Name: Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a induzir glioblastomas com mutações genéticas específicas em camundongos neonatais usando plasmídeos transposon. Este método permite monitorar a progressão tumoral por bioluminescência e analisar características histopatológicas.

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Agradecemos ao Dr. John Ohlfest e à Dra. Stacey Decker13 pelo generoso presente de plasmídeos e pelo treinamento fornecido para dominar este método. Agradecemos a Marta Dzaman pela ajuda na padronização do procedimento de coloração de hematoxilina-eosina de seções embebidas em parafina. Também agradecemos a Molly Dahlgren por ler este manuscrito e fornecer sugestões úteis. Este trabalho é apoiado por doações do NIH / NINDS para MGC e PRL, doação da Leah's Happy Hearts Foundation para MCG e PRL. Prêmio de jovem investigador da Alex's Lemonade Foundation e bolsa da St. Baldrick's Foundation para CK.

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<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li>
<li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste artigo, que detalhe um método versátil e reprodutível para a geração de novos modelos de GBM utilizando integração mediada SB transposase- de ADN plasmídeo oncogénica em células vizinhas da zona subventricular dos ratinhos neonatais. Nós apresentamos um protocolo para gerar plasmídeos transposon com novos genes de interesse, ilustrar como monitorar a progressão dos tumores em animais vivos, e como caracterizar características histopatológicas e imuno-histoquímica destes tumores. Como n...

