Name: Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a registrar respostas pós-sinápticas em neurônios de retina de camundongo adaptados ao escuro usando técnicas de patch clamp. Este método permite identificar morfologicamente as células registradas.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund e subsídios RPB.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Wayne. 1. Preparação de Solução Experimental <ol><li> Preparar a solução de dissecção de 1 dia a 1 semana antes da experiência real. Use uma solução tampão HEPES para dissecção da retina devido à sua forte capacidade de tamponamento em temperaturas mais baixas 16. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 de CaCl2, 1,0 de MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Manter a solução no frigorífico até 1 semana. </li><li> A solução de gravação é o meio de Ames &quot;, o qual é um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) concebido para preparações da retina 17. No dia da experiência, pesam-se pó de Ames (4,4 g por 500 ml de solução) num tubo. Além disso, pesam-se NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solução) e misturar com o Apó &#39;mes. </li><li> Preparar a solução pipeta intracelular para gravações de patch clamp pelo dia do experimento. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 111 K-gluconato, 1.0 CaCl2, 10 de HEPES, 1,1 de EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 de ATP-Mg, 1,0 e GTP-Na. Ajustar o pH para 7,2 com KOH. Filtra-se a solução da pipeta com um filtro de seringa convencional. Faça ~ 500 mL alíquotas e armazená-los em um freezer ou congelador. </li></ol> 2. Preparação para o Dia da Experiência <ol><li> A noite antes do experimento, coloque um rato em uma gaiola (C57BL / 6J ou fundo semelhante, 4-8 semanas de idade, do sexo masculino) em um espaço escuro para O / N adaptação ao escuro. </li><li> Preparação para dissecção: <ol><li> Encha solução de dissecação (100-200 ml) num copo de vidro, colocá-lo em gelo, e com bolha de oxigénio durante pelo menos 10 min. </li><li> Comece a oxigenação da caixa escura para armazenamento de preparação da retina. </li><li> Prepare lamelas de plástico com trilhos de graxa para repreparações fatia Tinal e coloque cada um deles em um 35 milímetros de plástico prato. </li><li> Coloque uma nova lâmina de barbear para um helicóptero (fatiador de tecidos). </li><li> Cortar uma membrana de filtro em duas metades. Isto é para o corte da retina. </li><li> Alinhar as ferramentas de dissecação e pipetas de transferência de perto o microscópio de dissecação. A área de trabalho deve ser bem organizado para que cada ferramenta pode ser facilmente acessado no escuro. </li></ol></li><li> Preparação para as gravações da braçadeira patch: <ol><li> Dissolve-se pó de Ames e NaHCO3 em água destilada (Ames 4,4 g de NaHCO 3 e 0,95 g / 500 ml ddH2O). A forma da bolha de Ames misturado com oxigénio (95% de O2 e 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos enquanto se aquece para um nível de temperatura de gravação (~ 35 ° C). Ajustar o pH a 7,4 com NaHCO3 enquanto ainda borbulhante. </li><li> Descongele a solução pipeta interna durante a dissecção. Depois que ele for descongelado, adicione 0,01% sulforrodamina B para a coloração intracelular. </li></ol></li></ol> 3. Retinal Dissection <ol><li> Em um quarto escuro, eutanásia do mouse usando o dióxido de carbono e pneumotórax bilateral. Depois de 2-3 min de usar o dióxido de carbono, o mouse vai perder a consciência. </li><li> Quando o mouse não responde mais a uma pitada cauda, ​​enuclear rapidamente os olhos e colocá-los em uma solução de dissecação fria em um prato de plástico. Realize o pneumotórax bilateral para garantir a morte do animal. Rapidamente armazenar o olho no prato na caixa escura. Use um visualizador de infravermelho para realizar o procedimento no escuro. NOTA: Como alternativa, o isoflurano, decapitação, ou deslocamento cervical pode ser usado para eutanásia. O método de eutanásia deve seguir as orientações do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e / ou o Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional. </li><li> Em um quarto escuro, ajuste o microscópio de dissecação e iluminação infravermelha. Sob o microscópio, transferir um olho a partir do seu prato num prato plástico 10 centímetros wom a solução arrefecida dissecação. Continuamente bolha de oxigénio através de tubos colocados no fundo do recipiente de plástico. Ajustar o volume de fluxo de modo que não é demasiado baixa, mas assegurar que não é suficientemente elevada para perturbar a dissecção. </li><li> Córnea e do cristalino remoção: <ol><li> Realizar uma incisão na parte superior da córnea com uma faca de micro-cirúrgica. Segurando o nervo óptico no extremo oposto do globo ocular impede o olho de se mover. Estender o corte usando um par de tesouras cirúrgicas. Cortar a córnea com alguns esclera em torno dele. </li><li> Agarre a lente com uma pinça fina e puxe lentamente a lente para fora. Se o vítreo é demasiado pegajoso para remover o cristalino, corpo vítreo cortado com uma tesoura. </li><li> Uma vez que o olho-copo é feito, coloque delicadamente, solução de dissecação oxigenado frio para a ocular com uma pequena pipeta de transferência. NOTA: O globo ocular esvazia rapidamente depois é feita uma incisão na córnea. É importante manter a forma do olho como deformando o olho durante este proprocedimento pode danificar a retina e causar descolamento de retina. </li></ol></li><li> Identificando os lados dorsal e ventral da retina: NOTA: Por causa da distribuição desigual do verde e do ultravioleta (UV) cones 18, a identificação de uma área específica da retina é importante para as gravações de resposta à luz. <ol><li> Identificar a linha que vai do outro lado da taça dos olhos retinal passando perto da cabeça do nervo óptico. Esta linha passa principalmente através do lado ventral do nervo óptico; o lado incluindo o nervo óptico é o lado dorsal, enquanto o outro é ventral 19. Veja este marco claramente sob telespectadores infravermelhos. </li><li> Dependendo da finalidade da experiência, fazer um corte no lado desnecessária. Isto será útil após o isolamento da retina a partir da taça dos olhos. </li></ol></li><li> Remoção Vítreo: <ol><li> Opcionalmente, incubar o olho de taça com hialuronidase (0,5 mg / ml) durante 15 min. </li><li> Retire o vítreo com uma pinça extra-finos. O vítreo é principalmentecolocado no fundo e o bordo exterior do olho de taça. Delicadamente, removê-lo sem tocar ou