Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

O objetivo deste procedimento é criar novos modelos para glioblastomas e, finalmente, desenvolver novas abordagens terapêuticas, induzindo a formação de glioblastomas que abrigam mutações genéticas específicas em camundongos. Isso é feito primeiro criando plasmídeos de transposon, codificando os genes específicos de interesse. Os próximos passos são preparar os plasmídeos com um reagente de transfecção e injetá-los no ventrículo lateral de camundongos neonatais.

A captação na progressão do tumor é então monitorada por luminescência. Quando os animais se tornam mais abundantes, eles são sacrificados para análise histológica e imuno-histoquímica. Assim, novos glioblastomas com alterações genéticas específicas são induzidos em tipos selvagens ou fundos genéticos alvo.

Esses tumores podem ser estudados in vivo ou usados in vitro para gerar novas linhagens celulares passíveis de análises bioquímicas e experimentos de citotoxicidade usando agentes quimioterápicos. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como por exemplo, injeções ortotópicas de linhagem celular de glioblastoma, é que os tumores são induzidos pela transformação maligna de células endógenas a um animal imunocompetente usando alterações genéticas que são escolhidas de forma muito específica. Esse processo reproduz a etiologia da doença humana mais de perto e recapitula as características histopatológicas salientes do GBM humano.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuro-oncologia, como quais são as mutações condutoras responsáveis pela indução de diferentes tipos de glioblastoma multiforme, clássico, pré-neural, neural em adultos ou em tumores pediátricos. As implicações desta técnica se estendem à terapia de GPM desde novos quimioterápicos. As terapias imunológicas por radiação ou uma combinação delas podem ser testadas de forma relativamente rápida in vivo ou in vitro usando este modelo.

Tive a ideia desse método pela primeira vez quando discuti com meu colega, Dr. John, da Universidade de Minnesota, que desenvolveu o modelo inicial de tumor cerebral usando a bela adormecida transpõe a integração mediada de oncogenes, um inibidor de genes supressores de tumor no DNA genômico do hospedeiro. Achei que essa metodologia seria muito poderosa para estudar o impacto de novas mutações na progressão do tumor e ajudar no desenvolvimento de terapias direcionadas para câncer cerebral Três a quatro semanas antes do experimento, montar uma gaiola de reprodução de camundongos com um macho e uma fêmea, incluir um iglu de plástico colorido para enriquecer o ambiente e aumentar as chances de acasalamento. Remova o macho assim que a gravidez for confirmada e, 18 dias após o dia do acasalamento, comece a monitorar a fêmea para o parto.

Certifique-se de que uma mãe de aluguel esteja disponível no momento do parto. No primeiro dia pós-natal, realize as injeções intraventriculares. Prepare a solução de injeção primeiro Ali, citando 20 microlitros da mistura de DNA contendo a transposição em plasmídeos a uma concentração final de 0,5 microgramas de DNA por microlitro.

Em seguida, em uma alíquota de 20 microlitros de solução de PEI para a solução de DNA e deixe-os incubar em temperatura ambiente por 20 minutos a uma hora, após o que a mistura deve ser armazenada em gelo. Para a agulha de injeção, conecte uma seringa de 10 microlitros a uma agulha hipodérmica de calibre 30, chanfrada a 12,5 graus. Em seguida, conecte a seringa a uma microbomba com injeção automática.

Teste a configuração com 10 microlitros de água e certifique-se de esvaziar a seringa. Agora, resfrie o estágio estereotáxico neonatal com uma pasta de gelo seco e álcool. Quando estiver resfriado entre dois e oito graus Celsius, prossiga com as injeções.

Primeiro, anestesie um filhote colocando-o no gelo por dois minutos. Enquanto o filhote estiver no gelo, carregue a seringa com a solução injetável. Uma vez anestesiado, transfira o filhote para a armação e imobilize sua cabeça entre as barras auriculares cobertas de gaze.

Verifique se o lado dorsal do crânio é horizontal e paralelo à superfície da armação. Além disso, as suturas cranianas devem ser claramente visíveis. Se a cabeça do filhote não for imobilizada com firmeza suficiente, ela se moverá durante a injeção.

Considerando que, se for espremido com muita firmeza entre as barras auriculares da armação, o lambda não será visível e a pressão dentro da cabeça forçará a solução injetada a vazar Com o filhote agarrado firmemente pela armação, limpe a cabeça com etanol a 70%, abaixe a agulha e ajuste sua posição para que entre em contato com o lambda. Em seguida, levante a agulha e mova-a 0,8 milímetros lateralmente e 1,5 milímetros de contagem. Em seguida, abaixe-o novamente até que faça covinhas leves na pele.

