Name: Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a propagar o vírus Influenza A em ovos de galinha embrionados para virologia e desenvolvimento de vacinas. Este método permite obter altos títulos virais de forma econômica e confiável.

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O presente estudo foi apoiado pelo NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) e pelo American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

NOTA: Observações gerais: executar todos os procedimentos que envolvem a manipulação do ovo em condições estéreis, e uma técnica estéril deve ser usado em conformidade. Pré-limpa todos os equipamentos com etanol 70% antes do uso. Em geral, a inoculação e colheita vírus influenza deve ser realizado em um laboratório BSL-2. No entanto, se esse protocolo é usado para propagar muito mais patogênico vírus da gripe (por exemplo, cepas pandêmicas e pré-pandemia, estirpes que representam um perigo para as aves de capoeira e, cepas altamente patogênicas da gripe aviária, o H1N1 estirpe 1918 gado), níveis de biossegurança mais elevadas e em alguns casos, as precauções de biosegurança e autorizações são necessários. O Comitê de Biossegurança Institucional local deve aprovar todas as pesquisas envolvendo o vírus da gripe. 1. Preparação de ovos para a inoculação <ol><li> Obter ovos de aves (SPF) isentos de agentes patogénicos recém-fertilizado de soro de um fornecedor adequado. Tipicamente, os ovos de galinha são utilizados. Os ovos devem ser nósed imediatamente após a chegada. </li><li> Após ovos lugar chegada em uma incubadora de ovos umidificado com uma turner ovo automática para rodar ovos regularmente. Se um turner ovo automática não está disponível, rodar manualmente ovos pelo menos 2-3 vezes por dia (certifique-se de usar luvas e manter tudo tão estéril quanto possível). </li><li> Incubar os ovos a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. </li></ol> 2. Egg Candling <ol><li> Use um candler ovo para examinar o ovo contra a luz em um quarto escuro para verificar os ovos para a infertilidade por candling após cerca de 7 ou 8 dias de incubação. <ol><li> Limpe a candler ovo com etanol 70%. Mudar de luvas frequentemente e desinfectar com etanol a 70% para minimizar o risco de contaminação por agentes patogénicos. </li><li> Retire os ovos da incubadora e colocá-los em caixas de ovos vazias. </li><li> Desligue as luzes na sala. </li><li> Segurar a extremidade mais larga de cada ovo, um de cada vez contra a candler. </li><li> Observar o ovo para determine se é fértil ou estéril. NOTA: os vasos sanguíneos finos que conduzem a um embrião em forma de feijão deve ser claramente visível. Ovos não fertilizados aparece como uma mancha de sangue pequena, com uma gema de ovo visível. </li></ol></li><li> Descartar os ovos que são não fertilizado, e devolver os ovos viáveis ​​para a incubadora. Não deixar ovos fora da incubadora durante mais de 30 min. Se o status de um ovo não pode ser confirmada, marcá-lo e observá-lo mais tarde. </li></ol> 3. Preparação de Vírus Inoculante <ol><li> Diluir stock de virus da gripe e cerca de marco 10-abril 10 pfu / ml em PBS estéril contendo 10 mM de HEPES (pH 7,4). Passo crítico: Diluir a reserva de vírus imediatamente antes da utilização e manter o vírus diluído em gelo durante todo o tempo. </li></ol> 4. Influenza inoculação do vírus através da Route alantóica <ol><li> No dia da inoculação com o vírus (dia 10 ou 11), os ovos novamente vela e eliminar quaisquer embriões mortos. Distinguir embriões vivos porolhando para o movimento no interior do ovo. </li><li> Remova três ovos da incubadora, e organizar os ovos em um suporte em separado com o saco de ar para cima. </li><li> Marque o espaço aéreo dos ovos com um marcador permanente. </li><li> Lava-se a casca de ovo, acima do espaço de ar com etanol a 70%. </li><li> Coloque os ovos com o espaço-se ar em uma caixa de ovos e em uma