picar a retina. Como o vítreo pode ser firmemente ligado à ocular, retire com cuidado para evitar o descolamento da retina do olho-cup. Continue a puxar até que nenhuma tensão é sentida. NOTA: Este passo é particularmente importante para dissecar as retina do rato; no entanto, não é um problema para as retinas de outras espécies, tais como o rato ou salamandra. </li></ol></li><li> Isolar a retina do olho-cup. Agarre a esclera e retire com cuidado a retina usando a parte traseira de uma pinça. NOTA: Total de montagem preparações da retina pode ser feita a partir da retina isolada. Faça 3-4 cortes nas bordas e achatar a retina, ou cortar a retina em vários pedaços. </li><li> Apare a retina e descartar a metade desnecessária da retina (passo 3.5). No mesmo prato de plástico, cortado a retina restante em dois pedaços. Para cada pedaço da retina, cortar as bordas para fazer umalaje de retina, e aparar as arestas de dobragem. </li><li> Transferir uma laje da retina numa placa de vidro utilizando uma pipeta de transferência grande (~ 2 ml). Suga-se o excesso de solução com uma pequena pipeta, usar um pedaço de papel de filtro para achatar a placa e, em seguida, colocar rapidamente uma parte da membrana de filtro na parte superior do tecido. <ol><li> Utilizando uma pequena pipeta de transferência, colocar uma gota de solução sobre a membrana de filtro de dissecação. Espera ~ 15 seg, até a solução se espalha através da membrana. Durante este tempo, o tecido da retina vai ficar com a membrana de filtro. </li><li> Despeje solução de dissecação mais frio sob e ao redor do filtro. O tecido da retina com a membrana de filtro irá flutuar. Agarrar a membrana de filtro com uma pinça e colocá-lo na câmara de corte. Despeje solução dissecar sobre o tecido, e armazenar a preparação na caixa escura. NOTA: O procedimento descrito aqui é crítica. É importante realizar estes passos rapidamente para assegurar que as varas de tecido da retina para os filtros de membrana e não seque. </li></ol></li><li> Utilizando um cortador, cortar o tecido da retina em fatias. Cerca de 200 m de espessura é viável para estudos de fixação de membranas. </li><li> Coloque uma lamela de plástico com trilhos de graxa na câmara de corte. Transferir uma fatia da retina em cima dos trilhos de graxa em uma lamela de plástico. Girar a fatia 90 °, de modo que a secção transversal é visível. Pressionar a membrana do filtro para baixo sobre a lamela e, em seguida, cobrir os lados do papel de filtro com graxa. <ol><li> Após a fatia é imobilizada em uma lamela de plástico, pegue a lamela e transferi-lo para a 35 mm plástico prato. Despeje solução de dissecação fria sobre o preparo da retina e mergulhe a preparação. Armazenar cada prato na caixa escura, a qual deve ser continuamente oxigenado. NOTA: Todo o procedimento precisa ser feito com cuidado para que a membrana do filtro não está deformado. Caso contrário, a fatia da retina facilmente se separa da membrana de filtro. </li></ol></li></ol><ol><li> Gravação de preparação: <ol><li> Prime os tubos de perfusão com meio Ames &#39;. Permitir que todas as bolhas para atravessar ao encher a tubulação. </li><li> Faça pipetas de gravação patch clamp com um puxador. Para preencher uma pipeta com a solução de pipeta, mergulho na parte traseira de uma pipeta de 1 min até a ponta da pipeta é aterrado. Em seguida, encher ~ 1/3 da pipeta usando um material de enchimento de micro-pipeta. Guarde cada pipeta em uma caixa de pipeta úmido. </li><li> Ligue o equipamento para gravações de patch clamp; incluindo o computador, amplificador, câmera CCD, e microscópio. </li></ol></li><li> Desligue a luz da sala. Coloque uma preparação fatia da retina para a câmara de platina do microscópio usando um visualizador de infravermelho. Depois é imobilizado, começar a perfusão contínua. Regule a temperatura de perfusão em 33 a 37 ° C. </li><li> Ver a superfície da fatia com a câmera CCD. Concentre-se no local de destino onde o ce-alvotipos ll residem. Selecione uma célula de aparência saudável para correção de gravação grampo (ou seja, ele deve ter a superfície lisa para o futuro e uma forma da célula bom). </li><li> Coloque uma pipeta de gravação num suporte pipeta. Avança a pipeta para a preparação fatia. Quando se está perto da preparação fatia (~ 2 milímetros acima), encontrar a ponta da pipeta com o microscópio. Uma vez que a ponta da pipeta é visível ao microscópio, mover a ponta para baixo para a célula alvo. </li><li> Defina o amplificador. Ajustar a pipeta a 0 mV / 0 pA (zeroing) e iniciar um pulso elétrico contínuo de ~ 5 mV em ~ 10 Hz. Verificar a resistência pipeta; resistência ideal é entre 5 e 10 mohms para a maioria dos neurônios da retina. </li><li> Comece soprando para fora da ponta. Usar um bocal, ou utilizar uma seringa, para aplicar pressão positiva quando a pipeta mergulha na solução de banho. Continuamente soprar a solução interna até que a ponta está localizada na superfície da célula alvo. <ol><li> Quando a pressão positiva faz uma pequena covinha no thsuperfície celular e, avançar a ponta ligeiramente e parar de soprar. Verificar a resistência pipeta, que deve aumentar. Se ele está aumentando continuamente, deixá-lo e monitorar a resistência até que ele atinja&gt; 1 GÊ (gigaseal). Se a resistência não aumenta de forma espontânea, aplique suavemente pressão negativa até que se torne um gigaseal. </li></ol></li><li> Após a gigaseal é conseguido, mudar o potencial de manutenção de -70 mV. Em seguida, aplicam-se de forma intermitente de pressão negativa para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de célula inteira é feita, a resistência pipeta pode estar entre 500 e 1 GÊ mohms, e a corrente capacitiva é visto. Às vezes, as correntes pós-sinápticos espontâneas podem ser observados. </li><li> Grave a relação IV de -80 a +40 mV. Diferentes tipos de canais dependentes da voltagem são activados dependendo do tipo de célula. </li><li> Grave luz evocou-correntes sinápticas ou tensões. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Boas gravações só podem ser alcançadas com boas preparações de retina e configurações de patch clamp bem projetadas. Embora todas as etapas descritas acima sejam importantes, a discussão destaca algumas etapas críticas tanto para a dissecação quanto para as gravações. 
Para dissecação, duas coisas são especialmente importantes: resfriamento e oxigenação. Depois de enuclear o olho, remova rapidamente a parte frontal do olho em uma câmara de dissecação com solução de dissecação resfriada com bol...

