Desenvolvimento de inibidores de interacções proteína-proteína através REPLACE: Aplicação para a concepção e desenvolvimento não-ATP inibidores de CDK Competitiva

O objetivo geral da estratégia é gerar uma terapia eficaz semelhante a uma droga de molécula pequena por meio da conversão de um inibidor de peptídeo de uma interação proteína-proteína. Isso é obtido estabelecendo uma relação estrutura-atividade para a interação peptídica proteína desejada para entender quais partes podem ser efetivamente substituídas como uma segunda etapa. A química computacional é usada para identificar alternativas viáveis de fragmentos para os determinantes peptídicos conhecidos, que podem então ser usados para sintetizar uma biblioteca de híbridos de peptídeos fragmentados.

Em seguida, uma biblioteca de híbridos é sintetizada entre esses fragmentos e o peptídeo truncado para gerar moléculas que podem ser testadas em um ensaio in vitro para identificar moléculas mais parecidas com drogas e que recapitulam a atividade do peptídeo nativo. Os resultados mostram que mais compostos semelhantes a medicamentos podem ser identificados usando a metodologia, e estes representam pontos de partida eficazes para a descoberta de medicamentos inibidores de interações proteína-proteína. Portanto, a principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a triagem de alto rendimento, é que a tração da proteína é extremamente desafiadora do ponto de vista da descoberta de medicamentos, e os métodos convencionais não funcionam bem.

A estratégia de substituição envolve a abordagem iterativa passo a passo e, portanto, pode levar mais tempo ou tem maior probabilidade de ser eficaz a longo prazo. Hoje vou demonstrar a maioria dos procedimentos com alguma ajuda de minha associada, Dra. Sandra Craig, que irá configurar algumas das reações e procedimentos. Comece este procedimento com a validação do protocolo de encaixe, seguido pela preparação do local de ligação do receptor e ligantes conforme descrito no protocolo de texto para encaixar os ligantes no sulco de ciclina.

Primeiro, selecione a rotina de ajuste do ligante do protocolo de interações do ligante do receptor definido para o software, use o receptor e os ligantes preparados como entrada para este protocolo. Para essas execuções, selecione PLP um como a rede de energia. A rede de energia usada pelo programa de acoplamento é o campo de força para gerar interações do receptor de ligante e poses potenciais.

Plp um é o potencial linear sábio da paz, que prioriza especificamente as interações de ligação de hidrogênio. Especifique que as poses sejam minimizadas em termos de energia e o número de poses geradas como 10. Deixe todos os outros parâmetros nos valores padrão na primeira instância.

Exiba poses no programa visualizador e, em seguida, classifique por valores decrescentes da pontuação PLP one. Use funções de pontuação como plp, uma para estimar a afinidade de ligação de um ligante acoplado com base em uma pose de ligante candidato, geometria e interação não covalente com a estrutura do receptor alvo. Analise visualmente os 25% melhores das poses pontuadas para super impossibilidade com o grupo de limitação conhecido.

Observe também se a pose atendeu aos filtros de interação, que são configurados para incluir restrições de átomos que requerem contatos intermoleculares conhecidos por serem críticos para a ligação e/ou são necessários para posicionar o grupo de cobertura potencial na geometria correta para a formação da ligação amida. Finalmente, examine as poses para complementaridade visual, que é definida como o preenchimento eficiente do bolso de encadernação de maneira consistente com a atividade da estrutura conhecida. Relações para síntese de grupos de capeamento final, usar todos os materiais de partida comerciais, solventes e reagentes e sintetizar por química orgânica sintética convencional.

Realize cromatografia em camada delgada ou TLC em sílica gel para monitorar as reações, dissolvendo primeiro o material de partida e a mistura de reação na fase móvel. Em seguida, localize o material de partida dissolvido e a mistura de reação na placa TLC usando tubos capilares. Coloque a placa TLC na câmara que contém a fase móvel.

Quando a fase móvel atingir 90% da placa TLC, remova e seque ao ar a placa. Use luz UV para detectar o material de partida e as misturas de reação como pontos visíveis. Em seguida, calcule o RF de cada ponto, que é a razão entre a distância percorrida pelo ponto e a fase móvel.