capa de biossegurança (BSL-2). </li><li> Use uma agulha de 18G estéril para perfurar um pequeno buraco no shell sobre o saco de ar de cada ovo. Tenha cuidado para não inserir a agulha muito profundamente para evitar esfaquear o embrião ou gema. </li><li> Elaborar o vírus influenza diluído em uma estéril seringa de 1 ml e anexar uma agulha 22G. </li><li> Cuidadosamente avançar a seringa com a agulha com um ângulo de na cavidade alantóide de 45 °. </li><li> Injectar 0,2 mL de vírus da gripe diluiu-se. </li><li> Repetir a injecção com os outros dois ovos, e, em seguida, descartar a seringa e agulha. </li><li> Selar o buraco com uma gota de cola de uma pistola de cola (ou cera de parafina derretida). Be cuidado que a cola não vaza dentro do ovo. </li><li> Coloque os ovos de volta para a incubadora de ovos com o espaço aéreo apontou para cima. </li><li> Repita os passos 4,2-4,12 até que todos os ovos foram inoculados. </li></ol> 5. Tempo de Incubação <ol><li> Incubar os ovos infectados sem virar a 37 ° C e ~ 60% de humidade. </li><li> Escolha tempo de incubação óptimo, dependendo do tipo de vírus da gripe. Incubar a influenza A por 48 h; incubar gripe B e C durante 72 h. </li></ol> 6. Vírus da Influenza Colheita <ol><li> Após o período de incubação, refrigerar os ovos a 4 ° C durante um mínimo de 4 h (ou S / N) para matar o embrião e a constrição dos vasos sanguíneos para reduzir o risco de contaminação do fluido alantóico infectado com sangue. Fazer isso para evitar que as células vermelhas do sangue de absorção do vírus, o que reduz o rendimento. Alternativamente, os ovos frio durante 30 min a -20 ° C; no entanto, isso aumenta o risco de contaminação por sangue. </li><li> Depois que os ovos tenham sido suficientemente refrigerados, transferir os ovos para uma capa de biossegurança. Coloque o ovo em um suporte firme com o saco de ar voltada para cima. Limpe a superfície do ovo com etanol 70%. </li><li> Use uma tesoura esterilizada para abrir a casca de ovo por cima do saco de ar. Retire a casca ao redor do saco de ar, tendo o cuidado para não destruir a membrana corioalantóide. </li><li> Abrir a membrana corioalantóica com fórceps estéreis rombas. Gentilmente afastar o embrião e do saco vitelino com uma pequena espátula ou colher. Tome cuidado para não romper a gema. </li><li> Utilizando uma pipeta de Eppendorf de 1 mL, cuidadosamente recolher o fluido alantóico. Se necessário, incline o ovo um pouco para o lado para coletar o máximo possível de líquidos. </li><li> Combina-se o fluido alantóico a partir de todos os ovos em 50 ml de um tubo cónico de plástico. Manter tubos em gelo em todos os momentos durante a colheita de vírus. Um ovo rendimentos de 5 - 10 ml de um fluido de cor ligeiramente amarelada. </li><li> Girar o fluido alantóide que contém o vírus a 1.000 xg durante 10 min a 46; C para sedimentar os detritos. Transferir o fluido límpido para um novo tubo de 50 ml mantido em gelo. Descarte ovos em um recipiente de resíduos BSL-2. </li></ol> 7. Armazenamento <ol><li> Aliquotar imediatamente o líquido alantóico clarificado (por exemplo, 50, 100 ou 500 ul aliquotas) e encaixe por congelação em azoto líquido. Transferir stocks de vírus congeladas a -80 ° C congelador para armazenamento a longo prazo. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
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<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Influenza provoca uma grande carga global de doenças, eo trabalho continua para a compreensão da patogênese da lesão pulmonar 7. Para facilitar a investigação nesta doença mortal, vários métodos têm sido desenvolvidos para propagar o vírus da gripe 6. Aqui, descrevemos uma técnica para produzir vírus influenza em ovos de galinha. A vantagem deste método é que é altamente reprodutível e resulta em grandes quantidades de estoques de vírus de título elevado gripe, o que é muitas vezes necessário p...

