Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

O objetivo geral deste procedimento é extrair de forma eficiente exossomos de biofluidos, liberar o conteúdo dos exossomos e analisar rapidamente essa carga. Isso é realizado primeiramente extraindo exossomos de biofluidos utilizando micropartículas magnéticas revestidas com anticorpos direcionados a marcadores de exossomos, e em seguida depositando os exossomos extraídos sobre uma superfície eletroquímica. Em seguida, os exossomos são lisados por meio de um campo elétrico e o seu conteúdo é hibridizado com sondas fixadas na superfície do eletrodo.

Uma molécula repórter também é hibridizada ao sistema. O passo final é adicionar uma solução de substrato à superfície do eletrodo e, em seguida, obter a leitura mediante a medição da corrente elétrica. Em última instância, a medição eletroquímica da corrente é utilizada para indicar a quantidade de ácido nucleico ou de conteúdo proteico na amostra de exossomo.

A principal vantagem desta tecnologia em relação aos métodos existentes, como a ultracentrifugação e o tampão de lisina, é que se trata de um método simples e rápido para extrair e testar o conteúdo de exossomos. Estamos muito entusiasmados com esta tecnologia porque, pela primeira vez, a tecnologia efim nos permite utilizar as informações liberadas por órgãos em estado de doença ou normalidade, as quais são secretadas pelo órgão de origem através da vasculatura e que chegam à nossa cavidade oral. Essa tecnologia nos permite capturar essas informações e liberar o conteúdo molecular que podemos detectar simultaneamente de forma flexível.

Essas informações discriminatórias da doença, geralmente, podem ser difíceis para usuários novos neste método, pois o uso de micropartículas magnéticas pode ser complicado se não se tiver cuidado. Além disso, o uso de métodos eletroquímicos na análise de amostras biológicas pode representar um paradigma novo para alguns. A demonstração visual deste método é fundamental, já que as etapas de manipulação das micropartículas magnéticas e de carregamento eletroquímico são difíceis de aprender. Deve-se ter um cuidado especial ao manipular as micropartículas magnéticas e ao carregá-las nos eletrodos.

Para iniciar a ressuspensão, prepare uma solução estoque contendo 10 microgramas por mililitro de micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina e adicione cinco microlitros dessa solução a um tubo de microcentrífuga contendo 495 microlitros de PBS para lavar as esferas. Primeiro, coloque o tubo em uma grade magnética por um minuto e remova cuidadosamente o tampão sem perturbar as esferas.

Em seguida, transfira o tubo para um suporte não magnético. Adicione 500 microlitros de PBS e agite suavemente para lavar as microesferas. Repita este procedimento por um total de três vezes; após a lavagem final, reutilize as microesferas.

Suspenda as microesferas em 490 microlitros de PBS e, em seguida, adicione cinco microlitros do anticorpo Biotinilado de camundongo anti-CD63 humano proveniente de uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Misture a solução pipetando no programa de um rotador de amostras para rotação recíproca a 90 graus por cinco segundos e vibração a cinco graus por um segundo. Coloque os tubos no rotador e execute o programa por 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira os tubos para o suporte magnético durante cinco minutos. Lave as microesferas três vezes com 500 microlitros de PBS e, em seguida, ressuspenda-as em 490 microlitros de PBS contendo Caine. Identifique um tubo com a identificação da amostra e, então, adicione 10 microlitros da amostra, pipetando várias vezes para misturar a amostra com as microesferas conjugadas ao anticorpo.

Em seguida, transfira os tubos para o rotador de amostras e execute o mesmo programa por duas horas à temperatura ambiente. Depois, lave as microesferas três vezes com 500 microlitros de um tampão de tris cloreto a um molar. Utilizando o suporte magnetizado, os exossomos agora estão ligados às microesferas magnetizadas para pré-concentrar o eletrodo.

Primeiro, dilua os reagentes estoque da sonda, cloreto de potássio e monômero ole em água destilada. A sonda de DNA biotinilada na extremidade 5' é específica para o mRNA de GA DH. Misture a solução da sonda monomérica por vortexamento.

