetro para contar as células.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de culturas de neurônios corticais e astrócitos. As NPCs humanas a 5.000 células por centímetro quadrado por poço em meio de diferenciação neuronal. Incube a 37 graus Celsius e 5%CO2, e substitua o meio a cada dois ou três dias durante pelo menos 28 dias.

Para confirmar se os IPCs humanos se comportam como neurônios maduros, utilize um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão em água de 60 x para localizar células diferenciadas a partir de IPCs humanos. Visualizando o TD-tomate. Puxe uma pipeta de registro até uma resistência de quatro a seis ohms para perfusão.

As células à temperatura ambiente em uma solução externa borbulhada constantemente com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono. Use uma solução interna para preencher a micropipeta de gravação, realize um selo em uma célula positiva para tomate TD no modo de célula inteira e registre a geração de potenciais de ação em resposta à injeção de corrente no clamp de corrente. Para confirmar que o potencial de ação de células corticais que expressam CHR dois é evocado de forma confiável pela estimulação luminosa.

Primeiro, localize células corticais que expressam CR dois por meio da visualização de GFP através da iluminação com lâmpada de arco de mercúrio, utilizando um filtro de excitação com comprimento de onda de 480 sobre 40 nanômetros. Verifique se um potencial de ação é evocado de forma confiável por meio de gravação em regime de clamp de corrente no modo de célula inteira. Para realizar a estimulação genética, realize o patch em uma célula positiva para TD-tomate no modo de célula inteira e ajuste o clamp de voltagem em menos 70 milivolts com a lâmpada de mercúrio de campo inteiro e um filtro de excitação de 480 sobre 40.

Estimule todo o campo por 30 segundos. Registre as correntes pós-sinápticas ou PSCs de uma célula selada induzidas pela estimulação fotônica de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam CHR2. Defina o limiar para amplitude e área das correntes em cinco picoampères aqui e pico, respectivamente, e inspecione manualmente esses eventos para descartar quaisquer traços não relacionados a PSCs.

Como demonstrado neste vídeo, várias etapas são necessárias para gerar a co-cultura de neurônios derivados de CIPs, neurônios corticais primários e astrócitos. Esta imagem mostra que, no segundo dia de diferenciação de NPCs de camundongo em astrócitos, astrócitos positivos para a proteína ácida fibrilar glial ou GFAP podem ser facilmente observados. NPCs de camundongo foram deixados diferenciar por pelo menos uma semana antes do plaqueamento de neurônios corticais, expressando CR dois, sobre a monocamada de astrócitos, e ambos são identificados nesta co-cultura por meio de coloração imunofluorescente de GFAP e CHR dois.

Após três a quatro semanas de diferenciação de NPCs humanos, neurônios positivos para tomate TD foram detectados nas culturas, conforme mostrado aqui. Quando estimulados pela luz, potenciais de ação foram gerados em neurônios corticais expressando CHR dois IPSC. Os neurônios derivados também são excitáveis, demonstrando aumento do potencial de ação.

Disparos potenciais conforme a amplitude dos pulsos de corrente despolarizantes foi aumentada. Na ausência de luz, neurônios derivados de IPSC receberam entradas sinápticas espontâneas. Essas correntes pós-sinápticas entrantes foram predominantemente mediadas por receptores AMPA.

A estimulação luminosa dos neurônios corticais foi mantida durante todo o 32º estímulo luminoso prolongado, enquanto a frequência dos PSCs estava elevada. Quando os neurônios corticais que expressavam CHR dois foram estimulados com luz, suas amplitudes não foram afetadas. Após este procedimento, podemos utilizar outros sistemas de co-cultura com diferentes tipos celulares específicos de pacientes para responder perguntas adicionais, como o efeito de compostos candidatos a fármacos sobre doenças específicas de interesse.