Influenza A continua a ser uma grande ameaça para a saúde humana. É uma doença respiratória potencialmente devastador com uma grande carga global causando até 500.000 mortes no mundo anualmente 1. Os vírus da gripe estão na família Orthomyxoviridae e levar de cadeia simples RNA 8 negativas-sense em seu genoma 1,2. A mutabilidade alta (isto é, &quot;deriva&quot; antigénico) do genoma viral impede a imunidade a longo prazo. Além disso, a gripe é cada vez mais resistentes aos medicamentos anti-virais 3. A pandemia de gripe H1N1 2009 em destaque todas as questões desafiadoras associados à doença influenza (estirpe pandémica, a resistência anti-viral, a produção de vacinas em atraso). A formulação da vacina é determinado anualmente pela Organização Mundial de Saúde para as cepas de influenza provavelmente patogênicos (um para cada H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Uma vez que este método é baseado na estirpe da gripe previus, estirpes patogénicas são ocasionalmente incorretamente identificado e eficácia da vacina cai drasticamente. Além disso, o surgimento de novas cepas de influenza pode contornar esses programas preventivos que causam doenças pandêmicas 2. A criação de uma vacina contra a gripe universal tem sido difícil 5. Portanto, a pesquisa deve continuar na compreensão da patogênese da lesão pulmonar. Para pesquisas de laboratório instalação, vários métodos foram desenvolvidos para o isolamento viral e propagação 6. Os vírus influenza humanos pode ser amplificado em uma variedade de substratos de células de mamíferos. No entanto, gerando vírus de título elevado em grandes quantidades são atingidas mais facilmente em ovos embrionados. O protocolo seguinte descreve uma técnica para a propagação de vírus influenza A e armazenamento de stocks de vírus existentes.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ovos de galinha fertilizados sem patógenos (SPF) de soro&nbsp;</td>Incubadora de ovos umidificados <td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>virador de ovos automático</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modelo 3200</td><td></td></tr><tr><td>veleiro de ovos</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modelo 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>agulha 18G</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>agulha 20G / 22G</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Etanol>99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluído a 70% usando pistola de cola de água</td></tr><tr><td>"Ad tech Hi Temp Projeto Pro"</td><td>Tecnologia de anúncios, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Cola modelo 1105</td><td></td></tr><tr><td>"Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>células MDC</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>lavaram glóbulos vermelhos de peru agrupados, 10%</td> <td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

propagação do vírus influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

A infecção por influenza está associada com cerca de 36.000 mortes e mais de 200 mil internações por ano nos Estados Unidos. O surgimento contínuo de novas estirpes do vírus da influenza, devido a mutação e de re-sortido complica o controlo do vírus e necessita o desenvolvimento permanente de novas drogas e vacinas. O estudo baseado em laboratório da gripe requer um método confiável e de custo eficaz para a propagação do vírus. Aqui, um protocolo global prestada para influenza A propagação do vírus em ovos de galinhas férteis, que consistentemente produz stocks virais título elevado. Em breve, isentos de agentes patogénicos (SPF) de ovos de galinha fertilizados de soro são incubadas a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. Durante este período, o desenvolvimento do embrião pode ser facilmente monitorizado utilizando um candler ovo. A inoculação do virus é realizada por injecção de estoque de vírus na cavidade alantóide usando uma agulha. Após 2 dias de incubação a 37 ° C, os ovos sãorefrigeradas durante pelo menos 4 horas a 4 ° C. A casca de ovo de cima do saco de ar e a membrana corioalantóica são então cuidadosamente aberto e o fluido alantóide que contém o vírus é colhido. O fluido é limpa de detritos por centrifugação, aliquotado e transferido para -80 ° C para armazenamento a longo prazo. A grande quantidade (5-10 ml de fluido por ovo contendo vírus) e título de alta vírus quais geralmente são obtidas com este protocolo fez com que o uso de ovos para a preparação de vírus nosso método favorável, em particular, para estudos in vitro que necessitem de grandes quantidades de vírus em que são necessárias doses elevadas da mesma reserva de vírus.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para titular o vírus da gripe. Uma consideração na escolha de um método adequado é que alguns determinar partículas totais, independentemente da viabilidade (por exemplo, o ensaio de hemaglutinina), enquanto outros são baseados em infectividade, que avaliará virions viáveis ​​(por exemplo, teste de placas) 6. Aqui, o título virai de líquido alantóico recolhidas a partir de ovos de galinha inoculados com um vírus da gripe adaptada-rato (A / PR / 8/34) foi...