A retina é uma das partes únicas do sistema nervoso. Como uma parte acessível do cérebro, sua arquitetura sináptica foi bem caracterizada. Além disso, as funções dessa rede neural podem ser examinadas com um estímulo fisiológico: a luz. Se o tecido da retina for isolado em uma sala escura com procedimentos apropriados, os neurônios do tecido responderão à luz. Esta preparação tem sido usada para estudar o processamento de sinais visuais e elucidar vários mecanismos sinápticos e funções de redes neurais, bem como mecanismos de doenças. 
As respostas à luz nos neurônios da retina foram registradas por décadas. Os primeiros estudos usaram eletrodos afiados para fazer gravações intracelulares deneurônios retinianos 1. Na década de 1980, a técnica de patch clamp foi inventada2 e logo se tornou um método popular entre os pesquisadores da visão3,4. Gravações de células únicas de vertebrados inferiores, incluindo neurônios retinianos de filhotes e peixes, foram métodos populares que contribuíram para a elucidação dos mecanismos de processamento de sinais visuais5,6. 
Depois que as técnicas de mutação genética foram desenvolvidas, a retina do camundongo tornou-se um modelo mais popular para pesquisadoresda visão 7-9. A retina dos mamíferos é mais atraente do que a dos vertebrados inferiores porque está evolutivamente mais próxima da retina humana e há uma oportunidade de usar modelos de doenças. No entanto, as células da retina de camundongos são pequenas e frágeis10, e fazer preparações retinianas e realizar gravações de patch clamp em uma sala escura é um desafio. À medida que a tecnologia melhorou, diversas abordagens tornaram-se disponíveis para estudar os mecanismos de sinalização visual, como estudos de imagem11 e o eletrorretinograma (ERG) 12. No entanto, o registro de célula única com o método patch clamp ainda é importante porque é altamente sensível temporal e espacialmente em comparação com outros métodos. Portanto, conduzimos continuamente registros de patch clamp e melhoramos nossos métodos para investigar o processamento de sinais visuais em preparações de fatias de retina de camundongos13-15.
Neste tutorial em vídeo, os protocolos são apresentados com dicas importantes. Boas gravações só podem ser alcançadas com uma boa preparação. Praticar a dissecação de animais e construir um equipamento de grampo de remendo resistente permitirá que a maioria dos pesquisadores obtenha gravações bem-sucedidas.

