Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

O objetivo geral deste procedimento é produzir grandes quantidades de um vírus influenza de alto título, em um sistema econômico. Isso é feito primeiro obtendo ovos de galinha recém-fertilizados e livres de patógenos séricos. Na segunda etapa, os ovos são infectados com o vírus influenza através da raiz de Alan Toic.

Por 48 horas, o fluido Alan Toic, que contém o vírus, é então colhido e o vírus é congelado em nitrogênio líquido. Em última análise, ensaios de placa e hemaglutinina podem ser realizados para determinar a influência do título de vírus do Alan Toic coletado. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de colheita são muito sensíveis e requerem um manuseio cuidadoso dos ovos e um bom conhecimento de sua anatomia.

Antes de iniciar o procedimento, obteve-se ovos de davian recém-fertilizados e livres de patógenos séricos de um fornecedor adequado. Imediatamente após a chegada, coloque os ovos em uma incubadora de ovos umidificada com um virador automático de ovos para girar os ovos regularmente a 37 graus Celsius e 55 a 60% de umidade por 10 a 11 dias. Após sete a oito dias de incubação, usando luvas desinfetadas com etanol 70%.

Limpe um candler de ovos com o etanol e transfira os ovos da incubadora para as caixas de ovos vazias. Em seguida, apague as luzes e segure a ponta grande dos ovos, um de cada vez, contra o Candler. Se um óvulo for fértil, os vasos sanguíneos finos que levam a um embrião em forma de feijão devem ser claramente visíveis.

Se o óvulo não for fertilizado, uma pequena mancha de sangue com uma gema de ovo visível será observada. Em seguida, descarte os ovos não fertilizados e devolva o viável à incubadora. Se o status de um óvulo não puder ser confirmado, marque-o para observação posterior no dia 10 ou 11 após a fertilização e imediatamente antes do uso, dilua um estoque de vírus influenza A para um vezes 10 elevado a terceiro a 10 elevado a quarto PFU por mililitro em PBS estéril suplementado com hippies e coloque-o no gelo.

Em seguida, vela cada ovo novamente e elimine todos os embriões imóveis mortos. Em seguida, remova três ovos da incubadora e arrume-os em um suporte separado. Com os sacos de ar levantados, marque o espaço aéreo dos ovos com um marcador permanente.

Em seguida, lave a área acima do espaço aéreo com etanol a 70% e transfira o espaço aéreo dos ovos para uma caixa de ovos dentro de uma capa de biossegurança BSL dois. Agora use uma agulha estéril de calibre 18 para fazer um pequeno orifício na casca sobre o saco de ar de cada ovo. Tomando cuidado para não inserir a agulha muito profundamente para evitar esfaquear o embrião ou a gema.

Em seguida, aspire o vírus da gripe diluído para uma seringa estéril de um mililitro. Anexe uma agulha de calibre 22 e avance cuidadosamente a agulha em um ângulo de 45 graus na cavidade Alan Toic do primeiro ovo. Injete 0,2 mililitros do vírus diluído no ovo e, depois de injetar os outros dois ovos, descarte a seringa e feche cada orifício com uma gota de cola de uma pistola de cola.

Cuidar da cola não vaza para dentro do ovo e, em seguida, coloque os ovos de volta na incubadora. Depois que todos os ovos forem inoculados, incube os ovos infectados a 37 graus Celsius e 60% de umidade sem virar para o tempo de incubação ideal. Dependendo do tipo de vírus da gripe.

No final do período de incubação, resfrie os ovos por no mínimo quatro horas a quatro graus Celsius para matar o embrião e contrair os vasos sanguíneos. Quando os ovos estiverem suficientemente resfriados. Transfira-os para uma capa de biossegurança e um suporte firme e limpe as superfícies dos ovos com etanol 70%.

Em seguida, use uma tesoura estéril para abrir a casca do ovo acima do saco de ar do primeiro ovo. Remova a concha ao redor do saco de ar. Tomando cuidado para não danificar a membrana do cório Alan Toic.

Em seguida, use uma pinça romba estéril para abrir a membrana do cório Alan Toic e afaste suavemente o embrião e o saco vitelino com uma pequena espátula ou colher, tomando cuidado para não romper a gema. Em seguida, usando uma pipeta einor de um mililitro, colete cuidadosamente o fluido Alan Toic, inclinando o ovo para o lado para coletar o máximo de fluido possível, conforme necessário. Cada ovo deve render entre cinco a 10 mililitros de fluido levemente amarelado à medida que cada ovo é colhido.

Agrupe o fluido Alan Toic em tubos cônicos de plástico de 50 mililitros no gelo. Quando todo o fluido tiver sido coletado, gire o vírus e transfira o fluido claro para um novo tubo de 50 mililitros no gelo. Finalmente, descarte os ovos em um recipiente de resíduos BSL dois e imediatamente Eloqua para fluido LAN toic clarificado.

Em seguida, encaixe, congele o vírus em nitrogênio líquido e coloque os talos congelados em um freezer negativo de 80 graus Celsius. Para armazenamento a longo prazo, a infecção pelo vírus influenza causa um efeito citopático que resulta em zonas circulares de células entrelaçadas ou placas que se formam em uma monocamada de células. Neste experimento, as placas foram visualizadas colorindo as células com cristal violeta e 65 placas foram contadas no poço com uma diluição de 10 elevado a 12 negativo, pois 500 microlitros de estoque viral diluído foram cultivados nas células.

Neste experimento, o título final foi de 1,3 vezes 10 elevado ao 14º UFP por mililitro. O ensaio da nação hemaglutinina é um método para titulação do vírus influenza com base na capacidade do vírus de se ligar à superfície dos glóbulos vermelhos. Como observado, a suspensão viral aglutina os glóbulos vermelhos, impedindo que os glóbulos vermelhos se estabilizem fora da suspensão.

Um resultado claramente negativo foi observado com uma diluição de dois a menos 10 do vírus em 50 microlitros. Portanto, o título final é 2,1 vezes 10 elevado à quarta UAU por mililitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como propagar o vírus influenza inoculando ovos de galinha e colhendo o fluido do Atlântico contendo o vírus.