Name: Síntese de Indoxil-glicosídeos para Detecção de Atividades de Glicosidase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda uma nova rota sintética para glicosídeos de indoxila com rendimentos superiores usando ésteres de ácido indoxílico como intermediários. Este método facilita testes qualitativos de atividade enzimática com substratos cromogênicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O apoio a este trabalho da Glycom A/S, Copenhague, Dinamarca, é gratamente reconhecido.

Observações gerais:
Todas as reações foram realizadas com capela e equipamento de proteção individual adequado. Todos os reagentes e solventes (p.a.; teor de água para solventes secos: MeCN <50 ppm; et2o <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) foram comprados de fontes comerciais e usados conforme recebidos. A TLC foi realizada em placas Merck sílica gel 60 F254. Os compostos foram detectados por UV e/ou por tratamento com EtOH/H2SO4 (9:1) e posterior aquecimento. A cromatografia em coluna foi realizada com sílica gel Merck/Fluka 60 (malha 230-400). As filtrações foram realizadas com funil de Büchner e bomba aspiradora. Os solventes foram removidos empregando um evaporador rotativo (40 °C, ~200 rmp). Os produtos foram secos em alto vácuo (bomba de palhetas rotativas). Reações que requerem solventes secos foram realizadas sob atmosfera de argônio.
A seguir, descreve-se a síntese de X-Gal (16) empregando éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12). Para outros compostos com padrões de substituição variados, bem como ésteres metílicos preparados de acordo com esta sequência sintética, ver ref.17-19.
1. Aceptor: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico18 (12)
<ol>
	<li>N-acetilação: síntese de N-(4-bromo-3-cloro-2-metilfenil)-acetamida (6)
	<ol>
		<li>Dissolver 10,0 g (45,7 mmol) de 4-bromo-3-cloro-2-metilanilina em 30 ml de diclorometano. 
		Cuidado! O diclorometano é prejudicial e resfria a solução em um banho de gelo.</li>
		<li>Adicione 6,50 ml (68,7 mmol) de anidrido acético gota a gota e deixe a mistura aquecer até a temperatura ambiente. A mistura pode ser mexida por 8 horas ou durante a noite. Cuidado! O anidrido acético é corrosivo e inflamável.</li>
		<li>Remova o solvente e recristalize de acetato de etila 9: 1 / metanol (rendimento: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), sólido incolor). 
		Cuidado! O acetato de etila é irritante e inflamável. Cuidado! O metanol é tóxico e inflamável.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxidação: Síntese de ácido N-acetil-5-bromo-6-cloro-antranílico (7)
	<ol>
		<li>Refluxo: uma mistura de 2,30 g (8,76 mmol) de 6 (produto obtido na etapa 1.1) e 2,10 g (8,52 mmol) de MgSO4•7H2O em 40 ml de água em um balão de fundo redondo de 3 gargalos equipado com resfriador e funil de gota.</li>
		<li>Adicionar 50 ml de solução saturada de KMnO4 gota a gota em água à mistura de reacção durante um período de 3 horas. Em seguida, aqueça por 2 horas adicionais sob refluxo, cerca de 135 ° C banho de óleo. Cuidado! O permanganato de potássio é prejudicial e oxidante.</li>
		<li>Resfrie à temperatura ambiente e filtre a pirolusita (MnO2), que é formada durante a reação. 
		Cuidado! A pirolusita é prejudicial.</li>
		<li>Adicionar ácido clorídrico (37%) ao filtrado até pH 1, filtrar o produto e secar em vácuo, (rendimento: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), sólido incolor). 
		Cuidado! O ácido clorídrico é corrosivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Desacetilação: Síntese de ácido 5-bromo-6-cloro-antranílico (8)
	<ol>
		<li>Dissolver 3,90 g (13,3 mmol) de 7 (produto obtido do passo 1.2) em 70 ml de solução aquosa de hidróxido de sódio 1 N e aquecer a cerca de 100 °C (banho de óleo) durante 5 h 
		Cuidado! O hidróxido de sódio é corrosivo.</li>
		<li>Resfrie à temperatura ambiente e adicione ácido clorídrico (37%) até pH 1, depois filtre o produto com um funil Büchner e seque no vácuo (rendimento: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formação de anidrido: síntese de anidrido 5-bromo-6-cloroisatoico (9)
	<ol>