O glioblastoma multiforme (GBM) é o (60%) de tumor cerebral primário mais comum em adultos, com uma sobrevivência média de 15-21 meses, quando tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia e 1. Os novos tratamentos para GBM são imperativos. Terapias experimentais requerem testes em modelos animais que se reproduzem de forma adequada as principais características da doença humana. Estratégias para induzir GBM em roedores incluem mutagênese química com agentes alquilantes, germline ou alterações genéticas somáticas, ou transplante utilizando linhas celulares de glioma 2. Os modelos mais correntemente utilizados empregam a implantação de linhas de células de glioma, ou ortotopicamente, para dentro do cérebro ou por via subcutânea, utilizando células singeneicas em animais com genótipo idêntico; ou xenogénicas, linhas mais comumente humanos de células de GBM, implantados em camundongos 3 imunológico comprometido. Os xenoenxertos oferecem muitas vantagens para o estudo de tumores intracranianos: conveniência de reprodutibilidade, Standataxas de crescimento rdized, hora da morte e localização do tumor. No entanto, estes modelos têm limitações devido à abordagem cirúrgica artificial, invasivo utilizado para implantes e limitada capacidade de reproduzir com precisão histológico apresenta característica de GBM humano (OMS grau IV): necrose pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasão difusa, a proliferação de micro-vascular e a formação de anormalidades vasculares glomerulóides 4-7. Indução de GBM por alterar o genoma de células somáticas com ADN oncogénico, ou com vectores virais 8-12, ou com integração mediada por transposão 13, reproduz mais de perto a etiologia da doença humana e recapitula características histopatológicas de GBM humano. Historicamente, os tumores do SNC foram classificados com base na célula percebida de origem, o que foi observado, seria um fator preditivo de sobrevivência 14. GBMs são classificadas em primárias e secundárias. Emergentes evidência today aponta para a natureza altamente heterogêneo de glioblastoma 15 primário. GBM secundário (15%), o resultado da transformação maligna de astrocitoma de baixo grau (OMS grau I) e astrocytomas anaplasic (OMS grau II), estão associados com início mais precoce da doença, melhor prognóstico e um padrão de &quot;proneural&quot; da expressão gênica , enquanto que GBM primário (85%) mostram um início tardio, o prognóstico pobre e glial (clássica), neural ou padrões de expressão mesenquimais. Se estes padrões de expressão de genes correlacionam-se com a célula de origem real do tumor é ainda a ser activamente investigados. A acumulação de dados mostra que a combinação de mutações genéticas associadas com GBMs são preditivos para a sobrevivência. Por exemplo, a perda de heterozigose (LOH) de cromossomos 1p / 19q, mutações IDH1, PDGFRα ampliações, estão associados com GBMs secundárias, padrão de expressão proneural e melhor prognóstico, enquanto que a superexpressão de EGFR, Notch e Sonic hedgehog ativação da via, Nf1 e PTEN perda e mutações do p53 estão correlacionados com neural, clássica, ou GBM primário mesenquimais e pior prognóstico 16,17. O advento dos projetos de seqüenciamento em larga escala e da acumulação de numerosos espécimes de pacientes disponíveis para teste traz uma riqueza de novas informações no que diz respeito a mutações genéticas e os caminhos envolvidos na GBM patogênese e progressão ea possibilidade de medicina individualizada, onde terapias pode ser adaptado especificamente para as anormalidades genéticas do paciente. Em última análise, para avaliar o valor preditivo destas mutações e caminhos de uma forma sistemática, e para testar possíveis tratamentos para cada caso, requer modelos animais de GBM com alterações genéticas pré-determinados. Transposon integração mediada de DNA genômico oferece uma abordagem viável. O sistema transposon Bela Adormecida, membro da classe / mariner Tc1 de transposons, foi &quot;acordado&quot; (construído) em um proce multi-passoss de mutagênese sítio específico de um gene transposase salmonóide, que se tornou mais dormente de 10 milhões de anos atrás 18,19. Em essência, os transposons de ADN flanqueadas por sequências específicas (repetições invertidas / repetições directas: IR / DR) podem ser integrados no genoma de uma maneira &quot;corta e cola&quot; por meio da actividade da transposase sono de beleza. A transposase reconhece os extremos dos sites de RI, extirpa o transposão e integra aleatoriamente em um outro local de ADN entre as bases de T e A, bases que são duplicados em cada uma das extremidades do transposão durante transposição (Figura 1a). O sono transposase beleza é composta por três domínios, um domínio de ligação de transposões, uma sequência de localização nuclear e um domínio catalítico. Quatro moléculas de transposase são necessárias para aproximar as duas extremidades do transposão em conjunto e permitir a transposição, no entanto, se demasiadas moléculas de transposase estiver presente, pode dimerizar e tetramerize para inibira reacção de transposição 20. Uma reação transposição eficiente requer uma ótima relação de transposase de transposons. O ADN que codifica para a transposase pode ser entregue no mesmo plasmídeo com o transposão (em cis) ou num plasmídeo diferente (em trans). Para assegurar a relação óptima entre a transposase e os transposões, um promotor com actividade adequada pode ser escolhido para a expressão da transposase (para o modelo de &quot;cis&quot;) ou a relação de plasmídeos na solução injectável podem ser optimizados (para o modelo de &quot;trans&quot;). O sistema transposon Bela Adormecida pode ser utilizado com sucesso para a genómica funcional, mutagênese insercional, transgenia e terapia genética somática 21. Sendo uma construção sintética re-projetado para uma molécula funcional a partir de uma variante salmonóide dormente, Sleeping Beauty transposase não se liga a outros transposons em seres humanos ou outros mamíferos 20. Desde a sua descoberta, a engenharia molecular tem enhanced transposição a eficácia do sistema de transposão SB através da modificação das sequências IR e adição de dinucleótidos TATA flanqueando o transposão, resultando nos transposões PT2. Estes transposons tem otimizado ligação do SB ao site IR e aumento da eficácia da excisão. A transposase SB também passou por melhorias significativas; transposase utilizado em experiências aqui apresentadas é o SB100X, uma transposase hiperactivo gerado por uma estratégia de arranjo combinatório de ADN seguido por um rastreio genético em larga escala em células de mamífero 22. Neste relatório apresentamos um método rápido, versátil e reprodutível para induzir intrínseca GBM em camundongos com, integração mediada por transposon não-viral de DNA plasmídeo em células da zona sub-ventricular de ratos neonatal 23. Nós apresentamos uma maneira simples de criar transposons com novos genes passíveis de integração genômica usando o sono transposase Beleza e demonstrar como monitorar a captação plasmídeo eprogressão da doença usando a bioluminescência. Nós também caracterizar as características histológicas e imuno-histoquímica do GBM reproduzido com este modelo. Além disso, apresentamos um método rápido para gerar linhas de células de GBM primárias destes tumores. O modelo de beleza do sono, em que os tumores são induzidos a partir de células originais ao animal, permite a avaliação funcional do papel dos genes candidatos GBM na indução e a progressão de tumores. Este sistema também é bem adequado para o teste de tratamentos novos GBM, incluindo terapias imunológicas em ratos imuno-competentes, sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos invasivos inflamatórias, que podem alterar o microambiente local.

