Name: Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS/MS para monitoramento terapêutico de drogas. Este método minimamente invasivo facilita a coleta de amostras por pacientes.

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Este trabalho foi apoiado pelo contrato da Federal Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos HHSF223201310224C e pelo United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Amostras de sangue identificadas-de de indivíduos saudáveis ​​eram do Hospital da Universidade de Colorado (Aurora, Colorado). O uso de amostras de banco de sangue identificou-de para estudos de validação, bem como para a preparação dos calibradores e amostras de controle de qualidade foi considerada &quot;isentos&quot; pelo Conselho Colorado Multi-institucional Análises (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Preparação de Referências e Soluções <ol><li> Tacrolimus compra e do padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus a partir dos fornecedores listados na Lista de Materiais. <ol><li> Preparar soluções de reserva em metanol puro a uma concentração de 1 mg / ml para o tacrolimus e uma concentração de 10 ug / ml de D 2, 13 C-tacrolimus. Faça soluções de estoque de materiais de referência com base em três ponderações independentes. Soluções de banco de alíquotas e armazenar a -70 ° C ou abaixo. </li></ol></li><li> Solução para precipitar proteínas Preparee extrair o tacrolimus usando metanol / 0,2 M ZnSO 4 em água (7: 3, v: v). Esta solução também contém o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, a uma concentração de 2,5 ng / ml e foi utilizado para a extracção de todas as amostras, excepto para a extracção de amostras em branco (por favor ver 1.3.3). <ol><li> Prepara-se esta solução a precipitação da proteína de fresco em cada dia de extracção e definir a expiração da solução a 12 h. </li></ol></li><li> Preparação da curva de calibração e de controlo de qualidade (QC) amostras <ol><li> Preparar soluções estoque de tacrolimus através da realização de diluições apropriadas da solução utilizando metanol puro. </li><li> Para preparar os calibradores e as amostras de controlo de qualidade, pico de 20 ul de solução de reserva apropriadamente diluídas em EDTA sangue total, incuba-se a 37 ° C sob agitação suave num banho de água para permitir uma distribuição homogénea do tacrolimus para os componentes celulares do sangue durante 20 min e alíquota em 1,5 ml de pólipotubos ropylene com fundo cônico e snap-on tampas. Assegure-se que o volume relativo de solvente orgânico não exceda 5%. </li><li> Mancha 50 ul de sangue inteiro cravado no meio de cada círculo sobre os cartões de filtro, utilizando uma pipeta. </li><li> Secam-se as manchas de sangue em placas de filtro, à TA durante 3 h. </li><li> Preparar padrões de calibração de tacrolimus no sangue humano total com EDTA, em concentrações de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 ng / ml. Prepare uma amostra em branco para a extração de como os padrões de calibração com a solução de precipitação de proteínas contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;amostra zero&quot;). </li><li> Preparar amostras QC em sangue humano total com EDTA, em concentrações de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Prepare uma amostra em branco. Em contraste com as amostras de CQ que são extraídos com precipitação contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, extrair esta amostra em branco com uma solução de precipitação de proteínas que faznão contêm o padrão D interno 2, 13 C-tacrolimus (&quot;amostra em branco&quot;). </li></ol></li><li> Recolha de amostras clínicas <ol><li> Recolha manchas de sangue seco como descrito no 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Extração de Tacrolimus secas amostras de sangue <ol><li> Inspecione visualmente a mancha de sangue seco para garantir a qualidade da amostra aceitável eo volume 45. </li><li> Soco centro da mancha de sangue no cartão de filtro com uma perfuração de 6 mm. Nota: A qualidade dos perfuradores pode ser monitorizada por pesagem. Um disco de filtro saturado perfurado pesa em média 5,02 mg ± 0,09 mg (intervalo: 4.83- 5,14 mg, n = 12). </li><li> Coloque os discos em tubos de 1,5 ml de polipropileno com cônico fundo e tampas snap-on. </li><li> Adicionar 20-30 balas para cada tubo. </li><li> Adicionar 500 ul da solução de precipitação de proteína (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7: 3, v: v, com 2,5 ng / ml como padrão interno) para cada tubo. Para o extração de amostras em branco, usar a solução de precipitação de proteínas sem a referência interna. </li><li> Homogeneizar os discos no liquidificador bala por 1 min (velocidade máxima, a configuração &quot;10&quot;). </li><li> Agitar à TA amostras em