		<li>Suspender 8,17 g (32,6 mmol) de 8 (produto obtido no passo 1.3) em 33 ml de acetonitrila seca. 
		Cuidado! A acetonitrila é prejudicial e inflamável.</li>
		<li>Agitar à temperatura ambiente e adicionar 5,3 ml e uma solução de 3,22 g (10,8 mmol) de trifosgénio em 18,5 ml de diclorometano seco gota a gota simultaneamente durante um período de 30 minutos. Em seguida, aquecido por 3 horas a 50 °C (banho de óleo). Cuidado! A piridina é nociva e inflamável. 
		Cuidado! O trifosgênio é tóxico e pode liberar fosgênio.</li>
		<li>Remova cerca de 75% do solvente e apague a reação adicionando 100 ml de água destilada e filtre seu produto. Lave com uma pequena quantidade de diclorometano frio.</li>
		<li>Seque o produto no vácuo, (rendimento: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-alquilação: síntese de anidrido 5-bromo-6-cloro-N-[(metoxicarbonil)alil]-isatoico (10)
	<ol>
		<li>Dissolver 25 g (90 mmol) de 9 (produto obtido no passo 1.4) em 250 ml de dimetilformamida anidra e arrefecer em banho de gelo. 
		Cuidado! A dimetilformamida é prejudicial e inflamável</li>
		<li>Adicione 1,15 equivalentes de hidreto de sódio (60% em parafina) em porção. 
		Cuidado! O hidreto de sódio é corrosivo e inflamável; reação pesada com água/gelo.</li>
		<li>Após 30 min de agitação a 0 °C, deixe aquecer à temperatura ambiente e adicione 1,2 equivalentes de bromoacetato de alilo gota a gota.</li>
		<li>Depois de mexer por 5 horas, sacie a reação adicionando 500 ml de água destilada e filtre seu produto.</li>
		<li>Lave com água (3 vezes, 100 ml) e seque o produto a vácuo, (rendimento: 93% (31,5 g, 84,1 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abertura de anidrido: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-6-cloro-N-(metoxicarbonilalil)-antranílico (11)
	<ol>
		<li>Dissolver 10 g (27 mmol) de 10 (produto obtido no passo 1.5) em 100 ml de álcool alílico. 
		Cuidado! O álcool alílico é prejudicial e perigoso para o meio ambiente.</li>
		<li>Adicione 350 mg (8,70 mmol) de hidreto de sódio (60% em parafina) em porção.</li>
		<li>Depois de mexer por 6,5 horas ou durante a noite, remova o solvente.</li>
		<li>Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (coluna 30 x 6 cm; 240 g de sílica) éter de petróleo/acetato de etilo 2:1; RF = 0,66), (rendimento: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), óleo amarelo). 
		Cuidado! O éter de petróleo é inflamável, irritante e perigoso para o meio ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Condensação de Dieckmann: Síntese de éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indoxílico (12)
	<ol>
		<li>Misturar 3,0 g (7,7 mmol) de 11 (produto obtido no passo 1.6) e 1,75 g (15,6 mmol) de terc-butóxido de potássio em 100 ml de éter dietílico seco. 
		Cuidado! O terc-butóxido de potássio é corrosivo e inflamável. 
		Cuidado! O éter dietílico é prejudicial e extremamente inflamável.</li>
		<li>Aquecer a mistura em refluxo (mais frio) durante 2 horas a 40-45 °C.</li>
		<li>Remova cerca de 75% do solvente e adicione ácido clorídrico diluído (100 ml, 1 M). 
		Cuidado! Não seque completamente, pode ocorrer decomposição.</li>
		<li>Filtrar o produto e secar em vácuo, (rendimento: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), sólido incolor a ligeiramente esverdeado).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxil-glicosídeo: síntese de X-gal17
<ol>
	<li>Glicosilação por transferência de fase: Síntese de (éster alílico de ácido 5-bromo-4-cloro-indox-3-ílico) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranosídeo (14)
	<ol>
		<li>Misturar 400 mg (1,21 mmol) do alilester 12 do ácido indoxílico (produto obtido na etapa 1.7), 410 mg (1,21 mmol) de hidrogenosulfato de tetrabutilamónio e 500 mg (1,21 mmol) do doador 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-ᴅ-galactopiranosil brometo (α-acetobromogalactose) em 10 ml de diclorometano. Cuidado! O hidrogensulfato de tetrabutilamônio é prejudicial.</li>
		<li>Adicionar 10 ml de uma solução aquosa de carbonato de potássio (1 M). 
		Cuidado! O carbonato de potássio é corrosivo.</li>