<table><tbody><tr><td>Padrão de Laboratório da Stoelting com Adaptadores de Rato e Mouse</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Outras empresas produzem quadros semelhantes, qualquer um deles com pequenos adaptadores de mouse são adequados&nbsp;</td></tr><tr><td>Injetor Estereotáxico Quintessencial (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>As injeções podem ser feitas sem ele, mas&nbsp; &nbsp; &nbsp; O injetor automático permite maior reprodutibilidade e conveniência</td></tr><tr><td>10 &mu; l Seringa de MICROLITRO montada à mão da série 700</td><td>Hamilton</td><td>Modelo 701</td><td>Este modelo de seringa fornecerá de 0,5 a 500 ul de solução de forma confiável. Outras agulhas (por exemplo, 5 ul, Modelo 75) também podem ser usadas</td></tr><tr><td>agulha hipodérmica de calibre 30 (1,25", 15o chanfro)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Esta agulha é ideal para perfurar a pele e o crânio de um camundongo neonatal sem a necessidade de outros procedimentos invasivos. Se ficar opaco (não entrar facilmente na pele), precisa ser substituído.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfecção</td><td>201-10G</td><td>Alíquota em pequenos volumes e manter a -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potássio</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Outras fontes de lucifierase de vaga-lume são igualmente adequadas Solução de</td></tr><tr><td>Hematoxilina, Harris</td><td>Modified Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Microscopia Eletrônica Composta</td><td>Ciências</td><td>62550-01</td><td>Para incorporar cérebros para criosseccionamento e imuno-histovhemistia</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 avançado, sem glutamina</td><td>Vida Tecnologias</td><td>12634-010</td><td>Para a cultura de neuroesferas</td></tr><tr><td>B-27&uml; Suplemento (50X), sem soro&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sem soro para a cultura de neuroesferas</td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Suplemento sem soro para a cultura de neuroesferas</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Agente anti-micoplasma para a cultura de neuroesferas</td></tr><tr><td>Humano recombinante EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Suplemento de fator de crescimento para a cultura de&nbsp; neuroesferas</td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-básico</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Suplemento de fator de crescimento para a cultura de&nbsp; neuroesferas</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Reagente de Desprendimento de Células&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Para a dissociação de neuroesferas</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Para a dissociação de tumores recém-dissecados Filtros de</td></tr> células <tr><td>de falcão tamanho de malha 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Para gerar suspensões de células únicas de neuroesferas dissociadas</td></tr><tr><td>Xilenos Grau histológico</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo Harris Hematoxilina Mercúrio livre (acidificado)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo Solução Eosyn Y (intensificada)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposon mediated integração de dna plasmídeo na zona subventricular de neonatal ratos para gerar modelos novela de glioblastoma