<table><tbody><tr><td>Camundongos (28-60 dias de idade, macho)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J cepa</td><td></td></tr><tr><td>Ames 'pó médio</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Ferramenta de dissecação: fórceps</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Ferramenta de dissecação: tesoura</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excelente</td></tr><tr><td>Ferramenta de dissecação: faca de cirurgia</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excelente</td></tr><tr><td>lâmina de barbear (para helicóptero)</td> <td>EMS</td><td>71970</td><td>excelente</td></tr><tr><td>helicóptero</td><td>feito à mão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>visualizador infravermelho</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>Mostra uma visão brilhante. Focar objetos pequenos é um problema.</td></tr><tr><td>Extrator</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excelente; faz pipetas de tamanho consistente.</td></tr><tr><td>Caixa escura</td><td>Pelicano</td> caixa <td>escura</td><td>excelente</td></tr><tr><td>sistema de grampo de remendo</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Excelente configuração. A maioria dos componentes-chave está incluída em um pacote. Os micromanipuladores são excelentes.</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excelente e fácil controle.</td></tr><tr><td>Software de aquisição</td><td>Software pClamp da Molecular Devices</td><td></td><td>Excelente e fácil controle.</td></tr><tr><td>Fonte de luz (LED)</td> <td>Cool LED</td><td>pE-2 sistema de 4 canais</td><td>Excelente</td></tr><tr><td>câmera CCD</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excelente</td></tr><tr><td>gaiola de Faraday</td><td>feita à</td><td></td><td></td> mão</tr></tbody></table>

