Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

O objetivo geral deste experimento é obter registros de resposta à luz de neurônios retinianos adaptados ao escuro. Isso é feito primeiro colhendo um olho de rato. O segundo passo é isolar a retina e cortá-la para preparações de fatias.

Em seguida, a preparação da retina é montada e visualizada em um microscópio para encontrar uma célula-alvo para gravações de patch clamp. Depois de estabelecer uma configuração de patch clamp de célula inteira, um estímulo de luz é aplicado nas proximidades da célula. Finalmente, como a resposta eletrofisiológica simultânea pode ser observada através de software de aquisição.

A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes, como a imagem KRC, é que a sensibilidade de gravação é alta e que as células de gravação podem ser identificadas morfologicamente. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque trabalhar na escuridão total pode ser difícil e desorientador para aqueles que não estão acostumados a fazê-lo. Para iniciar um intervalo, as ferramentas de dissecação e pipetas de transferência perto do microscópio de dissecação.

A área de trabalho será bem organizada para que cada ferramenta possa ser facilmente acessada no escuro. Quando estiver pronto, Dawn um visualizador infravermelho para realizar o procedimento no escuro. Após a eutanásia, desnude rapidamente os olhos e coloque-os em um prato de solução de dissecação fria, mantido em uma caixa escura trabalhando sob um microscópio.

Transfira um olho para um prato com uma solução de dissecação fria. Continuamente borbulhou com oxigênio. Para remover a córnea e o cristalino, segure o nervo óptico na outra extremidade do globo ocular para evitar que ele se mova e faça uma incisão na parte superior da córnea com uma faca microcirúrgica.

Estenda o corte usando uma tesoura cirúrgica e remova a córnea, deixando um pouco de esclera ao redor. Em seguida, pegue a lente com uma pinça fina e puxe-a lentamente para fora. Uma vez feita a ocular, despeje suavemente a solução de dissecação oxigenada fria na ocular com uma pequena pipeta de transferência.

Trabalhe rapidamente para manter a forma da retina e use uma leve pressão para identificar os lados dorsal e ventral da retina. Use visores infravermelhos para identificar a linha que atravessa a ocular da retina, passando perto da cabeça do nervo óptico. Esta linha passa principalmente pelo lado ventral do nervo óptico e o lado, incluindo o nervo óptico, é o lado dorsal.

Dependendo do experimento, faça um corte no lado ventral ou dorsal. Isso marca o lado desnecessário e é um marcador útil no futuro. Em seguida, remova suavemente o vítreo com uma pinça extra fina sem tocar na retina.

O vítreo está principalmente ligado à parte inferior e à borda externa da ocular. Como o vítreo pode estar firmemente preso à ocular, proceda suavemente para remover o descolamento de retina. Continue a puxar até que nenhuma tensão seja sentida.

Assim que a retina estiver isolada, pegue a esclera e retire suavemente a retina. Usando a parte de trás da pinça, apare a retina e descarte a metade desnecessária no mesmo prato de plástico. Corte a retina restante em dois pedaços para cada pedaço.

Corte as bordas para fazer uma laje de retina e apare as bordas dobráveis. Em seguida, use uma pipeta de transferência grande para transferir uma placa de retina para uma placa de vidro. Sugue o excesso de solução com uma pipeta pequena e use um pedaço de papel de filtro para achatar a placa.

Coloque suavemente um pedaço da membrana do filtro em cima do tecido usando uma pequena pipeta de transferência. Coloque uma gota de solução de dissecação na membrana do filtro. Aguarde cerca de 15 segundos enquanto a solução se espalha e adere o tecido da retina à membrana do filtro.

Depois de grudados, despeje mais solução de dissecação fria sob e ao redor do filtro até que a membrana flutue. Em seguida, coloque a membrana do filtro na câmara de corte e cubra com a solução de dissecação. Trabalhando rapidamente para garantir que a membrana não seque, use o picador para cortar o tecido da retina em fatias.