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Existe uma necessidade urgente de testar a contribuição de novos genes para a patogênese e progressão dos glioblastomas humanos (GBM), o tumor cerebral primário mais comum em adultos com prognóstico sombrio. Novas terapias potenciais estão surgindo rapidamente da bancada e exigem testes sistemáticos em modelos experimentais que reproduzem de perto as características salientes da doença humana. Aqui descrevemos em detalhes um método para induzir novos modelos de GBM com integração mediada por transposon de DNA plasmidial em células da zona subventricular de camundongos neonatais. Apresentamos uma maneira simples de clonar novos transposons passíveis de integração genômica usando o sistema de transposons da Bela Adormecida e ilustramos como monitorar a captação de plasmídeos e a progressão da doença usando bioluminescência, histologia e imuno-histoquímica. Também descrevemos um método para criar novas linhagens celulares primárias de GBM. Idealmente, este relatório permitirá uma maior disseminação do sistema de transposons da Bela Adormecida entre os pesquisadores de tumores cerebrais, levando a uma compreensão profunda da patogênese e progressão do GBM e ao projeto e teste oportunos de terapias eficazes para os pacientes.

Para caracterizar as alterações histopatológicas de glioblastomas induzidas-SB, ratinhos neonatais C57 / BL6 foram injectados em P1 com um plasmídeo que codifica a luciferase (pT2 / SB100x-Luc), em combinação com plasmídeos codificando os transposons com ADN oncogénico, ou seja, NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) ou um plasmídeo que codifica uma p53 curto hairpin PDGFβ e com um repórter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) em combinação com NRAS (Figura 3d).<...

Aqui descrevemos um protocolo eficiente e versátil para induzir, monitorar e analisar novos glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que absorvem o plasmídeo, transformam-se, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