Ovos férteis de galinha são amplamente utilizados para produzir grandes quantidades de vírus da gripe humana A, pois fornecem um sistema conveniente e econômico para provar altos rendimentos de vírus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir grandes quantidades de um vírus da influenza com alto título, em um sistema economicamente viável. Isso é realizado primeiramente obtendo ovos de galinha frescos e livres de patógenos séricos. Na segunda etapa, os ovos são infectados com o vírus da influenza por meio da raiz alantoica.Por 48 horas, o fluido Alan Toic, que contém o vírus, é então coletado e o vírus é congelado rapidamente em nitrogênio líquido. Por fim, ensaios de placa e de hemaglutinina podem ser realizados para determinar a influência da titulação viral do Alan Toic coletado. A demonstração visual desse método é essencial, pois as etapas de coleta são muito sensíveis e exigem manipulação cuidadosa dos ovos e um bom conhecimento de sua anatomia.Antes de iniciar o procedimento, obtenha ovos de codorna fertilizados e livres de patógenos em soro de um fornecedor adequado. Imediatamente após a chegada, coloque os ovos em uma incubadora de ovos umidificada com um virador automático de ovos para girá-los regularmente a 37 graus Celsius e umidade de 55 a 60% por 10 a 11 dias. Após sete a oito dias de incubação, utilizando luvas desinfetadas com etanol a 70%.Limpe um candeeiro de ovos com etanol e transfira os ovos do incubador para as embalagens vazias. Em seguida, desligue as luzes e segure a extremidade maior dos ovos, um de cada vez, contra o candeeiro. Se o ovo for fértil, finos vasos sanguíneos levando a um embrião com formato de feijão devem ser claramente visíveis.Se o ovo não estiver fertilizado, será observada uma pequena mancha de sangue com uma gema visível. Em seguida, descarte os ovos não fertilizados e devolva o ovo viável ao incubador. Se o estado de um ovo não puder ser confirmado, marque-o para observação posterior no dia 10 ou 11 após a fertilização e, imediatamente antes do uso, dilua um estoque do vírus da influenza A para um vezes 10 à terceira até 10 à quarta PFU por mililitro em PBS estéril suplementado com hippies e coloque-o no gelo.Em seguida, examine novamente cada ovo e elimine os embriões imóveis e mortos. A seguir, retire três ovos da incubadora e organize-os em um suporte separado. Com as câmaras de ar voltadas para cima, marque a região da câmara de ar dos ovos com uma caneta permanente.Em seguida, lave a região acima do espaço aéreo com etanol 70% e transfira os ovos com o espaço aéreo voltado para cima para uma bandeja de ovos dentro de uma cabine de segurança biológica de nível dois. Agora, use uma agulha estéril de calibre 18 para fazer um pequeno orifício na casca sobre a bolsa de ar de cada ovo. Tendo o cuidado de não inserir a agulha muito profundamente, para evitar perfurar o embrião ou a gema.Em seguida, aspire o vírus da gripe diluído para dentro de uma seringa estéril de um mililitro. Acople uma agulha de calibre 22 e avance cuidadosamente a agulha num ângulo de 45 graus até a cavidade alantoide do primeiro ovo. Injete 0,2 mililitros do vírus diluído no ovo e, após injetar os outros dois ovos, descarte a seringa e a agulha, selando cada orifício com uma gota de cola proveniente de um bastão de cola quente.Tomando cuidado para que a cola não vaze para dentro do ovo e, em seguida, coloque os ovos de volta na incubadora. Após todos os ovos terem sido inoculados, incube os ovos infectados a 37 graus Celsius e 60% de umidade sem virá-los, pelo tempo de incubação ideal. Dependendo do tipo de vírus da influenza.Após o período de incubação, refrigere os ovos por um mínimo de quatro horas a quatro graus Celsius para matar o embrião e contrair os vasos sanguíneos. Quando os ovos estiverem suficientemente refrigerados, transfira-os para uma cabine de segurança biológica e um suporte firme, e limpe as superfícies dos ovos com etanol 70%.Em seguida, use uma tesoura estéril para abrir a casca do ovo acima do saco de ar do primeiro ovo. Remova a casca ao redor do saco de ar, tomando cuidado para não danificar a membrana corioalantoide.Em seguida, utilize pinças rombas estéreis para abrir a membrana coriônica de Alan Toic e delicadamente afaste o embrião e o saco vitelino com uma pequena espátula ou colher, tomando cuidado para não romper a gema. A seguir, com uma pipeta de um mililitro einor, colete cuidadosamente o fluido de Alan Toic, inclinando o ovo para o lado para recolher o máximo de fluido possível, conforme necessário. Cada ovo deve fornecer entre cinco e 10 mililitros de fluido levemente esverdeado-amarelado à medida que cada ovo é colhido.Reúna o fluido alantoico em tubos cônicos plásticos de 50 mililitros sobre gelo. Quando todo o fluido tiver sido coletado, centrifugue o vírus e transfira o fluido claro para um novo tubo de 50 mililitros mantido no gelo. Por fim, descarte os ovos em um recipiente de resíduos BSL 2 e proceda imediatamente à clarificação do fluido alantoico.Em seguida, congele rapidamente o vírus em nitrogênio líquido e coloque as hastes congeladas em um freezer a -80 graus Celsius. Para armazenamento de longo prazo, a infecção pelo vírus da influenza causa um efeito citopático que resulta em zonas circulares de células lacunares ou placas que se formam em uma monocamada de células. Neste experimento, as placas foram visualizadas por meio da coloração das células com violeta cristal e 65 placas foram contadas no poço com a diluição de vírus de um vezes 10 à potência de menos 12, porque 500 microlitros do estoque viral diluído foram cultivados sobre as células.Neste experimento, o título final foi de 1,3 vezes 10 à 14ª PFU por mililitro. O ensaio de hemaglutinação é um método para titulação do vírus da influenza baseado na capacidade do vírus de se ligar à superfície das hemácias. Como observado, a suspensão viral aglutina as hemácias, impedindo que elas sedimentem fora da suspensão.Um resultado claramente negativo foi observado com uma diluição de dois elevado a menos 10 do vírus em 50 microlitros. Portanto, o título final é 2,1 vezes 10 à quarta HAU por mililitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como propagar o vírus da influenza inoculando ovos de galinha e coletando o fluido amniótico contendo o vírus.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