		<li>Agitar à temperatura ambiente até ao consumo completo do dador (TLC: éter de petróleo/acetato de etilo).</li>
		<li>Separar a fase orgânica (ampola de separação), secar sobre Na2SO4 e remover o solvente.</li>
		<li>Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (éter de petróleo/acetato de etilo 1:1; RF = 0,33). (rendimento: 86% (690 mg, 1,04 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Clivagem e descarboxilação de éster: síntese de (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-galactopiranosídeo (15)
	<ol>
		<li>Dissolver 600 mg (0,908 mmol) de 14 (produto obtido na etapa 2.1) em 15 ml de tetra-hidrofurano seco. 
		Cuidado! O tetrahidrofurano é prejudicial e inflamável.</li>
		<li>Adicione 800 μl de morfolina e 105 mg (9,09 μmol) de tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) e mexa durante a noite em temperatura ambiente. 
		Atenção! A morfolina é inflamável e corrosiva.</li>
		<li>Remova o solvente.</li>
		<li>Adicione 400 mg (2,40 mmol) de acetato de prata, 800 mg (5,79 mmol) de carbonato de potássio e 10 ml de anidrido acético. 
		Cuidado! O acetato de prata é irritante e perigoso para o meio ambiente.</li>
		<li>Aqueça a 90-100 °C por 20 min.</li>
		<li>Após o resfriamento à temperatura ambiente, diluir com diclorometano.</li>
		<li>Lavar a mistura duas vezes com água e uma vez com solução diluída de NaHCO3 (10%). 
		Cuidado! O bicarbonato de sódio é corrosivo.</li>
		<li>Secar a fase orgânica sobre Na2SO4 (filtro) e remover o solvente.</li>
		<li>Submeter o produto bruto a cromatografia em coluna (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (rendimento: 88% (495 mg, 8,00 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Desacetilação de Zemplén: Síntese de (5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-β-ᴅ-galactopiranosídeo (16)
	<ol>
		<li>Dissolver 396 mg (0,436 mmol) 15 (produto obtido na etapa 2.2) em 10 ml de metanol.</li>
		<li>Adicione uma quantidade catalítica de metanolato de sódio e mexa durante a noite em temperatura ambiente. 
		Cuidado! O metanolato de sódio é inflamável e corrosivo.</li>
		<li>Neutralizar com Amberlite IR-120 H+ (filtro) e concentrar. 
		Cuidado! Amberlite IR-120 H+ é irritante.</li>
		<li>Seque o produto em vácuo, (rendimento: 87% (170 mg, 0,416 mmol), sólido incolor).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilustrando o Experimento do Modelo: Prova de atividade da β-galactosidase empregando X-Gal
<ol>
	<li>Prepare uma solução de 0,5 mM de X-Gal em tampão de 500 μl (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; NaCl 50 mM, ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM; ou qualquer outro tampão adequado para sua enzima) em um tubo de microcentrífuga (X-Gal pode ser dissolvido em alguns μl de dimetilsulfóxido).</li>
	<li>Adicionar 1 μl de β,1-3-galactosidase (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml; ou qualquer outra β-galactosidase adequada) e agitar (600 rps) a 37 °C.</li>
	<li>Siga a reação. O corante do tipo índigo é formado após um curto período de tempo.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigo%2C+Woad%2C+and+Tyrian+Purple%3A+Important+Vat+Dyes+from+Antique+to+the+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present.</a> Endeavour. 17, 191-199 (1993).</li>
<li>Hunger, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunger%2C+K+%22Industrial+Dyes%3A+Chemistry%2C+Properties%2C+Applications%22">Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications</a>. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigogenic+Substrates+for+Detection+and+Localization+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes.</a> Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).</li>
<li>Barnett, R. J., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Esterases+by+Production+of+Indigo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo.</a> Science. 114, 579-582 (1951).</li>
<li>Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Mammalian+Glucosidase+by+Means+of+3-%285-Bromoindolyl%29-%CE%B2-%E1%B4%85-glucopyranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside.</a> Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).</li>