vórtex multi-tubos (velocidade máxima, a configuração &quot;10&quot;) durante 10 min. </li><li> Centrifugar as amostras a 16.000 xg e 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transfira os sobrenadantes para frascos de HPLC de vidro equipado com uma inserção de 300 ul. Utilizar vedações teflon pré-fenda. Nota: Extraiu-se as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou abaixo até a análise por LC-MS / MS. </li></ol> 3. LC-MS / MS Análise <ol><li> Carga de 100 ul do sobrenadante da amostra extraída para a coluna de extracção de cartucho C8 e lava-se com uma proporção de 7: 3 de ácido fórmico a 0,1% em água: acetonitrilo a um caudal de 5 ml / min durante 1 min. As ligações da válvula de comutação são apresentados na Figura 2 e o gradiente executado pela bomba de extracção na Tabela 1 </strong&gt;. </li><li> A partir de agora, ativar a válvula de comutação resultando em back-resplendor dos analitos da pré-coluna para a coluna analítica. </li><li> Regule o termostato de coluna a 65 ° C. </li><li> Eluir os analitos a partir da coluna analítica utilizando as taxas de fluxo e o gradiente mostrados na Tabela 1. </li><li> Ligue a coluna analítica a um espectrômetro de massa em tandem através da fonte de ionização electrospray turbo. Ajustar os parâmetros-chave do espectrômetro de massa de acordo com a Tabela 2. </li><li> Detectar iões positivos ([M + Na] +) no modo de reacção múltipla (MRM). Use as seguintes transições íon para quantificação: tacrolimus: m / z (massa / carga) = 826,6 → 616,2 e D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Nota: O tempo total de execução é de 4,6 min. </li></ol> 4. Quantificação <ol><li> Para cada prazo, gerar uma curva de calibração com base nos calibradores preparados em 1.3.5 eincluir em cada corrida analítica. <ol><li> Gerar uma curva de calibração locando as concentrações nominais contra o factor de resposta de analito (Peak Área [Analyte] / Área de Pico [padrão interno]) usando o software espectrômetro de massa. </li><li> Encaixe os calibradores usando um ajuste quadrático em combinação com 1 / X ponderação. </li></ol></li><li> Para tacrolimus quantidade nas manchas de sangue seco integrar o tacrolimus e picos do padrão interno nos cromatogramas MRM extraídos. Calcular o factor de resposta para o tacrolimus (área do pico [Analito] / área de pico [padrão interno]) e comparar com a curva de calibração utilizando o software de espectrometria de massa. </li></ol> Procedimentos de validação 5. <ol><li> Lower limite de detecção (LLOD) e limite inferior de quantificação (LIQ). <ol><li> Considere o menor concentração de tacrolimus com uma relação de pico-para-ruído de 4: 1, como o limite inferior de detecção (LLOD). Definir o limite inferior de quantificação (LIQ) como oconcentração mais baixa da curva de calibração com uma precisão igual ou melhor do que ± 20% de desvio a partir da concentração nominal e precisão igual ou melhor do que 20% (coeficiente de variação). </li></ol></li><li> Precisões intra e inter-dia e precisões. <ol><li> Teste a exatidão e precisão em quatro níveis de concentração de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) e 40 ng / ml (QC4). </li><li> Preparar as amostras de QC em cada dia de validação em sangue humano total com EDTA, em placas de filtro seco, extrair e analisar tal como descrito acima. </li><li> Determinar exatidão e precisão intra-dia com 6 amostras por nível de concentração QC. </li><li> Avaliar exatidão e precisão inter-dia ao longo de 20 dias. Meça cada nível QC com 4 amostras por dia. </li><li> Analise duas curvas de calibração, juntamente com as amostras QC em cada dia. </li><li> Calcule precisão intra-dia como a% da concentração nominal (seis amostras por nível de concentração, por favor, consulte o item 5.2.2). CalcUlate precisão como o coeficiente de variação (CV%). </li><li> Considere exactidão intra-diária aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão intra-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%. </li><li> Calcule exatidão e precisão inter-dia como a média para cada nível de concentração QC analisados ​​ao longo dos 20 dias de validação. </li><li> Considere precisão média inter-dia aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão inter-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%. </li></ol></li><li> Exclusão de interferências da matriz. <ol><li> Para a exclusão das interferências que podem ser provocadas pelos sinais de matriz, analisar manchas de sangue seco em branco (8 indivíduos diferentes, de preferência 4 homens e 4 mulheres). </li><li> Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se picos dentro do tempo de retençãojanela de tacrolimus são detectados, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os de picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ. </li></ol></li><li> Ion supressão / aprimoramento de íons. <ol><li> Use um protocolo de infusão pós-coluna, conforme descrito 45 para avaliar a possibilidade de interferências de realce ion supressão / ion causada por componentes da matriz de co-eluição. </li><li> Infundir o tacrolimus numa concentração de 10 ug / ml dissolvido em ácido fórmico a 0,1%: metanol (30:70, v / v) de pós-coluna a uma taxa de 10 ul / min. <ol><li> Conectar uma bomba de seringa através de peça em T entre a coluna analítica e a fonte de electropulverização do espectrómetro de massa. </li><li> Monitorizar a intensidade do sinal de MS / MS das transições MRM de tacrolimus e do seu padrão interno (m / z = 826,6 → 616,2 e m / z = 829,6 → 619,2) após a injecção de extracAs amostras em branco ted (n = 8 amostras de indivíduos diferentes). Nota: Na ausência de melhoria de supressão de iões / o ião de sinal causada por infusão contínua dos analitos não deve ser afectado por injecção da matriz em branco, enquanto a supressão de iões provoca uma queda do sinal e um pico de iões de reforço. </li></ol></li></ol></li><li> Transferir. <ol><li> Avaliar o potencial de carry-over Ao analisar amostras extraídas em branco após os mais altos calibradores (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se forem detectados picos dentro da janela de tempo de retenção do tacrolimus, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ. </li></ol></li><li> Recuperações de extração. <ol><li> Determinar recuperações por comparação dos sinais dos analitos após extracção de QC sampios em todos os quatro níveis de concentração (n = 6 por concentração) com os de branco manchas de sangue seco enriquecida com os correspondentes montantes das tacrolimus após a extração. </li><li> Prepare quatro conjuntos de CQ (níveis de concentração: 2, 4, 20, 40 ng / mL). </li><li> Preparar outro 4 conjuntos de amostras de ensaio correspondente &quot;recuperação&quot; através da identificação de 50 ul de sangue total com EDTA em branco para os cartões de papel de filtro e secagem durante 2 horas. </li><li> A partir de agora, tanto para o QC e em branco &quot;amostras de teste de recuperação&quot;, cortar toda a mancha de sangue no cartão de filtro com uma tesoura e coloque os discos resultantes em um tubo cônico de polipropileno com fundo e snap-on tampa. </li><li> Extraia todas as amostras. </li><li> Transfira os sobrenadantes (400 uL) para frascos de vidro de HPLC. </li><li> Adicionar solução estoque tacrolimus aos &quot;corpos de prova de recuperação extraído em branco&quot; para atingir concentrações de 2, 4, 20 e 40 ng / ml (4 ul de 200, 400, 2.000, 4.000 ng ml sol / estoque tacrolimusdoras de 400 ul de sobrenadante). </li><li> Após análise por LC-MS / MS, comparar os sinais em ambas as amostras de QC e amostras de teste &quot;recuperação&quot; de a concentração correspondente (% de recuperação = amostras de sinal cravado antes das amostras de extracção / sinal cravado após extracção x 100). </li></ol></li><li> Diluição integridade. <ol><li> Estabelecer integridade diluição com amostras fortificadas com os analitos em 500, 250 e 100 ng / ml. </li><li> Após a extração, diluir as amostras usando solução de precipitação de proteínas (1:10, n = 3 por nível de concentração). </li><li> Calcular desvios em relação às concentrações nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável. </li></ol></li><li> Estabilidades. <ol><li> Investigar estabilidades, utilizando as amostras de CQ em todos os quatro níveis de concentração (n = 4 para cada concentração) analisada em diferentes pontos de tempo e sob as diferentes condições de armazenagem. </li><li> Compare os resultados após a armazenagem, com os valores nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável. </li><li> Estabelecer estabilidade da amostra durante 1 semana à temperatura ambiente, 1 semana a 4 ° C, 1 mês a -20 ° C e 1 mês à temperatura de -80 ° C. </li><li> Teste de estabilidade congelamento-descongelamento durante três ciclos (-20 ° C). Teste amostra extraída e a estabilidade do amostrador automático por colocar as amostras no amostrador automático com termostato ajustado para 4 ° C. Injectar as amostras depois de 72 horas. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora, como acima mencionado, o conceito de fármaco terapêutico e monitorização aderência do tacrolimus com base em manchas de sangue seco é atraente, existem desafios analíticos que ultrapassam aquelas tipicamente associados com a análise por LC-MS / MS do tacrolimus em EDTA venoso amostras de sangue inteiro. Estes incluem, mas não estão limitados a, o facto de a matriz capilar é sangue completo embebido no material de fibras de algodão do material de cartão de filtro usado aqui e o baixo volume de sangue (20 ul). No ...