Em seguida, coloque a mistura de reação em um funil de separação e lave-a com ácido aquoso ou solução de base, conforme apropriado. Recolha o solvente orgânico e evapore-o em um evaporador rotativo antes de secar. O produto bruto obtido sob vácuo dissolve 500 miligramas de produto bruto em três a cinco mililitros de solvente adequado e adicionado a uma amostra de sílica ou RP 18 antes de secar ao ar, coloca uma amostra contendo o produto bruto em sílica, cartuchos de pressão de fase reversa.

Purifique o material bruto usando cromatografia flash automatizada de alta eficiência. Empregando uma coluna de 100 gramas com um gradiente. Execute mais de 15 volumes de coluna.

Secar o produto purificado recolhido no solvente por cromatografia rápida utilizando um evaporador rotativo, evaporando todo o solvente até à secura. Em seguida, seque ainda mais o produto sob vácuo para remover todos os solventes residuais. Realizar a caracterização do produto purificado por NMR MS e HPLC analítico conforme descrito no protocolo de texto para sintetizar fragmento de capa terminal, peptídeos inibitórios ligados ou montagem de flips.

Compostos pépticos terminados por meio de métodos padrão de síntese em fase sólida. Ative cinco equivalentes do aminoácido C terminal em 4,4 equivalentes de HBTU em dois mililitros de DIMETILFORMAMIDA ou DMF por cinco minutos. Carregue a mistura em resina de pista usando seis equivalentes de diisopropiletilamina por uma hora em temperatura ambiente.

Remova o grupo de proteção FM do resíduo do terminal C usando 20% INE em três mililitros de DMF por 10 minutos. Junte os aminoácidos subsequentes passo a passo em cada etapa. Junte cinco equivalentes do próximo aminoácido usando seis equivalentes de DI isopropil, etilamina e 4,4 equivalentes de HBTU em dois mililitros de DMF por uma hora.

À temperatura ambiente, aplique ciclos de lavagem após o acoplamento de aminoácidos e as etapas de proteção FM D após a montagem do peptídeo. Agrupe grupos de capeamento de N usando seis equivalentes de DI isopropil, etilamina e 4,4 equivalentes de HBTU em dois mililitros de DMF por uma hora em temperatura ambiente após a conclusão da montagem do peptídeo. Trate a mistura de reação com dois mililitros da mistura de clivagem durante a noite para remover os grupos protetores da cadeia lateral e Cleve inverte do tritrato de resina o produto resultante com éter datil frio para precipitar e, se necessário, concentre em um evaporador rotativo filtre o sólido resultante e seque sob vácuo ou liofilize usando um liofilizante.

Neste ponto, prossiga para o ensaio de ligação de polarização de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto para determinação da ligação competitiva. A estrutura do modelo de H-A-K-R-R-L-I-F ligada à ranhura de ligação do ciclone é mostrada. O sulco de ciclismo consiste em duas bolsas hidrofóbicas, uma bolsa primária maior e uma bolsa secundária menor, que são preenchidas por resíduos ácidos representados em vermelho.

Outras interações importantes incluem contatos de ligação de hidrogênio da estrutura do peptídeo e interações de emparelhamento iônico dos três resíduos básicos do peptídeo aqui, o modo de ligação de três cinco DCPTR é mostrado, exibido com interações de ligação de hidrogênio com átomos de cadeia lateral de triptofano dois 17 e glutamina 2 54 ancorados. Poses de três grupos representativos e de cobertura são mostradas com cada um desses compostos possuindo ligações de hidrogênio com os átomos de filtro de interação de triptofano dois 17 e glutamina 2 54. Conforme representado por linhas tracejadas verdes, o subsistente de erva-doce faz as interações da parede de Vander com a bolsa hidrofóbica secundária.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma melhor compreensão de como executar e aplicar a estratégia de substituição, convertendo um inibidor de peptídeo conhecido em uma molécula mais parecida com uma droga, que inibe a tração de uma proteína e é um ponto de partida para o desenvolvimento terapêutico.