Utilize uma matriz de eletrodos com 16 sensores na qual cada eletrodo unitário é composto por eletrodos de trabalho, contraeletródo e eletrodo de referência feitos de ouro nu. Coloque um poço de plástico sobre a matriz de eletrodos para evitar contaminação cruzada dos eletrodos. Transfira 60 microlitros da solução de monômero sonda para a superfície de um eletrodo de ouro de modo que os eletrodos de trabalho, contraeletródo e referência fiquem cobertos pelo líquido.

Aplicar um perfil de campo elétrico quadrado cíclico, conhecido como campo A-C-S-W-E, para eletropolimerizar uma sonda de monômero. Isso cria uma camada de polímero condutor na superfície do eletrodo. Lavar o sensor três vezes com água destilada e, em seguida, secá-lo com gás nitrogênio para remover o líquido da superfície do eletrodo.

Após o pré-revestimento do eletrodo com a sonda de captura, adicione cinco microlitros de uma solução de um micromolar da sonda detectora a 495 microlitros da solução de complexo de exossomos com microesferas e, em seguida, homogeneíze por pipetagem. A sonda é um iniciador de DNA conjugado com fluoresceína na extremidade 3' específico para GA dh. Posicione uma matriz de eletrodos pré-codificada sobre uma matriz de ímãs composta por 16 ímãs alinhados aos eletrodos de trabalho do sensor.

Em seguida, transfira 60 microlitros da solução de exossomos com microesferas para a superfície do eletrodo. Aplique o campo A-C-S-W-E por 20 ciclos. A carga exossomal liberada hibridizará com a sonda na superfície do eletrodo.

Lave a superfície do eletrodo três vezes com água destilada para remover quaisquer analitos não ligados e, em seguida, seque o eletrodo com gás nitrogênio. Em seguida, prepare uma diluição de um para 1000 do anticorpo conjugado com HRP antifluoresceína em PBS contendo Caine. Depois, adicione 60 microlitros da diluição de anticorpo à superfície do eletrodo.

Aplicar o campo A-C-S-W-E à superfície do eletrodo para conjugação do anticorpo anti-fluoresceína HRP à sonda detectora. Enxaguar a superfície do sensor três vezes com água destilada para remover o anticorpo em excesso e, em seguida, secar o eletrodo com gás nitrogênio. Em seguida, carregar 60 microlitros de substrato TMB em cada superfície sensora com uma pipeta multicanal, utilizando um potenciostato para medir a corrente do eletrodo em menos 200 milivolts durante 60 segundos.

Para obter a leitura tric, utilizou-se microscopia eletrônica de transmissão para determinar se exossomos estavam ligados às microesferas magnéticas. Os grânulos de tamanho entre 70 e 100 nanômetros ligados às microesferas são compatíveis com o tamanho conhecido de exossomos após lise pelo campo elétrico ou detergente. Nenhum exossomo é aparente próximo às microesferas.

O mRNA de GA DH em exossomos foi detectado por leitura atric. A quantidade de GA DH presente ao longo do tempo diminui conforme esperado após a lise dos exossomos pelo campo elétrico ou por detergente, indicando exposição ao ambiente extravesicular da saliva. O Efim foi utilizado para medir o conteúdo exossomal do soro e da saliva de camundongos que receberam injeção de células humanas de câncer de pulmão produtoras de um marcador exossomal humano CD 63 GFP.

Após 20 dias, níveis mais elevados de CD63 GFP foram encontrados tanto no soro quanto na saliva dos camundongos injetados com as células cancerígenas, mas não nos camundongos injetados com solução salina. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar tocar nas esferas para extrair uma quantidade adequada de líquido durante a lavagem das esferas, lavar uniformemente a superfície do eletrodo e carregar corretamente as regiões no eletrodo. Esta tecnologia, esta tecnologia efim, forneceu a capacidade crítica e não atendida de como uma doença sistêmica, um órgão distal, pode liberar suas informações e calculá-las nesta entidade chamada exossomos.

Como eles chegam à saliva, à nossa cavidade oral, e como é possível capturar os exossomos, liberar essas moléculas-alvo e permitir sua detecção simultânea em doenças potencialmente graves, como diabetes, câncer pancreático ou outras doenças ameaçadoras à vida. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como extrair rapidamente exossomos de um fluido biológico, como liberar o conteúdo dos exossomos e como analisar rapidamente seu material utilizando um sistema eletrodo integrado.