Coloque uma lamínula de plástico com trilhos de graxa na câmara de fatiar. Transfira uma fatia de retina em cima dos trilhos de graxa e gire a fatia 90 graus para que a seção transversal fique visível. Pressione a membrana do filtro para baixo na lamínula antes de cobrir as laterais do papel de filtro com graxa.

Após as fatias imobilizadas em uma lamínula de plástico, transfira-a para um prato de plástico de 33 milímetros. Mergulhe a preparação com solução de dissecação de carvão e guarde cada prato em uma caixa escura que seja continuamente oxigenada. Para gravações de patch clamp.

Prepare os tubos de profusão com miras médias e permita que todas as bolhas passem do tubo. Depois de fazer pipetas de gravação com um polar de vidro, preencha a ponta com solução de pipeta. Em seguida, use um enchimento de micropipeta para encher cerca de um terço da pipeta, uma vez cheia, armazene cada pipeta em uma caixa de pipeta úmida.

Em seguida, ligue o equipamento para gravações de patches, incluindo o amplificador de computador, câmera CCD e microscópio trabalhando em condições escuras. Coloque uma preparação de corte de retina no microscópio stage com o auxílio de um visualizador infravermelho. Depois de imobilizado, inicie a perfusão contínua.

Defina a temperatura de perfusão para 33 a 37 graus Celsius. Visualize a superfície da fatia com uma câmera CCD. Concentre-se no local de destino.

Com os tipos de célula de destino residem, selecione uma célula de aparência íntegra para uma gravação de patch clat. Assim que uma célula saudável for identificada, coloque uma pipeta de gravação em um porta-pipetas e avance a pipeta para a preparação da fatia. Quando estiver perto da preparação da fatia, encontre a ponta da pipeta com um microscópio.

Quando a ponta da pipeta estiver visível ao microscópio, mova-a para baixo em direção à célula-alvo. Em seguida, defina o amplificador e ajuste a pipeta no pika amp. Cinco volts por amplificador Nana.

Inicie um pulso elétrico contínuo de aproximadamente cinco milivolts e aproximadamente 10 hertz e verifique a resistência da pipeta. Uma resistência ideal é entre cinco e 12 mega ohms. Para a maioria dos neurônios da retina.

Quando estiver pronto, use um bocal ou seringa para soprar a solução interna até que a ponta da pipeta esteja na superfície da célula-alvo. Quando a pressão positiva fizer uma pequena covinha na superfície da célula, avance ligeiramente a ponta e pare de soprar. Se a resistência da pipeta estiver aumentando continuamente, deixe-a e monitore a resistência até atingir mais de um giga ohm.

Se a resistência não aumentar espontaneamente, aplique suavemente pressão negativa até que se torne uma giga vedação. Depois que a vedação giga for alcançada, altere o potencial de retenção para 70 milivolts negativos e, em seguida, aplique pressão negativa intermitentemente para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando toda a configuração da célula é feita, a resistência da pipeta pode estar entre 500 mega ohms e um giga ohm, e a corrente capacitiva é observável.

Registre a relação IV de menos 80 a 40 milivolts. Diferentes tipos de canais fechados de tensão serão ativados dependendo do tipo de célula. Por fim, registre correntes ou tensões sinápticas evocadas pela luz.

Esta preparação de fatia vista em 10 x mostra fotorreceptores e células ganglionares sem descolamento do papel de filtro. Quando esta preparação é visualizada com uma objetiva de 60 x, cada camada de célula é claramente observada. Os potenciais pós-sinápticos excitatórios evocados pela luz dos neurônios da retina foram evocados em resposta a uma luz de degrau.

A amplitude de pico e o tempo de decaimento variam dependendo do tipo e subtipo de célula. O tipo celular e seu subtipo morfológico foram revelados pela marcação com enxofre após registros fisiológicos após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para os cientistas no campo da pesquisa da retina estudarem as funções da sinalização visual natural, bem como as contribuições dos mecanismos sinápticos.