<li>Anderson, F. B., Leaback, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+the+Histochemical+Localization+of+some+Glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases.</a> Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).</li>
<li>Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosynthesis+and+Evaluation+of+5-%5B125I%5DIodoindolyl-3-yl-%CE%B2-%E1%B4%85-galactopyranoside+%28%5B125I%5DIBDG%29+as+a+%CE%B2-Galactosidase+Imaging+Radioligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand.</a> Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).</li>
<li>Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Halogen+Substituted+%CE%B2-%E1%B4%85-Glucuronides+and+Their+Hydrolysis+by+Rabbit+Liver+%CE%B2-Glucoronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase.</a> Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstartion+of+Enzyme+Activity+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Eschenfelder, V., Brossmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromo-indol-3-yl+5-Acetamido-3%2C5-dideoxy-%CE%B1-%E1%B4%85-glycero-%E1%B4%85-galactononulopyranosidic+Acid%2C+a+Novel+Chromogenic+Substrate+for+the+Staining+of+Sialidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity.</a> Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).</li>
<li>Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Neu5Ac%3A+A+Novel+Substrate+for+Chromogenic+Assay+of+Neuraminidase+Activity+in+Bacterial+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems.</a> Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).</li>
<li>Berlin, W., Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Color+Detection+of+%CE%B1-%CA%9F-Arabinofuranisodase%2C+a+%26%2334%3BNo-Background%26%2334%3B+Reporter+Gene%2C+with+5-Bromo-3-indolyl-%CE%B1-%CA%9F-arabinofuranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a &#34;No-Background&#34; Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside.</a> Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).</li>
<li>Marmuse, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Chromogenic+Substrates+for+Feruloyl+Esterases%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).</li>
<li>Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+4-Methylumbelliferyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+and+5-Bromo-3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+for+Sensitive+Detection+of+Xylanase+Activity+on+Agar+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).</li>
<li>Robertson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Glucosides.+Part+I.+The+Synthesis+of+Indican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican.</a> Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).</li>
<li>Robertson, A., Waters, R. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthese+of+Glucosides.+Part+VII.+The+Synthesis+of+6-Bromoindican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican.</a> Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoxylic+Acid+Esters+as+Convenient+Intermediates+Towards+Indoxyl+Glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides.</a> Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).</li>
<li>Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Efficient+Routes+to+Indoxyl+Glycosides+for+Monitoring+Glycosidase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities.</a> Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Preparation+of+Indoxyl-+and+Nitrophenyl+Glycosides+of+Lactosamine+and+Isolactosamine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine.</a> RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Devido aos baixos rendimentos e limitações, especialmente para estruturas do tipo glicose e sacarídeos mais complexos, uma nova abordagem sintética para glicosídeos indoxil foi desenvolvida. Os ésteres de ácido indoxílico provaram ser intermediários-chave preciosos e foram obtidos em uma via modular e escalável. Todas as etapas são de alto rendimento e, devido a materiais de partida baratos e fácil trabalho, são possíveis sínteses de vários gramas. A vantagem da abordagem de éster de alilo é o bloqueio da posição 2 reati...