O tacrolimus é um potente immonosuppressant 1-7 que tem uma estrutura de macrólido 8 (Figura 1). Devido a cis - isomerismo trans das ligações NC que forma dois rotâmeros em solução 9 que podem ser separados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC) Tacrolimus é lipofilico e solúvel em álcoois (metanol: 653 g / L, etanol: 355 g / L), hidrocarbonetos halogenados (clorofórmio: 573 g / L) e éter. É moderadamente solúvel em hidrocarbonetos alifáticos (hexano: 0,1 g / L e de água (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 A molécula não contém quaisquer cromóforo e o seu máximo de absorção de UV de 192 nm tacrolimus actua através da inibição da calcineurina. . O seu mecanismo de acção foi revisto em referências 10,11. Ele é actualmente utilizado em mais de 80% dos pacientes de transplante de órgãos sólidos nos Estados Unidos 12. O índice terapêutico de tacrolimus é considerád para ser estreita 13. Além disso, a correlação entre doses de tacrolimus e as concentrações sanguíneas é pobre e farmacocinética é variável 14,15. A monitorização terapêutica para orientar a dosagem tacrolimus em doentes transplantados é a prática clínica, pois, em geral 16-20. O objectivo é manter as concentrações sanguíneas de tacrolimus dentro de uma gama terapêutica pré-definido. Concentrações sanguíneas Tacrolimus abaixo da gama terapêutica pode resultar numa actividade aumentada de reacções alo-imune crónica ou aguda, enquanto que as concentrações acima da janela terapêutica aumentar o risco de sobre-imunossupressão, cancro e toxicidade, como nefrotoxicidade, neurotoxicidade, hipertensão, e diabetes. A alta variabilidade intra-individual de farmacocinética de tacrolimus pode ser prejudicial tanto para órgãos transplantados e sobrevida do paciente 21,22. Enquanto a variabilidade inter-individual na farmacocinética do tacrolimus é causada principalmente por polimorfismos CYP3A5, razões para intra-individualvariabilidade incluem, mas não estão limitados a, fármaco-fármaco, com a doença da droga e droga-alimento interacções 14,15. Também a falta de adesão ao regime de imunossupressão terapêutica medicamentosa é um fator contribuinte e uma das principais razões para a perda do enxerto 23,24. Estas considerações sugerem que casa freqüente de drogas terapêuticas e monitoramento da adesão de concentrações de tacrolimus no sangue total pode ser benéfica para garantir que os pacientes têm uma exposição de tacrolímus dentro da janela terapêutica desejada em todos os momentos. No entanto, a logística e os custos de monitorização mais frequente da terapêutica medicamentosa, pois é atual prática clínica 15 é proibitivo. Uma das razões é que o paciente tem de ver uma flebotomia para ter a amostra de sangue venoso necessária desenhada. Manchas de sangue seco surgiram recentemente como um conceito atraente 25-28. Depois de um dedo simples furar o paciente coleta uma gota de sangue em um cartão de papel de filtro especial e após o ponto de sangue tem dRied, pode ser enviado para um laboratório central para análise de tacrolimus e qualquer outro imunossupressor que o paciente possa estar a tomar actualmente. Isto tornou-se possível devido ao desenvolvimento de ensaios de LC-MS / MS altamente sensíveis e específicos para a quantificação de tacrolimus e outros imunossupressores no sangue em volumes muito pequenos, tais como manchas de sangue seco (tipicamente 20 ul de sangue 25,29-43). Outra vantagem é que os baixos estratégias de cobrança minimamente invasivas, amostra de volume, tais como manchas de sangue seco facilitar muito monitorização terapêutica e estudos farmacocinéticos em crianças pequenas 28. Tacrolimus geralmente é medido em toda EDTA sangue venoso 15. As razões são que o tacrolimus é extensamente distribuída a células do sangue e que os estudos clínicos relataram melhor correlação entre as concentrações de tacrolimus calha no sangue do que em plasma com eventos clínicos 15,18. Em comparação, a análise de TAcrolimus em manchas de sangue seco é baseado no sangue capilar que é misturado com a matriz de papel de filtro. Isso apresenta desafios em termos de solubilização de tacrolimus e potenciais interferências com a análise LC-MS / MS. Aqui apresenta-se um ensaio estabelecido e validado com base na homogeneização da mancha de sangue seco usando um misturador de bala em combinação com um alto fluxo de amostra de coluna em linha limpar procedimento e análise por LC-MS / MS. Até hoje, este ensaio tem sido usado com sucesso para a quantificação de mais de cinco mil amostras de sangue para monitorização de tacrolimus seca aderência em ensaios clínicos.