Registre as coordenadas desta posição. Em seguida, abaixe a agulha, 1,5 milímetros através da pele e do crânio e no córtex no ventrículo lateral. Injete 0,75 microlitros durante 90 segundos e aguarde um minuto para que a solução se disperse enquanto espera.

O próximo filhote a ser injetado pode ser anestesiado. Após o peso, levante lentamente a agulha e transfira o filhote para um local de recuperação sob uma lâmpada de aquecimento. O tempo desde a anestesia até o aquecimento deve ser inferior a 10 minutos.

Quanto mais rápido, melhor monitore sua respiração e, se necessário, esfregue suavemente os membros para estimular a respiração. Assim que o filhote estiver aquecido, tiver uma cor rosada e respiração constante, devolva-o à mãe. Isso geralmente leva de cinco a sete minutos a partir da injeção.

Se vários filhotes forem injetados, todos devem ser recuperados antes de devolvê-los à mãe. Se depois de meia hora todos os filhotes não estiverem prontos, devolva metade deles para ela e devolva o restante mais tarde, no final do procedimento, monitore a barragem. Depois de devolver os filhotes.

Se ela não responder aos filhotes, adicione a mãe substituta à gaiola. 24 a 72 horas após a injeção, monitore a captação do plasmídeo e transfira todos os filhotes para seis placas de cultura de tecidos, um filhote por poço. Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro com 30 miligramas por mililitro de Lúcifer em solução salina ou PBS e conecte uma agulha hipodérmica de calibre 30

Injete 30 microlitros de solução por via subcutânea entre as omoplatas de cada filhote para evitar ferir o filhote, injete a solução sob uma pequena dobra de pele. Transfira imediatamente os filhotes para um sistema de imagem de bioluminescência in vivo. Configure uma sequência para adquirir quatro imagens consecutivas em intervalos de um minuto com exposição automática, grande benning e uma abertura de um. Posterior.

Após cerca de 17 dias, os animais podem começar a formar tumores macroscópicos detectáveis por bioluminescência e histologia. Também pode levar até seis semanas para monitorar os tumores. Injete 100 microlitros de solução luciferiana intraperitoneal com uma agulha de calibre 26.

Após três minutos, anestesiar os animais em uma câmara de anestesia com oxigênio e flúor ISO e colocá-los na câmara de imagem equipada com cones para dispersar o flúor ISO. Adquira uma série de seis imagens em intervalos de dois minutos com um tempo de exposição automático, binning médio e um F-stop de abertura de um. A região de interesse é tipicamente um oval sobre a cabeça, medindo a intensidade de luminescência em cada animal usando as mesmas configurações para caracterizar as características histopatológicas dos glioblastomas induzidos por SB.

C 57 camundongos neonatais pretos seis foram injetados em P um com um plasmídeo e luciferase de revestimento em combinação com NRA S e SV 40 grandes plasmídeos T Inod transposons com DNA oncogênico. Alternativamente, um plasmídeo que codifica um grampo curto P 53 com PDGF beta e um repórter GFP foi injetado em combinação com NRAS. A necrose do pseudo palis era evidente, assim como a perivascular e difusa no cérebro.

Os glioblastomas do parênquima também foram monitorados com bioluminescência. Os animais geralmente sucumbem à carga tumoral. Quando a luminescência atingiu uma intensidade de 10 elevado à sétima a 10 elevado à nona unidades calibradas.

A sobrevida média dos animais foi previsivelmente dependente das combinações de transposons oncogênicos injetados no cérebro neonatal. Os tumores mais agressivos foram induzidos com NRS e SV 40, os grandes tumores de antígeno T de novo foram caracterizados por sua expressão de moléculas características. Tumores nascentes feitos para expressar GFP induzidos com SHP 53 e nras expressaram o marcador de células-tronco neurais neston, e alguns também expressaram proteína glio fibrilar ácida.

Após 56 dias, um tumor foi encontrado cercado por numerosos astrócitos positivos para GFAP. Essas células tumorais expressaram nein, mas não GFAP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a formação de glioblastomas, abrigando mutações genéticas específicas por meio de injeções intraventriculares em camundongos neonatais, e como monitorar a progressão da doença com bioluminescência.

No artigo, você encontrará detalhes sobre como clonar facilmente novos plasmídeos trans pro, codificando genes de interesse, e também como monitorar os tumores e analisá-los com histologia e imuno-histoquímica. Além disso, você encontrará um método detalhado sobre como gerar novas linhagens de células de glioblastoma a partir de animais com tumores geneticamente modificados. Esperamos que este artigo ajude a acelerar a descoberta de novas terapias para esta doença humana devastadora.