gravação light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em dark-adaptados, preparações da retina do rato fatia usando técnicas grampo patch

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

A retina é a porta de entrada para o sistema visual. Para entender os mecanismos de processamento de sinais visuais, investigamos as funções de rede neurais da retina. Neurónios retinais na rede compreendem numerosos subtipos. Mais do que 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares e células amacrine foram identificadas por estudos morfológicos. Vários subtipos de neurônios da retina são pensados ​​para codificar características distintas de sinalização visual, tais como movimento e cor, e de múltiplas vias neurais. No entanto, os papéis funcionais de cada neurónio no processamento de sinais visuais não são completamente compreendidos. O método de fixação de membranas é útil para abordar esta questão fundamental. Aqui, um protocolo para registrar as respostas sinápticas luz evocados em rato neurônios da retina usando gravações patch clamp em condições de adaptação ao escuro é fornecido. Os olhos de ratinhos são de adaptação ao escuro O / N, e os preparativos fatia da retina são dissecados em um quarto escuro com uma iluminação e visores infravermelhos. A luz infravermelha nãoativar fotorreceptores do mouse e, assim, preserva a sua capacidade de resposta luz. Patch clamp é usada para registrar as respostas leves evocadas em neurônios da retina. Um corante fluorescente é injetado durante as gravações para caracterizar os subtipos morfológicos neuronais. Este procedimento permite determinar as funções fisiológicas de cada neurónio na retina do rato.

Uma preparação fatia representativo é mostrado na Figura 1. A preparação fatia está numa posição direita, que mostra a fotorreceptores células ganglionares em uma superfície plana, sem descolamento do papel de filtro. Se uma fatia é inclinado, apenas uma parte da preparação está em foco, o que torna difícil identificar uma célula apropriado para correção de aperto. Para as gravações, é importante escolher um bom soma, que geralmente tem uma superfície brilhante, uma forma ainda rodada, e não há placas e...