Durante muito tempo, a produção de índigo foi um processo economicamente muito importante. Antes que sínteses químicas em larga escala permitissem acesso barato ao índigo, precursores eram obtidos de fontes naturais desde épocas pré-cristãs. O cultivo de plantas produtoras de índigo (índigo natural) na Europa tornou-se desvantajoso a partir do século XVIIth século, já que a quantidade de precursores de índigo da planta indiana de índigo (0,2-0,8%) é cerca de 30 vezes maior. No final do século XIX, a síntese química do índigo suprimiu o cultivo convencional1,2.
Os precursores da índigo que ocorrem naturalmente em plantas incluem a índican (1), a insatana A (2) e a isatana B (3) (Figura 1). Todos eles consistem em um grupo indóxil ligado a um resíduo glicosídico. A clivagem da ligação glicosídica, por exemplo por hidrólise enzimática, leva à liberação do indóxil (4). O próprio indóxil é quase incolor, mas pode ser rapidamente oxidado para formar um corante índigo (5). Essa reação sensível tem sido adaptada em bioquímica, histoquímica, bacteriologia e biologia molecular para monitorar atividades enzimáticas. É possível realizar triagens de atividade in vivo sem isolamento ou purificação das enzimas, bem como testes rápidos em placas de ágar ou em solução (por exemplo, triagem azul-branca, microplacas). Dependendo do resíduo (por exemplo, ésteres, glicosídeos, sulfatos) ligado ao grupo indóxil, foram desenvolvidos substratos adequados para diferentes classes de enzimas (por exemplo, esterases, glicosidases, sulfatases)3. A seguir, o foco será na formação e aplicação dos glicosídeos de indóxil.
<img alt="Diagrama do processo de hidrólise da indicana mostrando derivados de índole e formação do corante índigo." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Precursores naturais de índigo e formação do corante índigo por hidrólise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
O padrão de substituição da porção indoxil determina a cor e as propriedades físicas do corante índigo resultante. Os padrões de substituição mais comuns são 5-bromo-4-cloro (abreviado por X; azul-esverdeado), 5-bromo (azul) e 5-bromo-6-cloro (magenta), já que esses formam as partículas de corante menores, não formam grânulos e apresentam a menor difusão a partir dos locais de hidrólise. A última propriedade é especialmente importante para experimentos in vivo3.
O primeiro relato de um método indigênico para detecção de atividade de esterase foi publicado em 1951 por Barrnett e Seligman, que utilizaram acetato e butirato de indoxil4. Cerca de uma década depois, o princípio indigênico foi adaptado para a localização de glicosidase de mamíferos5. Até hoje, diversos glicosídeos de indoxil foram desenvolvidos, embora sua síntese tenha se mostrado difícil. A maioria das sínteses baseia-se no uso de um indoxil N-acetilado como aceptor e o respectivo doador de haleto de glicosila6-14. A glicosilação é realizada em acetona com hidróxido de sódio. Nessas condições, ocorre uma série de reações laterais, reduzindo significativamente o rendimento. Especialmente para estruturas do tipo glicose, foram relatados rendimentos de glicosilação muito baixos (ex.: 15% para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-gluco-piranosídeo6 e 26% para (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetil-β-ᴅ-xilobiosídeo14 em um exemplo mais recente). Por meio de uma abordagem inovadora, utilizando ésteres de ácido indoquílico, um número considerável de glicosídeos de indoxil foi preparado com bons rendimentos (ex.: (N-acetil-5-bromo-4-cloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-ᴅ-gluco-piranosídeo com rendimento de 57%).
O seguinte protocolo descreve a síntese direta do éster alila do ácido indoílico (5-bromo-4-cloro) e, com base nisso, a síntese de uma glicosídeo de indoxil (X-Gal). Um experimento modelo simples demonstra a reatividade enzimática da β-galactosidase utilizando X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Anidrido acético</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>Acetonitrila corrosiva e inflamável</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Álcool</td></tr><tr><td>alílico</td> nocivo e inflamável <td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Nocivo, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bromoacético</td> irritante <td>Merck</td><td>802260</td><td>Corrosivo, tóxico, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>4-Bromo-3-cloro-2-metilanilina</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td> Irritante <td>ACROS</td><td>326850010</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td> nocivo <td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>ACROS</td><td>348430010</td> prejudicial e extremamente inflamável <td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Irritante, inflamável</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>&beta; 1,3-galactosidase, recombinante, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio hidratado</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Tóxico, inflamável</td></tr><tr><td>Morfolina</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Corrosivo, inflamável</td></tr><tr><td>Éter Peroleum</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Inflamável, irritante, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Carbonato de potássio</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>Permanganato de potássio</td> corrosivo <td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>Nocivo e oxidante</td></tr><tr><td>Terc-butóxido de potássio</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>Corrosivo, inflamável</td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Nocivo, inflamável</td></tr><tr><td>Acetato de prata</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Irritante, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td></td></tr><tr><td>Hidreto de sódio</td> corrosivo <td>Merck</td><td>814552</td> Hidróxido de sódio <td>corrosivo e inflamável</td></tr><tr><td></td><td>Riedel-de H&auml; pt</td><td>S181200</td><td></td></tr><tr><td>Metanolato de sódio</td> corrosivo <td>Merck</td><td>806538</td><td>Sulfato</td></tr><tr><td>de sódio</td> corrosivo e inflamável <td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium hydrogensulfate</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>Harmful</td></tr><tr><td>Tetrahydrofurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Nocivo, inflamável</td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenilfosfina)paládio(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Triphosgene</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Tris</td></tr><tr><td>tóxico (hidroximetil)aminometano cloridrato</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Irritant</td></tr></tbody></table>

