Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

O objetivo geral do experimento a seguir é estabelecer um sistema de co-cultura para avaliar a capacidade de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de formar conexões funcionais usando uma abordagem gênica baseada na fotoestimulação de neurônios cultivados via canal RUSIN dois ou CR dois. Isso é conseguido isolando primeiro as células progenitoras neurais primárias do camundongo ou NPCs e permitindo que elas se diferenciem em astrócitos. Em seguida, os neurônios corticais primários de ratos são transfectados com CH R dois e plaqueados na camada de astrócitos, que serve como a população neuronal existente.

Em seguida, os NPCs humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas ou culturas de IPSC são transduzidos com o vírus do tomate 2D da sinapsina um, depois colocados na cultura de neurônios de astrócitos e induzidos a se diferenciar subsequentemente, formando conexões sinápticas. Os resultados mostram que os neurônios derivados do IPSC formam conexões sinápticas com neurônios corticais de ratos com base em registros eletrofisiológicos de correntes pós-sinápticas nos neurônios derivados do IPSC após a fotoestimulação gênica dos dois neurônios corticais que expressam CHR. A principal vantagem desta matéria sobre as existentes, como aquelas que cocultivam apenas astrócitos com neurônios humanos derivados de IPSC, é que o tempo de maturação desses neurônios humanos é menor.

Isso ocorre porque a presença de neurônios primários pode acelerar a maturação desses neurônios humanos, demonstrando que o procedimento será Uni Chin, um estudante de pós-graduação do meu laboratório e processando Y do laboratório de George Augustine Depois de colher cérebros embrionários de ratos e isolar o tecido cortical de acordo com o protocolo de texto, transfira os tecidos corticais para um prato contendo a solução de digestão do tecido cortical pré-quente. Pique os tecidos corticais o mais finos possível antes de incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transferir os tecidos corticais para um tubo centrífugo de 50 mililitros, dissociar os tecidos com uma pipeta serológica até obter uma solução homogénea sem pedaços de tecido.

Passe a solução de tecido por um filtro de células de 70 mícrons para filtrar quaisquer aglomerados de tecido restantes. Alíquota de três mililitros de solução em 15 mililitros. Tubos de centrífuga.

Adicione 800 microlitros de 7,5% BSA em um XPBS ao fundo de cada tubo, formando uma camada sob a centrífuga da camada de tecido a 200 Gs por cinco minutos. Em seguida, remover o sobrenadante aspirando a partir da interface das duas camadas. Evite perturbar o pellet selp no fundo do tubo.

Depois de usar um mililitro de meio neurônio primário para ressuspender cada paleta de células, combine-as todas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, use um hemocitômetro para determinar a centrífuga de densidade celular. 6 milhões de neurônios corticais de ratos a 200 Gs por cinco minutos e remova o sobrenadante.

Pelo menos 6 milhões de neurônios corticais são necessários para a eletroporação. Para garantir a formação de uma rede neuronal pelos neurônios sobreviventes, adicione 100 microlitros de solução de eletroporação ao pellet celular e ressuspenda suavemente. Em seguida, combine 100 microlitros da suspensão celular com seis microgramas de plasmídeo CR dois e transfira-o para um veterinário certificado.

Selecione e aplique o programa apropriado para eletroporação de acordo com as instruções do fabricante. Após a eletroporação, adicione 500 microlitros de MEM ao veterinário. Transfira as células para 11,5 mililitros de neurônio primário, meio e suavemente resus suspenda.

Em seguida, adicione 500 microlitros em cada poço de uma placa de 24 poços contendo astrócitos de camundongos. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Depois de gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou IPCs, induza e mantenha as células como uma célula progenitora neural humana ou cultura NPC de acordo com o protocolo de texto.

Neste exemplo, os NPCs são rotulados usando a sinapse do vetor lentiviral em um tomate TD no dia seguinte à adição de neurônios primários a uma cultura de astrócitos. Use um XPBS para lavar NPCs humanos uma vez, depois adicione solução de desprendimento celular e incube por cinco minutos a 30 graus Celsius. Certifique-se de que todas as células foram desconectadas.