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

O objetivo geral deste experimento é obter gravações de resposta à luz de neurônios retinianos adaptados ao escuro. Isso é realizado primeiramente colhendo um olho de camundongo. O segundo passo é isolar a retina e cortá-la para preparações em fatias.Em seguida, o preparado retiniano é montado e visualizado em um microscópio para localizar uma célula-alvo para gravações por patch clamp. Após estabelecer uma configuração de patch clamp de célula inteira, um estímulo luminoso é aplicado nas proximidades da célula. Por fim, a resposta eletrofisiológica simultânea pode ser observada por meio de um software de aquisição.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imagem KRC, é que a sensibilidade da gravação é alta e que as células gravadas podem ser identificadas morfologicamente. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque trabalhar no escuro total pode ser difícil e desorientador para quem não está acostumado. Para iniciar um procedimento, posicione as ferramentas de dissecação e as pipetas de transferência próximas ao microscópio estereoscópico.A área de trabalho estará bem organizada para que cada ferramenta possa ser facilmente acessada no escuro. Quando estiver pronto, utilize um visor de infravermelho para realizar o procedimento no escuro. Após a eutanásia, enucleie rapidamente os olhos e coloque-os em uma placa com solução de dissecção fria, mantida dentro de uma caixa escura, trabalhando sob um microscópio.Transfira um olho para uma placa com solução de dissecação fria, continuamente borbulhada com oxigênio. Para remover a córnea e o cristalino, segure o nervo óptico na extremidade oposta do globo ocular para impedir seu movimento e faça uma incisão no topo da córnea com uma lâmina microcirúrgica.Estenda o corte usando uma tesoura cirúrgica e remova a córnea, deixando parte da esclera ao seu redor. Em seguida, segure a lente com pinça fina e puxe-a lentamente. Uma vez formado o copo ocular, despeje suavemente solução de dissecção oxigenada e fria no copo ocular com uma pipeta de transferência pequena.Trabalhe rapidamente para manter a forma da retina e use pressão suave para identificar os lados dorsal e ventral da retina. Utilize visores de infravermelho para identificar a linha que atravessa a cúpula ocular da retina, passando próximo ao disco do nervo óptico. Esta linha atravessa principalmente o lado ventral do nervo óptico, e o lado que inclui o nervo óptico é o lado dorsal.Dependendo do experimento, faça um corte no lado ventral ou dorsal. Isso marca o lado desnecessário e é um marcador útil para os passos seguintes. Em seguida, remova cuidadosamente o vítreo com pinças extrafinas sem tocar na retina.O vítreo está principalmente aderido à base e à borda externa da cúpula ocular. Como o vítreo pode estar firmemente aderido à cúpula ocular, proceda com cuidado para remover o descolamento da retina. Continue puxando até que nenhuma tensão seja sentida.Uma vez isolada a retina, segure a esclera e delicadamente desprenda a retina. Usando o lado traseiro da pinça, corte a retina e descarte a metade desnecessária no mesmo recipiente de plástico. Corte a retina restante em dois pedaços, um para cada peça.Corte as bordas para formar um bloco retiniano e aparar as bordas dobradas. Em seguida, utilize uma pipeta de transferência grande para transferir um bloco retiniano para uma placa de vidro. Aspire a solução em excesso com uma pipeta pequena e use um pedaço de papel-filtro para aplainar o bloco.Coloque suavemente um pedaço da membrana de filtro sobre o tecido utilizando uma pipeta de transferência pequena. Coloque uma gota da solução de dissecação sobre a membrana de filtro. Aguarde cerca de 15 segundos enquanto a solução se espalha e adere o tecido retiniano à membrana de filtro.Uma vez colados, despeje mais solução de dissecação fria sob e ao redor do filtro até que a membrana flutue. Em seguida, coloque a membrana do filtro na câmara de corte e cubra com solução de dissecação. Trabalhando rapidamente para garantir que a membrana não seque, use o cortador para seccionar o tecido retiniano em fatias.Coloque uma lamínula de plástico com trilhos de graxa na câmara de corte. Transfira uma fatia de retina sobre os trilhos de graxa e gire a fatia 90 graus para que a seção transversal fique visível. Pressione a membrana de filtro contra a lamínula antes de cobrir as laterais do papel filtro com graxa.Após os cortes serem imobilizados em uma lâmina de plástico, transfira-a para um recipiente plástico de 33 milímetros. Mergulhe o preparo em solução de dissecção com carvão e armazene cada recipiente em uma caixa escura que seja continuamente oxigenada. Para gravações de patch clamp.Prime os tubos de perfusão com meio aims e deixe todas as bolhas saírem da tubulação. Após confeccionar as pipetas de gravação com um puxador de vidro, preencha a ponta com solução para pipeta. Em seguida, utilize um pipetador micro para encher cerca de um terço da pipeta; uma vez preenchida, guarde cada pipeta em uma caixa de pipetas úmida.Em seguida, ligue o equipamento para gravações de