<table><tbody><tr>Convenção sobre a <td>Farmacopeia dos EUA</td> sobre <td>Tacrolimus</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Glóbulos vermelhos</td><td>Hospital da Universidade do Colorado</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Hospital da Universidade do Colorado</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Acetona CHROMASOLV, HPLC, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila Optima LC / MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 99,9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC / MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Water Optima LC / MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 &ndash; 10 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>tubo Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &micro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l pontas de pipeta com filtro, estéril</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1.000 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l pontas de pipeta com filtro, estéril</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l pontas de pipeta com filtro, estéril</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 &micro; l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>tubo Eppendorf de 2 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l pontas de pipeta com filtro, estéril</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l pontas de pipeta com filtro</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l pontas de pipeta com filtro, estéril</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l inserções para frascos de HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Balances AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogeneizador</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes</td> <td>DescartáveisPDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Vidros de vidro, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Luvas, nitrilo</td><td>Titan Brand Gloves</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de HPLC, 9 mm, 2 ml, transparente</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Tampas para frascos de HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Agulha, 18 G 1.5</td><td>Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Rack para tubos Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Rack para Frascos de HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço 0,9 - 2 mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Caixas de armazenamento para freezers / refrigeradores</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice multi-tubo padrão</td><td>VWR Produtos Científicos</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatman, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Amostrador Automático</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>amigo. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba binária, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba binária, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Micro desgaseificador a vácuo, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Forno de coluna,&nbsp; Agilent 1290 com 2 posições&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Compartimento de coluna termostatizado com válvula de comutação integrada de 6 portas</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de pré-coluna HPLC, Zorbax XDB C8 (5 &micro; m tamanho de partícula), 4,6 &middot; Coluna</td> analítica <td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td>HPLC de 12,5 mm</tr><tr><td>, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &micro; m tamanho de partícula), 4,6 &middot; Espectrômetro</td><td></td><td></td> de massa em tandem Phenomenex 993967-906 <td></td>de 150 mm</tr><tr><td>API5000 MS/MS com fonte de TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Software de espectrometria de massa</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