síntese de indoxil-glicosídeos para detecção de atividades de glicosidase

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Os glicosídeos indoxílicos provaram ser ferramentas valiosas e versáteis para monitorar as atividades da glicosidase. As indoxilas são liberadas por hidrólise enzimática e são rapidamente oxidadas, por exemplo, pelo oxigênio atmosférico, em corantes do tipo índigo. Esta reação permite uma triagem rápida e fácil in vivo sem isolamento ou purificação de enzimas, bem como testes rápidos em placas de ágar ou em solução (por exemplo, triagem azul-esbranquiçada, micropoços) e é usada em bioquímica, histoquímica, bacteriologia e biologia molecular. Infelizmente, a síntese de tais substratos mostrou-se difícil, devido a várias reações colaterais e à baixa reatividade da função indoxil hidroxila. Especialmente para estruturas do tipo glicose foram observados baixos rendimentos. Nossa nova abordagem emprega éster de ácido indoxílico como intermediários principais. Ésteres de ácido indoxílico com padrões de substituição variados foram preparados em vias escaláveis. As glicosilações de transferência de fase com esses aceptores e haletos de glicosil peracetilados podem ser realizadas em condições comuns em altos rendimentos. A clivagem do éster e a subsequente glicosilação mediada por prata suave produzem os glicosídeos indoxílicos peracetilados em altos rendimentos. Finalmente, a desproteção é realizada de acordo com Zemplén.

As primeiras sínteses de indicano e 5-bromo-indicano foram publicadas por Robertson já em 1927 e 192915,16. Ao empregar o éster metílico do ácido indoílico como aceitador, a posição reativa 2 foi bloqueada, suprimindo parcialmente reações laterais. A glicosilação em acetona/hidróxido de sódio, seguida de desproteção e descarboxilação (160 °C, anidrido acético, 1 h) e, por fim, desacetilação, forneceu indicano e 5-bromo-indicano. Com base nesse conceito, desenvolvemos uma síntese aprimorada de glicosídeos de in...

Os glicosídeos indoxílicos são ferramentas bem estabelecidas e amplamente utilizadas para triagem enzimática e monitoramento da atividade enzimática. Especialmente para estruturas do tipo glicose, as sínteses anteriores provaram ser desafiadoras e de baixo rendimento. Nossa nova abordagem emprega ésteres de ácido indoxílico como intermediários preciosos para produzir um número considerável de glicosídeos indoxílicos em bons rendimentos.