placa de plantas, incluindo o computador, amplificador, câmera CCD e microscópio funcionando em condições escuras. Coloque uma preparação de fatia retiniana na platina do microscópio com a ajuda de um visor de infravermelho. Após sua imobilização, inicie a perfusão contínua.Defina a temperatura de perfusão entre 33 e 37 graus Celsius. Visualize a superfície da fatia com uma câmera CCD. Foque no local-alvo.Com os tipos celulares-alvo localizados, selecione uma célula com aparência saudável para uma gravação por patch clamp. Após identificar uma célula saudável, coloque uma pipeta de gravação em um suporte de pipeta e avance a pipeta até a preparação do corte. Quando estiver próxima à preparação do corte, localize a ponta da pipeta com um microscópio.Uma vez que a ponta da pipeta esteja visível sob o microscópio, mova a ponta em direção à célula-alvo. Em seguida, configure o amplificador e ajuste a pipeta no pika amp. Cinco volts por nanoampère.Inicie um pulso elétrico contínuo de aproximadamente cinco milivolts e aproximadamente 10 hertz e verifique a resistência da pipeta. Uma resistência ideal está entre cinco e 12 megaohms. Para a maioria dos neurônios retinianos.Quando pronto, use uma peça bucal ou seringa para expelir a solução interna até que a ponta da pipeta esteja sobre a superfície da célula-alvo. Quando a pressão positiva formar uma pequena depressão na superfície da célula, avance levemente a ponta e pare de expelir. Se a resistência da pipeta estiver aumentando continuamente, mantenha-a nessa posição e monitore a resistência até que atinja mais de um gigaohm.Se a resistência não aumentar espontaneamente, aplique suavemente pressão negativa até que se forme um selo giga. Após a obtenção do selo giga, altere o potencial de retenção para menos 70 milivolts e, em seguida, aplique intermitentemente pressão negativa para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de célula inteira for estabelecida, a resistência da pipeta pode variar entre 500 megaohms e um gigaohm, e a corrente capacitiva é observável.Registre a relação IV de menos 80 a 40 milivolts. Diferentes tipos de canais ativados por voltagem serão ativados dependendo do tipo celular. Por fim, registre correntes ou tensões sinápticas evocadas pela luz.Essa preparação de fatia observada em 10 x mostra tanto fotorreceptores quanto células ganglionares, sem descolamento do papel filtro. Quando essa preparação é observada com uma objetiva de 60 x, cada camada celular é claramente visualizada. Potenciais pós-sinápticos excitatórios evocados pela luz em neurônios da retina foram induzidos em resposta a um estímulo luminoso em degrau.A amplitude de pico e o tempo de decaimento variam conforme o tipo e subtipo celular. O tipo celular e seu subtipo morfológico foram revelados por marcação com enxofre após as gravações fisiológicas, após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para que cientistas na área de pesquisa da retina estudassem as funções da sinalização visual natural, bem como as contribuições dos mecanismos sinápticos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Este vídeo demonstra uma técnica de patch-clamp de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana. Uma pipeta de vidro fina com um eletrodo é usada para abordar as células amácrinas starburst (SACs) dentro da retina. Depois de formar uma vedação, a sucção é aplicada para romper a membrana e formar a configuração de patch clamp de célula inteira. Finalmente, o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC é medido usando a configuração.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

O vídeo demonstra um protocolo para estudar interações sinápticas e respostas neuronais em uma fatia de cérebro de hipocampo de camundongo transfectado. Envolve iluminar neurônios sensoriais de longo alcance para desencadear potenciais de ação e registrar os potenciais pós-sinápticos excitatórios resultantes no neurônio registrado usando a técnica de patch-clamp de célula inteira.

Fotoestimulação e gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios em fatias de hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra a gravação de respostas pós-sinápticas evocadas por luz em uma preparação de corte de tecido retiniano de camundongo adaptado ao escuro. A fatia da retina é colocada em uma câmara de gravação e uma pipeta de gravação é usada para estabelecer a continuidade elétrica com uma célula ganglionar da retina. Pulsos de luz são aplicados para gerar potenciais pós-sinápticos excitatórios nas células ganglionares, que são registrados pela pipeta.

Respostas pós-sinápticas evocadas por luz em neurônios de fatias de retina de camundongos

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

Aprenda a registrar respostas pós-sinápticas em neurônios de retina de camundongo adaptados ao escuro usando técnicas de patch clamp. Este método permite identificar morfologicamente as células registradas.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch (Vídeo) | JoVE Journal

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

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