O tacrolimus inibidor da calcineurina é a pedra angular da maioria dos protocolos de tratamento imunossupressores após transplante de órgão sólido nos Estados Unidos. Tacrolimus é uma droga estreito índice terapêutico e, como tal, exige monitorização terapêutica e ajuste de dose com base em toda a sua concentrações mínimas no sangue. Para facilitar casa droga terapêutica e monitoramento da adesão, a coleta de gotas de sangue seco é um conceito atraente. Depois de uma picada no dedo, o paciente recebe uma gota de sangue em papel de filtro em casa. Depois de o sangue é seca, que é enviado para o laboratório de análises, onde o tacrolimus é quantificada usando espectrometria de massa líquida de alta eficiência A cromatografia-tandem (HPLC-MS / MS), em combinação com um manual simples passo de precipitação de proteína e de extracção em linha da coluna. Para a análise de tacrolimus, um disco de 6 mm é perfurado a partir do centro do local saturada de sangue. A mancha de sangue é homogeneizada utilizando um misturador de uma balaND, em seguida, as proteínas são precipitadas com metanol / 0,2 M ZnSO4 contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus. Após agitação em vórtice e centrifugação, 100 ul de sobrenadante foi injectada numa coluna de extracção em linha e lavou-se com 5 mL / min de ácido fórmico a 0,1 / acetonitrilo (7: 3, v: v) durante 1 min. Daqui por diante, a válvula de comutação é activada e os analitos são back-lavada na coluna analítica (e separados utilizando um gradiente de ácido fórmico / acetonitrilo a 0,1%). O tacrolimus é quantificada no modo positivo de multi reacção (MRM) usando um espectrómetro de massa em tandem. O ensaio é linear de 1 a 50 ng / ml. A variabilidade inter-ensaio (3,6% -6,1%) e precisão (91,7% -101,6%), avaliada durante 20 dias satisfazer os critérios de aceitação. A recuperação média de extração é de 95,5%. Não há carry-over, interferências de matriz e efeitos de matriz relevante. O tacrolimus é estável em manchas de sangue seco em temperatura ambiente e a +4 ° C durante 1 semana. Amostras extraídas doamostrador automático são estáveis ​​a 4 ° C durante pelo menos 72 h.

Cromatogramas iónicos representativos de uma amostra em branco, uma amostra enriquecida para o limite inferior de quantificação e uma amostra do paciente são apresentados na Figura 3. As curvas de calibração O limite inferior de detecção foi de 0,5 ng / ml e o limite inferior de quantificação foi de 1,0 ng / ml. Cinquenta ng / ml foi escolhido como o mais alto calibrador como concentrações mais elevadas não são susceptíveis de se...

Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar o tacrolimo em manchas de sangue seco. A principal vantagem dessa técnica sobre a quantificação de tacrolimo em amostras de sangue após a coleta de sangue IV é que os pacientes podem coletar amostras por conta própria, estratégias minimamente invasivas de coleta de amostras de baixo volume, como manchas de sangue seco, também facilitam o monitoramento terapêutico de medicamentos e estudos farmacocinéticos em crianças pequenas. Após uma simples picada no dedo, o paciente coleta uma gota de sangue em um cartão de papel de filtro especial e, após a secagem da mancha de sangue, ela pode ser enviada a um laboratório central para análise de tacrolimo e qualquer outro imunossupressor que o paciente possa estar tomando.A quantificação de drogas em manchas de sangue seco tornou-se possível devido ao desenvolvimento de ensaios LCM SM S altamente sensíveis e específicos para a quantificação de tacrolimus e outros imunossupressores em volumes sanguíneos muito pequenos, como manchas de sangue seco. Primeiro, prepare soluções de estoque em metanol puro a uma concentração de um miligrama por mililitro para tacrolimus e uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Para D duas soluções de estoque de alíquota de 13 C e armazenar a 70 graus Celsius negativos ou menos em cada dia de extração, preparar uma proporção de sete para três de metanol e sulfato de zinco 0,2 molar em água para precipitar proteínas e extrair tacrolimus.A solução-mãe padrão interna é enriquecida com a solução de precipitação. Defina a expiração da solução em 12 horas. Em seguida, preparar soluções-mãe de tacrolimus realizando uma diluição apropriada da solução-mãe usando metanol puro para preparar calibradores e amostras de controle de qualidade.Crave 20 microlitros da solução estoque adequadamente diluída em EDT. Um sangue total incuba a 37 graus Celsius sob agitação suave em banho-maria por 20 minutos para permitir a distribuição homogênea do tacrolimo nos componentes celulares do sangue. Para preparar uma quantidade maior de calibradores e amostras de controle de qualidade, coloque 2000 microlitros da solução estoque adequadamente diluída no EDT.Um sangue total incuba a 37 graus Celsius sob agitação suave em banho-maria por 20 minutos para permitir a distribuição homogênea do tacrolimo nos componentes celulares do sangue. Em seguida, alíquota as amostras em tubos de polipropileno de 1,5 mililitro com fundo cônico e tampas de encaixe. Localize 50 microlitros de sangue total enriquecido no meio de cada