Síntese de Indoxil-glicosídeos para Detecção de Atividades de Glicosidase

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma nova abordagem sintética para glicosídeos endo, incluindo aqueles com estruturas de carboidratos complexos em bons rendimentos. Isso é realizado primeiramente pela síntese de um éster aceptor de ácido inico alo, iniciando-se a partir do metileno. O segundo passo envolve a glicosilação deste aceptor com um doador de glicosila acetilado hali.Em seguida, o éster do alelo é clivado por um catalisador de paládio e é aplicada uma descarboxilação mediada por prata para criar o glicosídeo de inox acetilado. O passo final é a desacetilação com zeplan para gerar o glicosídeo de inox não protegido. Em última análise, o substrato cromogênico preparado é utilizado em um teste qualitativo de atividade enzimática.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que glicosídeos com estruturas de carboidratos complexas e lábeis podem ser produzidos facilmente. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método ao ler uma publicação de Alexander Robertson de 1927, que desenvolveu a primeira síntese do éster metílico do ácido inico. Métodos posteriores utilizaram aceptores de inox de oxi devido à melhor acessibilidade, mas apresentaram baixo rendimento e problemas de purificação. Para iniciar a síntese, um satélite, um derivado halogenado de lene conforme descrito no protocolo do texto.Em seguida, em um balão de fundo redondo com três bocas, refluja-se 2,3 gramas do acetamida metílica halogenada resultante em 40 mililitros de água com 2,1 gramas de sulfato de magnésio heptaidratado durante três horas. Adiciona-se gota a gota 50 mililitros de uma solução saturada de permanganato de potássio em água e, em seguida, o meio é submetido a refluxo por mais duas horas a aproximadamente 135 graus Celsius em banho de óleo. Resfria-se a mistura até a temperatura ambiente e, então, filtra-se para remover o subproduto pirocita; ajusta-se o pH da solução para um com ácido clorídrico a 37%.Em seguida, filtre o produto a partir do solvente e seque-o sob vácuo. Após a secagem do deci, isole o produto conforme descrito no protocolo do texto e, então, suspenda 8,17 gramas do produto deci resultante em 33 mililitros de acetonida seca, adicionando simultaneamente, ao longo de 30 minutos, gota a gota, 5,3 mililitros de piridina e uma solução de 3,22 gramas de tristina em 18,5 mililitros de diclorometano seco à solução. Em seguida, aqueça a reação a 50 graus Celsius em banho de óleo.Após três horas, remova cerca de 75% do solvente e adicione 100 mililitros de água destilada para interromper a reação. Filtre o produto e, em seguida, lave o filtro com cinco a 10 mililitros de clorometano frio. Após a lavagem, seque o produto a vácuo, alquile este intermediário e, então, abra o anidrido resultante conforme descrito no protocolo do texto.Isole o produto resultante por cromatografia em coluna. Inicie a condensação de Dickman misturando três gramas do produto com 1,75 gramas de óxido de potássio em 100 mililitros de éter dietílico anidro, sob refluxo por duas horas a 40 a 45 graus Celsius. Em seguida, remova aproximadamente 75% do solvente sob vácuo e precipite o produto com 100 mililitros de ácido clorídrico um molar.Filtre o produto e, em seguida, seque-o sob vácuo. Para iniciar a síntese de XG, misture 400 miligramas do éster alila do ácido indoc lílico com 410 miligramas de TBAs e 500 miligramas de alfa xto bromo galactose em 10 mililitros de clorometano. Em seguida, adicione 10 mililitros de carbonato de potássio aquoso 1 molar à reação.Agite a reação à temperatura ambiente por cerca de três horas e monitore o consumo de alfa-aceto-bromo-acetose por cromatografia em camada delgada em uma solução um para um de éter de petróleo e acetato de etila. Após o consumo completo da alfa-aceto-bromo-galactose, isole a fase orgânica da solução com um funil de separação. Em seguida, seque a fase orgânica sobre sulfato de sódio para remover a água remanescente e então utilize cromatografia em coluna para purificar o produto conforme descrito no protocolo do texto para clivagem do éster alo. Dissolva 600 miligramas do lado galacto-púrico em 15 mililitros de tetra-hidrofuran seco.Remova o solvente sob vácuo e adicione 400 miligramas de acetato de prata, 800 miligramas de carbonato de potássio e 10 mililitros de anidrido acético ao produto, e então aqueça a reação a cerca de 95 graus Celsius por 20 minutos. Deixe a reação esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, dilua a reação com 50 mililitros de diclorometano. Para o trabalho de purificação desta reação, lave a mistura duas vezes com água e uma vez com solução de bicarbonato de sódio a 10%.Seque a fase orgânica com sulfato de sódio e, em seguida, concentre a solução. Utilize cromatografia em coluna para purificar o lado acilado de galacto purico resultante. A seguir, dissolva 396 miligramas do material purificado em 10 mililitros de metanol.Adicione uma quantidade equivalente à ponta de uma espátula de metilato de sódio e, em seguida, agite a reação durante a noite. Utilize uma resina de troca catiônica para neutralizar a reação e, depois, concentre a solução em vácuo. Por fim, seque o produto sob vácuo para obter xal, a fim de testar a validade da rota sintética.Primeiro, dissolva o xal em poucos microlitros de óxido de dimetilsulfóxido. Em seguida, prepare uma solução estoque de 0,5 milimolar de xal em um tampão apropriado. Depois, adicione um microlitro de beta galacto e agite a mistura a 600 rotações por segundo.A 37 graus Celsius, monitore visualmente a reação para a formação de um corante índigo vibrante. A formação de corante azul em solução indica claramente a atividade enzimática na doxila. Glicosídeos são importantes para monitorar a atividade da enzima glicosidase, embora sejam difíceis de sintetizar.A abordagem sintética apresentada aqui fornece o produto final galacto púrico endo com um rendimento global de 66%, uma melhoria significativa em relação à metodologia anterior, que resultava em apenas 28% de rendimento. Os glicosídeos doxil resultantes podem ser utilizados para testar a atividade de soluções enzimáticas puras ou impuras.Neste exemplo, a cor índigo foi observada apenas em poços contendo beta galacto e foi produzida com apenas 0,1 milimolar de XG. Uma vez que o aceptor de célula indoc é composto, esta rota sintética para obtenção de glicosídeos de célula indoc pode ser realizada em até dois dias, se realizada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da síntese e utilização de glicosídeos iniciais. Esta rota sintética produz esses compostos com bom rendimento, apesar das estruturas complexas.