A infecção concomitante com o vírus influenza A é um dos fatores implicados na indução de doença pneumocócica invasiva durante...

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar variantes de escape de anticorpos monoclonais neutralizantes do vírus influenza. A suspensão do vírus neutralizado por anticorpos é injetada em ovos de galinha embrionados para propagar variantes de escape seletivamente. Isso resulta em uma população de vírus predominantemente de variantes de escape, confirmada por meio de um ensaio de hemaglutinação.

Geração de variantes de escape do vírus influenza contra anticorpos neutralizantes

O vídeo mostra um método para criar vírus influenza recombinantes adaptados ao frio. Envolve a transfecção de células humanas com plasmídeos bidirecionais, seguida de incubação em incubação de temperatura mais baixa para produzir vírus adequados para a produção de vacinas, caracterizada por replicação reduzida em condições mais quentes.

Geração de vírus influenza vivos atenuados recombinantes para vacinas

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Aqui, fornecemos um método para alcançar a transfecção estável de parasitas de frango Eimeria por nucleofecting esporozoitas ou merozoitas de segunda geração. Parasitas eimerianos geneticamente modificados expressando genes antigênicos heterologous poderiam ser usados como veículos de entrega de vacinas.

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente &gt; 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.

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Este método mostra o embrião de galinha como um modelo in vivo simples e econômico para reviver o patógeno bacteriano L. monocytogenes de um estado viável, mas não cultivável (VBNC) e com potenciais usos adicionais na compreensão dos mecanismos de dormência bacteriana.

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