Em seguida, transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo o dobro da quantidade de DMEF 12 e centrifugue a 200 G por cinco minutos. Remova o sobrenadante e use o meio de diferenciação neuronal para ressuspender suavemente o pellet em células individuais. Use um hemocitômetro para contar as células.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da placa de culturas de neurônios corticais de astrócitos. Os NPCs humanos a 5.000 células por centímetro quadrado por poço na diferenciação neuronal. Média. Incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2 e substitua o meio a cada dois ou três dias por pelo menos 28 dias.

Para confirmar se os IPCs humanos se comportam como neurônios maduros, use um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão em água de 60 x para encontrar células diferenciadas de IPCs humanos. Visualizando o tomate TD. Puxe uma pipeta de gravação para uma resistência de quatro a seis ohms de perfusão.

As células à temperatura ambiente em uma solução externa borbulhavam constantemente com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono. Use uma solução interna para preencher a micropipeta de registro, remende uma célula positiva de tomate TD no modo de célula inteira e registre o potencial de ação disparado em resposta à injeção de corrente no grampo de corrente. Confirmar que o potencial de ação das células corticais que expressam CHR dois é evocado de forma confiável pela estimulação da luz.

Primeiro, encontre células corticais expressando CR dois pela visualização de GFP através da iluminação da luz com uma lâmpada de arco de mercúrio e usando um comprimento de onda do filtro de excitação de 480 sobre 40 nanômetros. Verifique se um potencial de ação é evocado de forma confiável por meio do registro de pinça de corrente no modo de célula inteira. Para realizar a estimulação gênica, remende uma célula positiva de tomate TD no modo de célula inteira e ajuste o grampo de tensão em 70 milivolts negativos com a lâmpada de mercúrio de campo inteiro e um filtro de excitação de 480 sobre 40.

Estimule todo o campo por 30 segundos. Registre as correntes pós-sinápticas ou PSCs de uma célula remendada induzida por fotoestimulação de CHR dois expressando neurônios corticais pré-sinápticos. Defina o limite para amplitude e área de correntes em cinco Pico Amp aqui e PICO, respectivamente, inspecione manualmente esses eventos para descartar quaisquer traços não PSC.

Conforme demonstrado neste vídeo, várias etapas são necessárias para gerar a co-cultura de neurônios derivados de neurônios corticais primários e astrócitos de IPCs. Esta imagem mostra que no segundo dia de diferenciação de NPCs de camundongos em astrócitos, a proteína glial fibrilar ácida ou astrócitos positivos para GFAP podem ser prontamente observados. Os NPCs de camundongos foram autorizados a se diferenciar por pelo menos uma semana antes de plaquear os neurônios corticais, expressando CR dois na monocamada de astrócitos, e ambos são identificados nesta co-cultura por meio de coloração imunofluorescente de GFAP e CHR dois.

Após três a quatro semanas de diferenciação de NPC humano, neurônios positivos para tomate TD foram detectados nas culturas, conforme mostrado aqui. Quando estimulados pela luz, potenciais de ação foram gerados em neurônios corticais expressando CHR dois IPSC. Os neurônios derivados também são excitáveis, mostrando ação aumentada.

O disparo potencial à medida que a amplitude dos pulsos de corrente despolarizante foi aumentada. Na ausência de luz, os neurônios derivados de IPSC receberam entradas sinápticas espontâneas. Essas correntes pós-sinápticas internas foram predominantemente mediadas por receptores AMPA.

A fotoestimulação dos neurônios corticais foi mantida durante todo o 32º flash de luz longa, enquanto a frequência das PSCs estava elevada. Quando os neurônios corticais que expressam dois neurônios corticais foram fotoestimulados, sua amplitude não foi afetada. Após este procedimento, podemos usar outros sistemas de co-cultura com diferentes tipos de células específicas do paciente para responder a perguntas adicionais, como o efeito de compostos de medicamentos candidatos em doenças específicas de interesse.