círculo em cartões de filtro usando uma pipeta após secar as manchas de sangue em temperatura ambiente por três horas, prepare padrões de calibração de tacrolimo em sangue total EDTA humano em concentrações de tacrolimo de 2,5, 5, 10, 25 e 50 nanogramas por mililitro.Preparar uma amostra em branco para extracção, tal como os padrões de calibração, com a solução de precipitação de proteínas, que não contenha o padrão interno D e dois tacrolimus a 13 C. Em seguida, preparar amostras de controlo de qualidade em sangue total EDTA humano em concentrações de 0, 2, 4, 20 e 40 nanogramas por mililitro. Prepare uma amostra em branco também Depois de coletar as manchas de sangue seco, inspecione visualmente cada uma para garantir a qualidade e o volume aceitáveis da amostra.Em seguida, perfure o centro da mancha de sangue no cartão do filtro com um furador de seis milímetros. Coloque os discos em tubos de polipropileno de 1,5 mililitro com fundo cônico e tampas de encaixe. Adicione 20 a 30 balas a cada tubo.Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de precipitação de proteínas em cada tubo. Homogeneizar os discos em um liquidificador bullet por um minuto na velocidade máxima. Quando terminar, agite as amostras à temperatura ambiente em um vórtice de tubo múltiplo na velocidade máxima por 10 minutos.Em seguida, centrifugue as amostras a 16.000 GS e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após centrifugação, transfira o SNAT para frascos de HPLC de vidro equipados com uma inserção de 300 microlitros. Neste ponto, carregue 100 microlitros do supernat da amostra extraída na lavagem da coluna de extração do cartucho C oito com uma proporção de sete para três de 0,1% de ácido fórmico em água e nitrilo ácido a um fluxo de cinco mililitros por minuto.Durante um minuto, accionar a válvula de comutação, o que resulta na retrolavagem dos analitos do pré-cal para a coluna analítica. Em seguida, ajuste o termostato da coluna para 65 graus Celsius. Eluir as substâncias a analisar da coluna analítica utilizando os caudais e o gradiente aqui indicados.Conecte a coluna analítica a um espectrômetro de massa em tandem através da fonte de ionização turbo electrospray. Ajuste os parâmetros-chave do espectrômetro de massa de acordo com a tabela a seguir. Em seguida, detecte íons positivos no modo de reação múltipla.Para quantificar o tacrolimo nas manchas de sangue seco, compare-o com a curva de calibração usando o software de espectrometria de massa cromatogramas de íons representativos de uma amostra em branco. Uma amostra cravada no limite inferior de quantificação e uma amostra de paciente são mostradas aqui. Uma curva de calibração típica é mostrada aqui.O coeficiente de correlação médio é de 0,9994. Os resultados de exatidão e precisão são mostrados em detalhes aqui. Não foram observadas indicações de supressão iônica significativa ou aumento de íons e nenhum carryover relevante resultando em picos excedendo.15% do sinal no limite inferior de quantificação foram detectados. A integridade da diluição foi investigada analisando amostras preparadas em concentrações acima do calibrador mais alto e diluídas em solução de precipitação de proteína após a extração para atingir as concentrações alvo. Todas as diluições ensaiadas satisfizeram os critérios de aceitação.Nenhuma perda foi aparente após uma semana de armazenamento em temperatura ambiente, após uma semana de armazenamento a quatro graus Celsius e após um mês de armazenamento a 20 graus Celsius negativos. Além disso, não foram observadas perdas após um mês de armazenamento a 80 graus Celsius negativos após três ciclos de congelamento e descongelamento e após 72 horas de amostras extraídas no amostrador automático a quatro graus Celsius. Uma vez dominado, 20 amostras podem ser extraídas em menos de uma hora.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a chave para uma quantificação confiável é a qualidade da mancha de sangue seco e que o disco é perfurado de uma área completamente saturada do papel de filtro. As técnicas e o ensaio mostrados neste vídeo fornecem uma tecnologia de plataforma para quantificar outros imunossupressores e drogas em manchas de sangue seco.

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Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

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Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

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Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

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