O objetivo deste procedimento é criar novos modelos para glioblastomas e, eventualmente, desenvolver novas abordagens terapêuticas, induzindo a formação de glioblastomas que apresentem mutações genéticas específicas em camundongos. Isso é realizado primeiramente pela criação de plasmídeos transposônicos, codificando os genes específicos de interesse. Os próximos passos consistem em preparar os plasmídeos com um reagente de transfeção e injetá-los no ventrículo lateral de camundongos neonatos.A captação no progresso tumoral é então monitorada por luminiscência. Quando os animais apresentam sinais de maior acometimento, são sacrificados para análise histológica e imunohistoquímica. Assim, novos glioblastomas com alterações genéticas específicas são induzidos em linhagens genéticas selvagens ou com alvo genético específico.Esses tumores podem ser estudados in vivo ou utilizados in vitro para gerar novas linhagens celulares passíveis de análise bioquímica e experimentos de citotoxicidade utilizando agentes quimioterápicos. A principal vantagem dessa técnica em relação a outros métodos, como, por exemplo, injeções ortotópicas de linhagem celular de glioblastoma, é que os tumores são induzidos pela transformação maligna de células endógenas a um animal imunocompetente, por meio de alterações genéticas escolhidas de forma muito específica. Esse processo reproduz mais fielmente a etiologia da doença humana e recapitula as características histopatológicas marcantes do GBM humano.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neuro-oncologia, como quais são as mutações condutoras responsáveis por induzir diferentes tipos de glioblastoma multiforme, clássico, pré-neural, neural, em adultos ou em tumores pediátricos. As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento do GPM, uma vez que quimioterápicos novos, imunoterapias com radiação ou uma combinação desses podem ser testados relativamente rápido in vivo ou in vitro utilizando este modelo.Tive pela primeira vez a ideia deste método quando conversei com meu colega, Dr. John, da Universidade de Minnesota, que havia desenvolvido o modelo inicial de tumor cerebral utilizando a integração mediada pelo transposon Sleeping Beauty de oncogenes e um inibidor de genes supressores de tumor no DNA genômico do hospedeiro. Pensei que essa metodologia seria muito eficaz para estudar o impacto de novas mutações na progressão tumoral e auxiliar no desenvolvimento de terapias direcionadas para o câncer cerebral. Três a quatro semanas antes do experimento, monte uma gaiola de reprodução com um camundongo macho e uma fêmea, incluindo um iglu plástico colorido para enriquecer o ambiente e aumentar as chances de acasalamento. Remova o macho assim que a gravidez for confirmada e, 18 dias após a data do acasalamento, comece a monitorar a fêmea quanto ao parto.Certifique-se de que uma mãe substituta esteja disponível por volta do momento do parto. No primeiro dia pós-natal, realize as injeções intraventriculares. Prepare a solução de injeção primeiramente aliquotando 20 microlitros da mistura de DNA contendo o transposão em plasmídeos numa concentração final de 0,5 microgramas de DNA por microlitro.A seguir, adicione uma alíquota de 20 microlitros de solução de PEI à solução de DNA e deixe incubarem à temperatura ambiente por 20 minutos a uma hora, após o que a mistura deve ser armazenada em gelo. Para a agulha de injeção, acople uma seringa de 10 microlitros a uma agulha hipodérmica de 30 graus, biselada a 12,5 graus. Em seguida, conecte a seringa a uma bomba micro com injeção automática.Teste a montagem com 10 microlitros de água e certifique-se de esvaziar a seringa. Agora, resfrie o estereotáxico para neonatos com uma mistura de gelo seco e álcool. Quando estiver resfriado entre dois e oito graus Celsius, prossiga com as injeções.Primeiro, anestesie uma ninhada colocando-a sobre gelo por dois minutos. Enquanto a ninhada estiver sobre o gelo, carregue a seringa com a solução de injeção. Após a anestesia, transfira a ninhada para o suporte e imobilize sua cabeça entre as hastes auriculares cobertas com gaze.Verifique se o lado dorsal do crânio está horizontal e paralelo à superfície do quadro. Além disso, as suturas cranianas devem estar claramente visíveis. Se a cabeça da ninhada não estiver imobilizada com firmeza suficiente, ela se moverá durante a injeção.Por outro lado, se for pressionado com muita força entre as hastes auriculares do suporte, o lâmbda não será visível e a pressão dentro da cabeça forçará a solução injetada a vazar. Com o filhote firmemente segurado pelo suporte, limpe a cabeça com etanol 70%, em seguida abaixe a agulha e ajuste sua posição para que toque o lâmbda. Depois, levante a agulha e mova-a 0,8 milímetros lateralmente e 1,5 milímetros caudalmente. Em seguida, abaixe-a novamente até que levevemente afunde a pele.Registre as coordenadas dessa posição. Em seguida, abaixe a agulha 1,5 milímetros através da pele e do crânio, até a córtex no ventrículo lateral. Injete 0,75 µL durante 90 segundos e aguarde um minuto para permitir a dispersão da solução enquanto espera.O próximo filhote a ser injetado pode ser anestesiado. Após a pesagem, levante lentamente a agulha e, em seguida, transfira o filhote para um local de recuperação sob uma lâmpada de aquecimento. O tempo entre a anestesia e o aquecimento deve ser inferior a 10 minutos.Mais rápido é melhor para monitorar sua respiração, e se necessário, massageie suavemente os membros para estimular a respiração. Uma