synthesis-indoxyl-glycosides-for-detection-glycosidase

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Síntese de Indoxil-glicosídeos para Detecção de Atividades Glicosidase

Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Este vídeo descreve um ensaio espectrofotométrico para a estimativa da atividade da glicogênio sintase. O método baseia-se na redução da absorbância do NADH com o tempo e indica a atividade da glicogênio sintase.

Ensaio espectrofotométrico para determinar a atividade da glicogênio sintase

Apresentamos um método modular automatizado de alto rendimento para a identificação e caracterização de exopolissacarídeos microbianos em pequena escala. Este método combina uma pré-seleção rápida para analisar a quantidade total de polissacarídeos secretados com uma impressão digital detalhada de carboidratos para permitir a triagem rápida de cepas bacterianas recém-isoladas ou coleções inteiras de cepas.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

A quantificação de glicose de Bergmeyer é uma técnica enzimática espectrofotométrica usada principalmente para testes clínicos que medem com precisão e sensibilidade a quantidade de glicose. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso desse método para amostras microbiológicas.

Quantificação de glicose de Bergmeyer para amostras microbiológicas

Este estudo estabelece um conjunto de procedimentos operacionais padrão (SOPs) para rastrear e isolar com eficiência as bactérias intestinais capazes de clivar os glicosídeos C.

Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C

Estudos recentes destacam os papéis das enzimas da microbiota intestinal humana no metabolismo dos glicosídeos C. Aqui, apresentamos uma metodologia abrangente que integra técnicas de química analítica (LC-MS / MS e NMR) com abordagens de biologia estrutural para caracterizar sistematicamente as cadeias de reação estruturais e enzimáticas dessas enzimas metabolizadoras de glicosídeos C.

Abordagens de Biologia Estrutural e Química Analítica para Caracterização de Enzimas Metabólicas de C-Glicosídeos na Microbiota Intestinal Humana

Este protocolo descreve um método colorimétrico para avaliar de forma confiável a influência de substâncias químicas na atividade da Deiodinase 1 (DIO1) em microrganismos hepáticos humanos usando a reação de Sandell-Kolthoff. Inclui critérios de aceitação pré-definidos e métricas estatísticas de desempenho, apoiando esforços contínuos para a inclusão das diretrizes de teste da OCDE.

Avaliação colorimétrica da atividade da deiodinase 1 em microssomos do fígado humano usando a reação de Sandell-Kolthoff

Aprenda uma nova rota sintética para glicosídeos de indoxila com rendimentos superiores usando ésteres de ácido indoxílico como intermediários. Este método facilita testes qualitativos de atividade enzimática com substratos cromogênicos.

Síntese de Indoxil-glicosídeos para Detecção de Atividades de Glicosidase

Explorar mais vídeos