vez que o filhote esteja aquecido, com coloração rosada e respiração regular, devolva-o à sua mãe. Isso geralmente leva de cinco a sete minutos a partir da injeção.Se vários filhotes forem injetados, todos devem ser recuperados antes de devolvê-los à mãe. Se após meia hora todos os filhotes ainda não estiverem prontos, devolva metade deles à mãe e, posteriormente, devolva o restante ao final do procedimento, monitorando a fêmea. Após devolver os filhotes.Se ela não responder aos filhotes, adicione a mãe substituta à gaiola. De 24 a 72 horas após a injeção, monitore a captação do plasmídeo e transfira todos os filhotes para placas de cultura de tecidos de seis poços, colocando um filhote por poço. Em seguida, preencha uma seringa de um mililitro com 30 miligramas por mililitro de Lucifer em solução salina ou PBS e acople uma agulha hipodérmica de 30 graus.Injete 30 microlitros de solução subcutaneamente entre as escápulas de cada filhote para evitar lesões; injete a solução sob uma pequena prega de pele. Transfira imediatamente os filhotes para um sistema de imagem de bioluminescência in vivo. Configure uma sequência para adquirir quatro imagens consecutivas em intervalos de um minuto, com exposição automática, grande abertura e diafragma de um.Após cerca de 17 dias, os animais podem começar a formar tumores macroscópicos detectáveis por bioluminescência e histologia. Pode levar até seis semanas para monitorar os tumores. Injete 100 microlitros de solução de luciferina por via intraperitoneal com uma agulha de 26 gauge.Após três minutos, anestesie os animais em uma câmara de anestesia com óxido de flúor ISO e coloque os animais na câmara de imagem equipada com cones para dispersar o óxido de flúor ISO. Adquira uma série de seis imagens em intervalos de dois minutos com tempo de exposição automático, binning médio e abertura de diafragma (F-stop) aberta de um. A região de interesse é tipicamente uma oval sobre a cabeça; meça a intensidade da luminescência em cada animal utilizando as mesmas configurações para caracterizar as características histopatológicas de glioblastomas induzidos por SB.Camundongos neonatos C57 black six foram injetados no dia P1 com um plasmídeo e luciferase revestida em combinação com plasmídeos de NRA S e SV40 grande T, transposons com DNA oncogênico. Alternativamente, um plasmídeo que codifica um curtíssimo hairpin P53 com PDGF beta e um repórter GFP foi injetado em combinação com NRAS. Necrose pseudo-palisádica era evidente, assim como perivascular e difusa no cérebro.Glioblastomas parenquimatosos também foram monitorados com bioluminescência. Os animais geralmente sucumbem devido à carga tumoral. Quando a luminiscência atingia uma intensidade de 10 à sétima a 10 à nona unidades calibradas.A sobrevida mediana dos animais dependia previsivelmente das combinações de transposons oncogênicos injetados no cérebro neonatal. Os tumores mais agressivos foram induzidos com NRS e o antígeno grande T do SV40; tumores de novo foram caracterizados pela expressão de moléculas características. Tumores incipientes feitos para expressar GFP, induzidos com SHP53 e nras, expressavam o marcador de células-tronco neurais nestina, e alguns também expressavam a proteína ácida fibrilar glial.Após 56 dias, um tumor foi encontrado cercado por numerosos astrócitos positivos para GFAP. Essas células tumorais expressavam nein, mas não GFAP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir a formação de glioblastomas, portadores de mutações genéticas específicas, por meio de injeções intraventriculares em camundongos neonatos, e de como monitorar a progressão da doença com bioluminescência.No artigo, você encontrará detalhes sobre como clonar facilmente um novo plasmídeo trans pro, codificando genes de interesse, e também sobre como monitorar os tumores e analisá-los por meio de histologia e imuno-histoquímica. Além disso, você encontrará um método detalhado sobre como gerar novas linhagens celulares de glioblastoma a partir de animais com tumores geneticamente modificados. Esperamos que este artigo ajude a acelerar a descoberta de novas terapias para esta doença humana devastadora.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve uma técnica eficiente para induzir glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que captam o plasmídeo, se transformam, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Indução de glioblastoma usando transposição mediada por SB: uma técnica para gerar um novo modelo de camundongo usando integração mediada por transposon do plasmídeo SB no cérebro de camundongo neonatal

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.

Modelando Tumores Cerebrais In Vivo Usando a Liberação Eletroporada de DNA Plasmidial Representando Assinaturas de Mutação de Pacientes

Sepse se refere a uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica resultante de uma infecção microbiana, e pode ser simulado por uma técnica cirúrgica chamada ligadura e perfuração cecal (CLP). Aqui nós descrevemos um método para usar CLP-induzida modelo animal para a tela ervas medicinais para agentes terapêuticos.

Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Aprenda a induzir glioblastomas com mutações genéticas específicas em camundongos neonatais usando plasmídeos transposon. Este método permite monitorar a progressão tumoral por bioluminescência e analisar características histopatológicas.

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

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